Summary
Uso de luminescência de Cerenkov Imaging (CLI) para monitorar o tratamento de câncer pré-clínico é descrito aqui. Este método tira vantagem da radiação Cerenkov (CR) e imagiologia óptica (OI) para visualizar sondas marcadas radioactivamente e, assim, fornece uma alternativa ao PET na monitorização terapêutica pré-clínica e triagem de drogas.
Abstract
Em imagiologia molecular, positron emission tomography (PET) e imagiologia óptica (OI) são duas das modalidades mais importantes e, portanto, mais amplamente utilizado 1-3. PET é caracterizado pela sua excelente sensibilidade e capacidade de quantificação, enquanto OI é notável para a radiação de não-, relativo baixo custo, o tempo de verificação de curto, com rendimento elevado, e a disponibilidade de largura de pesquisadores básicos. No entanto, ambas as modalidades têm suas deficiências também. PET sofre de resolução espacial pobre e de custo elevado, enquanto que a OI é principalmente limitada a aplicações pré-clínicos devido à sua penetração nos tecidos limitada, juntamente com os sinais de espalhamento proeminentes ópticas através da espessura de tecidos vivos.
Recentemente, uma ponte entre o PET e OI surgiu com a descoberta de luminescência de Cerenkov Imaging (CLI) 4-6. CLI é uma nova modalidade de imagem que utiliza radiação de Cerenkov (CR) para radionuclídeos de imagem com instrumentos OI. Nobel russo laurEATE Alekseyevich Cerenkov e seus colegas originalmente descoberto CR em 1934. É uma forma de radiação electromagnética emitida quando uma partícula carregada viaja a uma velocidade superluminal num meio dieléctrico 7,8. A partícula carregada, se pósitron ou elétron, perturba o campo eletromagnético do meio, deslocando os elétrons em seus átomos. Depois de passar dos fótons de ruptura são emitidos como os elétrons deslocados retornar ao estado fundamental. Por exemplo, um decaimento F 18 foi estimada para produzir uma média de 3 fotões em água 5.
Desde o seu aparecimento, CLI tem sido investigada para o seu uso numa grande variedade de aplicações, incluindo pré-clínicos em imagiologia de tumores in vivo, do gene repórter de imagem, radiofármaco desenvolvimento, multimodalidade de imagem, entre outros 4,5,9,10,11. A razão mais importante pela qual CLI tem desfrutado de muito sucesso até agora é que esta nova tecnologia aproveita o co baixoº e ampla disponibilidade de OI para radionuclídeos de imagem, que costumavam ser fotografada apenas pelo mais caro e menos disponível modalidades de imagens nucleares, tais como PET.
Aqui, apresentamos o método de usar CLI para monitorar câncer de terapia medicamentosa. Nosso grupo foi recentemente investigado esta nova aplicação e validada a sua viabilidade através de um estudo de prova de conceito-12. Nós demonstramos que a CLI e PET apresentaram excelentes correlações através de xenotransplantes tumorais diferentes e sondas de imagem. Isto é consistente com o princípio fundamental da CR que CLI essencialmente visualiza os radionuclídeos mesmas PET. Foram selecionados Bevacizumab (Avastin, Genentech / Roche) como o agente terapêutico porque é um inibidor da angiogénese bem conhecido 13,14. Maturação desta tecnologia no futuro próximo pode ser vislumbrada a ter um impacto significativo no desenvolvimento de medicamentos pré-clínico, triagem, bem como a monitorização terapêutica de pacientes que recebem tratamentos.
Protocol
1. Modelo de Tumor
- Cultura de células H460 (American Type Culture Collection) em meio RPMI 1640 suplementado com 10% de soro fetal bovino e 1% de penicilina / estreptomicina (Invitrogen Life Technologies). Deve notar-se que as escolhas de linhas celulares, meios de cultura, os locais de inoculação, o número de xenoenxertos por rato, e outras considerações são todos de ser adaptado para os objectivos de um determinado estudo. Aqui vamos apresentar apenas um projeto de projeto específico para servir como uma ilustração.
- Manter as linhas de células numa atmosfera humidificada de 5% de CO2 a 37 ° C e de mudança para meio fresco todos os dias.
- Quando uma monocamada confluente a 75% das células é formada, separar a monocamada com tripsina e dissociam-se as células numa suspensão de células individuais para a cultura da célula.
- Suspender a cerca de 1 x 10 6 células H460 em tampão fosfato salino (PBS; Invitrogen) e o implante por via subcutânea emombros esquerdo e direito de ratinhos nus do sexo feminino (ratinhos nus atímicos (nu / nu), 4 - 6 semanas de idade, Charles River Laboratories, Inc.).
- Permitir o crescimento dos tumores de 150-200 mm 3. Demora cerca de 2 semanas para xenoenxertos de tumores H460 a crescer a este tamanho. Padrão paquímetro medição é realizada para acompanhar os tamanhos tumorais.
- Quando os tumores atingem o tamanho ideal os ratos portadores do tumor está agora pronto para o tratamento in vivo e imagiologia por PET e CLI.
2. PET
- Realizar os estudos de PET de acordo com esse cronograma ou qualquer variação do mesmo, dependendo do projeto específico (Figura 1) 12. Um certo número de factores podem influenciar o desenho da agenda, incluindo, mas não limitado a, a escolha de linhas de xenoenxertos de células de tumor, fármacos anti-cancerígenos, e regimes de dosagem. Aqui vamos apenas apresentar um cronograma de imagem específico. Os estudos da CLI devem ser realizadas de acordo com omesmo esquema como os dos estudos de PET, com CLI realizada imediatamente após o PET correspondente. Deve ser também notado aqui que o objectivo dos estudos de PET-se principalmente para a validação dos resultados de CLI. Para usuários comuns, que só querem usar instrumentos OI para testes de imagem radiomarcados, não PET é necessário. No entanto, se faz uma validação PET desejo deve sublinhar-se que os instrumentos de PET e CLI deve ser localizada dentro de uma proximidade muito estreita para a validação para ser bem sucedido por causa da meia-vida curta de 18 F (109,77 min).
- Divida ratos em grupos de tratamento e controle (n ≥ 3 cada). Tratar os ratos no grupo de tratamento com 2 injecções de bevacizumab de 20 mg / kg nos dias 0 e 2. Dia 0 é definido pela primeira injecção. Note-se que no dia -1 um pré-scan deve ser realizada através de PET e CLI.
- Pequenos animais PET de ratos portadores de tumores é para ser realizado com um aparelho de modelo de roedor R4 (Siemens Medical Solutions EUAA Inc.,).
- Anestesiar os ratos com 2% de isoflurano (Aerrane, Baxter) e injectar com 3'-desoxi-3'-18 F-fluorotimidina (18 F-FLT; 7,3-8,0 MBq [198-215 | iCi]) através da veia da cauda. A sonda de PET deve ser diluído em PBS antes da injecção.
- Depois de 1 hora, anestesiar ratos e coloque novamente anestesiados ratos propensos e próximo do centro do campo de visão do scanner PET pequenos animais.
- Obter três minutos exames estáticos e reconstruir as imagens por um 2-dimensional algoritmo de máxima ordenada subconjuntos expectativa. Correção de fundo não é necessário.
- Desenhe regiões de interesse (ROIs; 5 pixels para cortes coronais e transaxial) nos tumores no decaimento-corrigidas de corpo inteiro imagens coronais. Obter as contagens máximas por pixel por minuto a partir da ROIs e converter em unidades de contagem por mililitro por minuto por utilização de uma constante de calibração. Com o pressuposto de uma densidade de tecido de 1 g / ml, para converter o ROIs contagenspor grama por minuto. Determinar ROI imagem derivados% ID / g valores dividindo contagens por grama por minuto pelo dose injectada. Correção de atenuação não é necessário.
3. CLI
- CLI é para ser realizado com um sistema IVIS Spectrum (Caliper Life Sciences). A aquisição e análise de imagens são para ser efectuados utilizando Vivo Imagem 3.0 software (Caliper Life Sciences). Wavelength-resolved imagem espectral é para ser realizado utilizando um conjunto de 18 de emissão de banda estreita do filtro (490-850 nm). Mais uma vez, para cada rato, imediatamente depois de executar CLI PET para minimizar a quantidade de decaimento radioactivo se os estudos de PET são incluídos no protocolo.
- Coloque os animais em uma câmara à prova de luz com anestesia isoflurano. Ratinhos múltiplos podem ser colocados simultaneamente para aumentar o rendimento.
- Aquisição de imagens utilizando o tempo de exposição 3 min (f / stop = 1 binning, = 4). Use as configurações de iluminação mesmo (tensão da lâmpada, filtros, f / stop, campos de visão, binning) para adquirir todas as imagens. Usar a área da pele dorsal para calcular a intensidade do sinal do tecido de fundo. Normalizar emissão de fluorescência de fótons por segundo por centímetro quadrado por esterradiano (p / s / cm 2 / sr).
4. Resultados representativos
Comparação visual entre CLI e imagens de PET podem ser facilmente realizados. Após a barra de unificar escala através de imagens da mesma modalidade e local CLI e PET imagens lado a lado, uma pode ver neste painel representativo (Figura 2A) que tanto CLI e PET revelou sinais diminuiu significativamente de H460 xenoenxertos em camundongos tratados de pré-tratamento ao dia 3, o que sugere efeito terapêutico significativo. Como comparação, moderadamente aumentado de sinais inalterados foram observados em ratinhos não tratados, durante o mesmo período de tempo (dados não mostrados). Por inspecção visual sozinho pode-se observar que existe uma boa consistência entre contrastes tumorais que são visualzada de CLI e PET. Na verdade, essa correlação visual tem resolução suficiente para mostrar necrose central do tumor secundário para o regime de tratamento anticâncer (por favor, comparar o CLI e imagens de PET a partir do dia 3). Para validar os resultados das quantificações de imagem e análise de correlação pode ser realizada.
Quantificações de CLI e imagens de PET e uma montagem simples através de regressão linear mostrou que as duas modalidades de facto tinha uma excelente correlação (Figura 2B, R 2 = 0,9309 durante 18 F-FLT sondado grupo de tratamento). Notavelmente, em todos os nossos CLI e estudos de imagem PET com diferentes modelos de tumores e de diferentes fármacos anticancerígenos as inclinações das convulsões são também extremamente estreita, sugerindo assim uma excelente combinação de regressão linear mesmo de todos os dados são conglomerados (dados não mostrados). Ambas as imagens representativas são adaptados a partir de nossa publicação anterior 12.
er.within-page = "always"> 
Figura 1. Esquemática do delineamento experimental de estudos de PET e CLI. Os tumores foram implantados bilateralmente na região do ombro e deixadas a crescer até 150-200 mm 3, e ratos portadores de tumor foram submetidos a imagiologia in vivo por meio de PET e CLI no dia -1, 1 e 3. Bevacizumab tratamento foi realizado por duas injecções de 20 mg / kg nos dias 0 e 2.
Figura 2. (A) In vivo CLI e imagens PET de ratinhos portadores de xenoenxertos H460 tratadas com Bevacizumab antes do tratamento (pré-scan) e após o tratamento (dia 3). (B) análise quantitativa correspondente da CLI e PET resultados (n = 3) e os seus correlações. Imagens adaptada a partir de (6).arge.jpg "target =" _blank "> Clique aqui para ver maior figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
CLI está emergindo como uma técnica de imagem molecular promissor que tem encontrado em muitos potenciais aplicações das ciências básicas de pesquisa e até mesmo o uso clínico 4,5,15,16,17. As principais vantagens do CLI mais tradicionais modalidades de imagens nucleares, tais como tronco a partir de PET da utilização de instrumentos OI, que são mais fáceis de usar, caracterizados por tempo de aquisição curto e alta taxa de transferência, significativamente menos caras, e mais amplamente disponível para pesquisadores. Além disso, o que define CLI para além da OI, em geral, é o uso de β-emissores de moléculas marcadas como testes de imagem, muitos dos quais foram aprovados pela Food and Drug Administration (FDA), ao contrário dos tradicionais agentes OI. Com essas qualidades únicas e desejável, CLI, rapidamente chamou a atenção do campo de imagem molecular. No entanto, as suas potencialidades em aplicações pré-clínicos e clínicos estão ainda a ser investigada.
Monitorização de terapia do cancro é uma das áreasonde CLI pode ter alguma utilidade significativa. É uma área muito importante que é a chave para o desenvolvimento da sonda, a seleção da droga, e terapia de câncer, mesmo adaptando para os pacientes. Atualmente, a terapia do câncer de monitoramento pré-clínico é realizado quase que exclusivamente através de modalidades de imagens nucleares, tais como PET. Portanto CLI fornece uma alternativa muito atraente para o PET, sobretudo tendo em conta que há uma excelente correlação entre as imagens do CLI e PET. Ainda, uma outra vantagem da CLI para monitorização terapêutica reside no fato de que pode CLI imagem não só β +-emissores, mas também β - emissores, tais como 32 P, 90 Y e 131 I, todos os quais são clinicamente relevantes.
No entanto, CLI não é sem falhas. A confiança na OI instrumentos dita que CLI sofre de algumas deficiências que são intrínsecas a imagem óptica, tais como a atenuação do sinal e espalhamento em tecidos vivos. Além disso, o espectro particular deCR também resulta em intensidade de sinal limitado e, subsequentemente, mais profundo o sinal a partir da superfície do corpo, a menor sensibilidade a, e pior capacidade de quantificação 6. No entanto, enquanto as lacunas podem ser vistos a ser significativo, uma grande parte pode ignorar esses obstáculos em pesquisa pré-clínica, empregando pequenos animais, como ratos. Mais importante, há pelo menos um par de áreas clínicas que podem potencialmente beneficiar CLI monitoramento terapia do câncer. Monitorização entidades de doença superficial tais como condições inflamatórias dermatológicas e cancro pode servir como um bom exemplo. Além disso, as entidades de doença que são profundos mas acessível pelo dispositivo de carga acoplada ou de fibra óptica baseados em técnicas podem utilizar o excelente sensibilidade e capacidade de quantificação de CLI também. Ainda outra possibilidade interessante está no uso de CLI para ajudar cirurgiões obter informações anatômicas e funcionais sobre tumores na sala de cirurgia. Dois recente prova-de-conceito stumorre demonstraram detecção e ressecção de tumores em camundongos com imagem graças intra-operatórias de orientação para CLI 18,19.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Não há conflitos de interesse declarados.
Acknowledgments
Reconhecemos o apoio do Instituto Nacional do Câncer (NCI) R01 CA128908 e Stanford Medical Research Scholar Fellowship. Nenhum outro conflito potencial de interesse relevante para este artigo foi relatado.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| H460 Cell Line | American Type Culture Collection | ATCC Number: HTB-177 | |
| RPMI 1640 Medium | Invitrogen Life Technologies | 12633-012 | |
| Fetal Bovine Serum | Invitrogen Life Technologies | 10091-148 | |
| Penicillin/Streptomycin | Invitrogen Life Technologies | 15640-055 | |
| Phosphate-Buffered Saline | Invitrogen Life Technologies | 10010-023 | |
| Female Athymic Nude Mice | Charles River Laboratories, Inc. | Strain Code: 088 | |
| Bevacizumab (Avastin) | Genentech/Roche | N/A | |
| MicroPET Rodent R4 | Siemens Medical Solutions USA, Inc. | N/A | |
| Isoflurane (Aerrane) | Baxter | Baxter Number: AHN3637 | |
| IVIS Spectrum | Caliper Life Sciences | N/A |
References
- Weissleder, R., Mahmood, U. Molecular imaging. Radiology. 219 (2), 316 (2001).
- Chen, K., Chen, X. Positron emission tomography imaging of cancer biology: current status and future prospects. Semin. Oncol. 38 (1), 70 (2011).
- Solomon, M., Liu, Y., Berezin, M. Y., et al. Optical imaging in cancer research: basic principles, tumor detection, and therapeutic monitoring. Med. Princ. Pract. 20 (5), 397 (2011).
- Liu, H., Ren, G., Miao, Z., et al. Molecular Optical Imaging with Radioactive Probes. PLoS One. 5 (3), e9470 (2010).
- Robertson, R., Germanos, M. S., Li, C., et al. Optical imaging of Cerenkov light generation from positron-emitting radiotracers. Phys. Med. Biol. 54 (16), N355 (2009).
- Xu, Y., Liu, H., Cheng, Z. Harnessing the power of radionuclides for optical imaging: Cerenkov luminescence imaging. J. Nucl. Med. 52 (12), 2009 (2011).
- Cerenkov, P. Visible emission of clean liquids by action of g-radiation. Dokl Akad Nauk SSSR. 2, 451 (1934).
- Cerenkov, P. A. Visible radiation produced by electrons moving in a medium with velocities exceeding that of light. Phys Rev. 52 (4), 0378 (1937).
- Boschi, F., Calderan, L., D'Ambrosio, D., et al. In vivo 18F-FDG tumour uptake measurements in small animals using Cerenkov radiation. Eur. J. Nucl. Med. Mol. Imaging. 38 (1), 120 (2011).
- Liu, H., Ren, G., Liu, S., et al. Optical imaging of reporter gene expression using a positron-emission-tomography probe. J. Biomed. Opt. 15 (6), 060505 (2010).
- Park, J. C., Yu, M. K., An, G. I., et al. Facile preparation of a hybrid nanoprobe for triple-modality optical/PET/MR imaging. Small. 6 (24), 2863 (2010).
- Xu, Y., Chang, E., Liu, H., et al. Proof-of-concept study of monitoring cancer drug therapy with cerenkov luminescence imaging. J. Nucl. Med. 53 (2), 312 (2012).
- Ellis, L. M. Bevacizumab. Nat. Rev. Drug Discov. , Suppl S8. (2005).
- Hochster, H. S. Bevacizumab in combination with chemotherapy: first-line treatment of patients with metastatic colorectal cancer. Semin. Oncol. 33, Suppl 5 . 10. (2006).
- Dothager, R. S., Goiffon, R. J., Jackson, E., et al. Cerenkov radiation energy transfer (CRET) imaging: a novel method for optical imaging of PET isotopes in biological systems. PLoS One. 5 (10), e13300 (2010).
- Hu, Z., Liang, J., Yang, W., et al. Experimental Cerenkov luminescence tomography of the mouse model with SPECT imaging validation. Opt. Express. 18 (24), 24441 (2010).
- Park, J. C., Il An, G., Park, S. I., et al. Luminescence imaging using radionuclides: a potential application in molecular imaging. Nucl. Med. Biol. 38 (3), 321 (2011).
- Holland, J. P., Normand, G., Ruggiero, A., et al. Intraoperative imaging of positron emission tomographic radiotracers using Cerenkov luminescence emissions. Mol. Imaging. 10 (3), 177 (2011).
- Intraoperative imaging of tumors using Cerenkov luminescence endoscopy: a feasibility experimental study. J. Nucl. Med. Liu, H., Carpenter, C. M., Jiang, H., et al. , (2012).
