Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

ניתוח גנטי מהיר של איתות אפיתל-mesenchymal במהלך התחדשות שיער

Published: February 28, 2013 doi: 10.3791/4344
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1
1Program in Epithelial Biology, Stanford University School of Medicine
* These authors contributed equally

Summary

ניתוח רקמות ספציפית של מודל התחדשות זקיקי שיער באמצעות lentivirus לתווך רווח או פסד--of-פונקציה.

Abstract

המורפוגנזה שיער זקיק, תהליך מורכב הדורש אינטראקציה בין הקרטינוציטים epithelia נגזרות וmesenchyme הבסיסי, היא מערכת מודל אטרקטיבית ללמוד פיתוח איברים ורקמות איתות ספציפית. למרות התפתחות זקיק שיער היא ניתוח גנטי צייתן, מהיר ושחזור של גורמים חיוניים לתהליך זה עדיין מהווה אתגר. כאן אנו מתארים הליך כדי להפיק ביטוי יתר ממוקד או מציאת shRNA בתיווך של גורמים באמצעות lentivirus באופן רקמות ספציפי. שימוש בגרסה שונה של מודל התחדשות שיער 5, 6, 11, אנחנו יכולים להשיג רווח או חזק ניתוח אובדן-of-פונקציה בהקרטינוציטים עכבר עיקריים או תאי עור כדי להקל על מחקר של מסלולי אפיתל-mesenchymal איתות שמובילים להמורפוגנזה זקיק שיער . אנו מתארים כיצד לבודד הקרטינוציטים טריים עיקריים עכברים ותאי עור, המכילים תאי פטמית עור ובין קודמיהם, לספק lentivirus contaiנינג או shRNA או cDNA לאחת מאוכלוסיות התאים, ולשלב את התאים לייצר זקיקי שיער שנוצרו באופן מלא על גבם של עכברים בעירום. גישה זו מאפשרת ניתוח של גורמי רקמה ספציפיות הנדרשים ליצירת זקיקי שיער בתוך שלושה שבועות ומספקת לוויה מהירה ונוחה למודלים גנטיים קיימים.

Protocol

1. הכן 0-2 ימי עכברים ילודים ישנים לנתיחת עור

  1. להרדים גורי עכבר באמצעות 2 קאמריים CO לפחות 20 דקות. השאר גורים על קרח עד שעה עד לנתיחה. עכברי P0-P2 מומלצים מאוד כפי שהוכנו מתאי עכברים מבוגרים להיות נמוכים מוליד כי תוצאות השתלת תשואות נמוכות יותר. הכן צלחת אחת של אתנול 70% (לצעד 1.3) ושלוש מנות של תמיסת שטיפה (לשלב 3) כאשר מוכן לבצע נתיחת עור. הפשר פתרון Dispase ולהשאיר אותה ב 4 ° C. צוואר רחם נקוע גורים לאחר חשיפת יתר 2 CO כדי להבטיח המתת חסד.
  2. הנח גורים מורדמים בצלחת תרבות על קרח והעברה למכסת מנוע זרימת סטרילי.
  3. שטוף את הגורים על ידי טבילה קצרה באתנול 70% ומקום על צלחת תרבות סטרילי.

2. לנתח עור של עכבר

  1. לחתוך כל איבר וזנב בבסיס של פלג הגוף עליון עם מספריים סטריליים.
  2. לתפוס את הגוף בחוזקה בין זוג המ"קמלקחי rved ועושה חתך לאורך העור הגבה מראש אל זנב באמצעות אזמל מבלי לחדור fascia הבסיסי.
  3. מקלף בזהירות את העור מקו האמצע של העכבר.
  4. לתפוס את העכבר נחשף בחוזקה בצד הארוך של המלקחיים המעוגלים ולהכניס עוד זוג מלקחיים מעוקלים מתחת לעור בקצה האחורי של העכבר ומשוך בעדינות עור מעל ירכיים כלפי מחצית הגחון של העכבר.
  5. הזהירות לקלף עור לחלוטין את העכבר בתנועה חלקה אחת ולהשליך את הפגר.

3. לשטוף את העור ודגירה עם פתרון Dispase

  1. הנח את העור במנה הראשונה של פתרון לשטוף עם הדרמיס בצד. מורח את העור ולהתסיס עם מלקחיים. להשאיר את העור במנה הראשונה של פתרון לשטוף תוך ביתור העור הבא.
  2. לאחר שהניח את העור הגזור הבא במנה הראשונה של פתרון לשטוף, להעביר את העור לפני המנה השנייה של פתרון לשטוף. שמור עורות בדואר פתרון לשטוף 2 עד שכל העורות נאספים. להעביר את כל העורות לשטיפה הסופית, להתסיס בקצרה.
  3. הוסף Dispase קר כקרח מ"ל 10 למנת תרבות סטרילי 10 סנטימטרים. העברת עור לפתרון Dispase ומשטח את עור הדרמיס בצד.
  4. לצוף עור ל8-16 שעות ב 4 ° C (אופציה חלופית: 1 שעה על 37 מעלות צלזיוס).

4. דרמיס ואפידרמיס הנפרד

  1. העברת עור לצלחת סטרילית תרבות חדשה ומשטח את עור הדרמיס בצד. זהירות החזק את הדרמיס מפינה אחת עם אזמל.
  2. לתפוס את האפידרמיס עם מלקחיים ולאט לאט מתקלף מהדרמיס. אפידרמיס צריך לקלף כמקשה אחת. האפידרמיס יהיה לבן ודק והדרמיס צריך להיות חום, עבה יותר, ודביק.
  3. הפרד את שתי רקמות לתוך מנות התרבות סטריליים נפרדות.
    1. כדי להפוך את שתל מציאה / ביטוי יתר עור ספציפי גן, לקחת הדרמיס ובשר טחון לחתיכות קטנות מאוד עם לאאזמלי וו. השלך האפידרמיס. ביום של זיהום (שלב 7), לנתח את סדרה נוספת של עורות עכבר כדי להכין את תאים טריים, שלא טופלו אפידרמיס לשלב עם תאי עור lentiviral-נגועים.
    2. כדי להפוך את שתל מציאה / ביטוי יתר אפידרמיס ספציפית גן, פורס כל אחת לאפידרמיס 6-8 חתיכות קטנות יותר. השלך הדרמיס. ביום של זיהום (שלב 7), לנתח את סדרה נוספת של עורות עכבר כדי להכין את תאי עור שלא טופלו טריים, לשלב עם תאי אפידרמיס lentiviral-נגועים.

5. לנתק את תאים ראשוניים עכבר (Dermal mDCs) מרקמות טחונות

  1. לנתק mDCs ידי דוגר חתיכות עור עם פתרון collagenase טרי על 37 מעלות צלזיוס במשך שעה 1. השתמש 10 מ"ל של פתרון collagenase לעכבר גור.
  2. בעדינות מערבב הדרמיס תמיסה המכיל כל 10 דקות. בדקו את מידת הניתוק תחת מיקרוסקופ; השעית התא מתעכלת צריכה להיות בעיקר תאים בודדים. הפתרון צריך לשנות מברור מעורפלת כמותאי עור הם ניתקו מהדרמיס.
  3. הוסף FBS לפתרון collagenase מכיל הדרמיס לנפח סופי של 10% להפחתת הפעילות של collagenase.
  4. להעביר את השעית התא דרך מסננת תא 70 מיקרומטר לתוך צינור חדש מ"ל 50 להסיר גושים גדולים לא מעוכלים ושלמים זקיקים. הוסף 10 מ"ל של DMEM/10% FBS ל30 מ"ל של הזרימה דרך לדלל collagenase נוסף.
  5. צינורות המכילים צנטריפוגות הדרמיס מתעכל ב30 XG בצנטריפוגה שולחן למשך 5 דקות נוספות כדי להסיר זקיקים שלמים.
  6. בזהירות להעביר את supernatant לצינור מ"ל חדש 50. תאי גלולה ידי צנטריפוגה ב 200 XG בצנטריפוגה שולחן למשך 5 דקות.
  7. Resuspend תאים עם DMEM/10% FBS (1 מ"ל לכל גור) וספירת תאים. תאי צלחת עם C-100 תקשורת Amniomax לזיהום (שלב 7), או לשלב עם KC lentivirus הנגוע להשתלה (שלב 9). תשואה אופיינית היא 20 x 10 6 תאים לכל גור.

6. לנתק keratinocyte הראשיs (KC) מרקמות טחונות

  1. לנתק KC ידי דוגר חתיכות אפידרמיס עם 0.05% מופשרים טרי טריפסין-EDTA על 37 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות. השתמש 7 מ"ל של טריפסין-EDTA לעכבר גור.
  2. עדינות פתרון מערבולת המכיל אפידרמיס כל 5 דקות.
  3. הוסף נפח שווה של פתרון לנטרול האפידרמיס מכיל טריפסין-EDTA לצמצם את הפעילות של טריפסין.
  4. תאי גלולה ידי צנטריפוגה ב 200 XG בצנטריפוגה שולחן למשך 5 דקות. רקמות מעוכלות נותרות צריכות לצוף למעלה.
  5. זהירות לשפוך את רוב supernatant עם רקמות מעוכלות. הסרת supernatant נותר עם פיפטה 10 מ"ל ללא תא גלולה מטרידה. Resuspend תא גלול עם PBS. במקרה KCs אינו pelleted לחלוטין, יוצק את רוב supernatant וחזור צנטריפוגה עד שרוב התאים נמצאים pelleted.
  6. מסנן השעית תא דרך מסננת תא 70 מיקרומטר לתוך צינור חדש להסרת רקמה או גושים שנותר.
  7. תאי גלולה ידי צנטריפוגהב 200 XG בצנטריפוגה שולחן למשך 5 דקות.
  8. תאי resuspend ב-CNT-07 תקשורת או PBS (מ"ל 1 לכל גור) ותאים לספור. השתמש CNT-07 לתאי ציפוי לזיהום (שלב 7), השתמש PBS לשלב עם mDCs lentivirus הנגוע להשתלה (שלב 9). תשואה אופיינית היא 03-10 אוקטובר 6 תאי x ללבונה.

7. להדביק תאים ראשוניים עם lentivirus המכיל shRNA או cDNA

ביום של זיהום לנתח קבוצה נוספת של עורות עכבר כדי להכין KCs טרי, שלא טופל ראשוני או mDCs לשלב עם תאים נגועים בנגיף ביום של השתלה (שלב 9).

    1. לmDCs, צלחת 4 X 10 6 mDCs לצלחת 10-סנטימטר עם תקשורת AmnioMAX-C100 ולדגור על 37 ° C + CO 2 5% לזיהום למחרת ב 50% צפיפות תאים. צלחות בדרך כלל 3-4 של mDCs משמשות ליצירת שתל אחד, וכן סך של 10-12 צלחות נדרשים כדי ליצור שלושה שתלים בניסוי אחד. לחלופין, בואו mDCs לצרף ולהתפשט fאו מינימום של 2 שעות ב 37 ° C + CO 5% 2 ולבצע זיהום באותו היום של ציפוי תא. mDCs תהיה מורפולוגיה פיברובלסטים-אוהב.
    2. לKC, צלחת 12 x 10 6 KC לצלחת 10-סנטימטר עם-07-CNT תקשורת ולדגור על 37 ° C + CO 2 5% לזיהום למחרת. לחלופין, בואו KC לצרף והתפשט למינימום של 2 שעות ב 37 ° C + CO 5% 2 ולבצע זיהום באותו היום. צלחות בדרך כלל 3-4 של KC משמשות ליצירת שתל אחד. סכום כולל של 10-12 צלחות נדרשים כדי ליצור שלושה שתלים לניסוי אחד. KCs תהיה מורפולוגיה מרוצפת אבן.
  2. Preincubate תאים לדקות 5-10 עם מיקרוגרם 8 / פתרון Polybrene מ"ל ב 37 ° C + 5% CO 2.
  3. בורסת מדיה ולהוסיף lentivirus + 8 מיקרוגרם / מיליליטר פתרון Polybrene. כייל lentiviral ישתנה בהתאם לשימוש, ולבנות צריך להיקבע לפני הזיהום.
  4. צנטריפוגה הצלחות ב 200 XG בצנטריפוגה שולחן, לשעת 1 ב 32 °, C כדי להדביק תאים עם lentivirus.
  5. הסר את המדיה lentivirus המכיל ולהוסיף תקשורת טריה. לKC, לשטוף תאים פעם עם PBS לפני הוספת גב תקשורת טריה. תאים נגועים בדרך כלל לשחזר את הלילה על 37 מעלות צלזיוס + 5% CO 2. לחלופין, לאפשר לפחות שעות של התאוששות ב 37 ° C + 5% CO 2 לפני trypsinizing התאים להשתלה. המשך לתרבות בחלק קטן מתאים נגועים לבדיקת יעילות זיהום כמתואר בסעיף תוצאות הנציג.

8. הכן את התאים נגועים להשתלה

  1. מבודד mDCs העיקרי טרי או KCs מעור באמצעות צעדים 4-6. תאי resuspend בקרח הקר PBS סטרילית. ספירת תאים.
    1. לשתל מציאה / ביטוי יתר עור ספציפי גן, לנתק mDCs הנגוע מצלחות באמצעות 0.05% טריפסין-EDTA על 37 מעלות צלזיוס במשך דקות 8.
    2. לשתל מציאה / ביטוי יתר אפידרמיס ספציפית גן, לנתק KC הנגוע מצלחות USIng 0.125% טריפסין-EDTA על 37 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות.
  3. לנטרל את פעילות טריפסין באמצעות DMEM + 10% FBS (mDCs) או פתרון נטרול (KC). להעביר את תאי trypsinized לצינור מ"ל 50.
  4. תאי גלולה ידי צנטריפוגה ב 200 XG בצנטריפוגה שולחן למשך 5 דקות.
  5. תאי resuspend בקרח הקר PBS סטרילית. ספירת תאים.
  6. שלב את התאים הנגועים בנגיף עם סוג התא טרי ללא טיפול המקביל. לשתל אחד, לשלב 7-10 x 10 6 mDCs עם 07-10 אוקטובר 6 KCs x בקרח הקר PBS סטרילי וגלולת תרחיף התאים בצנטריפוגה שולחן ב 4 ° C. תאי resuspend ב -100 μl קרח הקר PBS סטרילי 50. שמור על תאים על קרח עד תאים נו / נו עכברים מוכנים.

9. צור מיטת פצע ולשכת תקן על גב של נו / נו מאוס

יום לפני ההשתלה, לעקר כלים כירורגיים בתאי סיליקון חיטוי ועקרים על ידי שרייה באתנול 70%. החלף etha 70%נול עם PBS סטרילי לפני השימוש בתאים.

  1. הרדם נו / נו עכבר (7-12 נקבות בשבוע ישנות) באמצעות קטמין (8 מ"ג / מ"ל) / xylazine (1.6 מ"ג / מ"ל) באמצעות הזרקת intraperitoneal (100 μl/10 משקל הגוף ז) או שיטה מועדפת אחרת. החל סיכת עין. כרית חימום מקום תחת עכבר.
  2. לחטא את העור בחזרה עכבר עירום עם יוד ולנקות עם מטליות אלכוהול.
  3. הוסף 1-3 טיפי Bupivicaine 0.25% לאתר החתך topically. צבוט את עור עכבר העירום בבסיס הצוואר עם מלקחיים.
  4. חתוך חור עגול קטן (~ 1 סנטימטר קוטר) בעור צבט במספריים סטריליות.
  5. הנח חדר הסטרילי על מיטת פצע ולכסות קצוות קאמריים עם עור מסביב.
  6. תא מאובטח למקום עם תפרים לאורך קצוות קאמריים (6 תפרים בחדר) כפי שמוצג באיור 2 א.
  7. כאשר תאים מוכנים, עדינות slurry מערבולת התא, וירשמו למחט 23 מד מצורפת מזרק 1 מ"ל. אם תרחיף תא מרוכז בחלק התחתון, בעדינותresuspend עם קצה פיפטה 1 מ"ל לפני הציור למחט.
  8. קאמרי לנקב עם מחט ולטפטף באיטיות על גבי תאי פצע.
  9. עכברי מקום לכלובים נקיים, autoclaved. בית 2 עכברים לכלוב ולהוסיף אנטיביוטיקה וטיילנול (3 מ"ג / מ"ל) למי שתייה. מניסיוננו, שני נקבות עכברים לכלוב לא הביאו לטראומה שלילית לקאמריים, שתל, או בעלי חיים.
  10. הנח כרית מתחת להתחממות מחצית הכלוב ולהתבונן בעכברים עד ההרדמה פגה.

10. הסר קאמרי לאחר 7-9 ימים

  1. הרדם נאוטילוס נו / נו עכבר כמו בשלב 9.1. החל סיכת עין.
  2. לחטא את העור סביב קאמרי עם יוד ולנקות עם מטליות אלכוהול.
  3. חתכתי את התפרים ולהוציא מתא.
  4. בעדינות להסיר קאמרי מעכבר. אם מקלות השתלת עור חדשים לקאמריים, להרים חלק מקאמרי ושתל עדינות נפרד מחדר באמצעות מלקחיים. החזק את השתל במהלך ההסרה של החדר. שתל צריך שירותיםk עמום ומעורפל כמו באיור 2B.
  5. החל משטח שאינו חסיד עם סרט דק של אנטיביוטיקה על הפצע הפתוח ותפר למקומו (2 תפרים).
  6. לעטוף תחבושת סביב עכבר כדי לאבטח את הכרית ולהגן על הפצע. לתפור תחבושת למקומה.
  7. תאי סיליקון מנוקים ע"י שפשוף עם סבון עדין ולשטוף ביסודיות עם מי deionized. משרה את התאים באתנול 70% בין הלילה, אוויר יבש, וחנות.

11. בחן את העכבר לצמיחת שיער

  1. הסרת תחבושות ומשטח לאחר 3 ימים של הסרה קאמרית. שתל צריך להיות יבש ואטום לצבע חום.
  2. בדקו עכברים מעת לעת לצמיחת שיער. שיער צריך להתחיל להראות ב16 ימים לאחר השתלה.

הליך מדורג

יום 1 (2-3 שעות): הקרב את גורים שזה עתה נולדו, להסיר את העור, ולהשאיר על dispase ב 4 ° C למשך הלילה.

יום 2 (2-3 שעות): מבודד את התאים ראשוניים מעור וצלחת בצפיפות תאים מומלצות.

יום 3 (שעות 3-4): להדביק תאים עם lentivirus. הסרת עור מסדרה נוספת של גורים שזה עתה נולדו ותעזוב בdispase ב 4 ° C למשך הלילה.

יום 4 (6-8 שעות): מבודד את התאים ראשוניים מעור, לספור, ומשאיר על קרח. שחזור תאי lentivirus נגועים על ידי trypsinization וצנטריפוגה, לספור ולשלב 7-10 x 10 6 תאי הקרטינוציטים ועור ל50-100 μl של PBS לשתל. צור מיטת פצע בעכבר, לצרף קאמרי, ולהחיל תערובת תא לפצוע את המיטה.

נוהל מתווה אלטרנטיבי

קווי מתאר הליך חלופיים יהיו לקצר את ההליך מארבעה ימים לשלושה.

  1. שלב את יום 1 ויום 2 על ידי טיפול בעור העכבר dispase על 37 מעלות צלזיוס במשך שעה אחת (שעת 5-7 זמן משוער).
  2. שלב יום 2 ויום 3 על ידי הדבקה של תאים עם lentivirus לאחר תאי ציפוי לשעות (שעה מוערכת זמן 5-7).

Representative Results

באיור 1 אנו מראים את התוצאה של מציאת shRNA lentiviral עור ספציפית של יתפוגג (SMO), רכיב איתות ששש קריטי, בשתל שיער רגנרטיבית שבועות 3 ישן. שתלי שליטה באמצעות וקטור lentiviral לבד להראות צמיחת שיער חזקה (איור 1 א). לעומת זאת, מציאת עור ספציפי של תוצאות SMO באובדן צמיחת שיער (1B איור). Hematoxylin וeosin כתם מתארים את השלב של זקיקי שיער בשליטה ובתנאי ניסוי (האיור 1C, ד). הפנוטיפ צמיחת השיער מטיפולים דומים יכול להיות משתנה בין ניסויים, כולל שליטה החיובית עם דלקת לבד וקטור lentiviral. שתלי בקרה חיוביים לכן תמיד צריכים להיות כלולים בכל ניסוי כהפניה כ30% משתלים יכולים להיכשל כתוצאה מצלקות או קובץ מצורף שלם של שתלים. במקרה של בדיקת אינטראקציה בין שני גורמים כגון overexpressing cDNA של גורם אחד מחדשמציאת shRNA בתיווך scue של גורם נוסף, יש תמיד כוללת שתלים בלבד למציאת מניפסט תוצאת אובדן של תפקוד בכל ניסוי. זה יספק טווח נחוץ כדי לקבוע כיצד גן מסוים perturbs מסלול זקיק שיער התחדשות ואיך שני גני האינטראקציה.

הסרה של החדר (איור 2 א) חייב להיעשות בזהירות. השתל חדש שנוצר צריך להיות מעט אטום עם משטח עמום (איור 2 ב '). השתל עלול להידבק לקנה, אז הרים בעדינות צד אחד הוא חשוב לוודא השתל נשאר מחובר למיטת הפצע. השתל הוא די יציב לאחר שלושה ימים וצריך להציג את הקושי בעת הסרת האיפור. צמיחת שיער חזקה צריכה להיות שנצפתה לאחר שלושה שבועות (האיור 2C). השמטה או mDCs או KCs תגרום אתר פצע החלים ללא כל שיער (האיור 2D) 11. מוות של תאים או אובדן תא באחדסוגי תאים גם תוצאות לא שיער, בניגוד להתחדשות שיער מופחתת במציאת עור-SMO כפי שמוצג בתרשים 1B.

כדי להבטיח assay מוצלח, זה קריטי כדי להשיג יותר מ 90% זיהום נגיפי של תאים עם ביטוי יתר מתאים או יעיל מציאה לפני ההשתלה. בשל אילוצי הזמן של הליך ההשתלה, אנו ממליצים יעילות זיהום ויראלי צרות ירי לפני התחלת ניסוי השתלה, ותמיד לשמור חלק קטן מתאים ביום של השתלת הליך כדי לוודא פסד או רווח, לביטוי. כייל lentiviral ישתנה בהתאם לשימוש, ולבנות צריך להיקבע לפני זיהום כדי להשיג יעילות 90-100%. אנו מנטרים את יעילות זיהום ויראלי עם GFP coexpressed מוקטור lentiviral. אנחנו לבצע באופן שגרתי כתם מערבי PCR ו / או כמותית כדי לקבוע את היקף מציאה או ביטוי יתר. ניצול וקטורים כפולי ביטוי עם תגי ניאון לתייגתאים נגועים באופן ויראלי מספקים דרך לדווח perdurance של אות ומספר התאים להביע מבנינו בשתלים בוגרים. אנו משתמשים GFP מונע על ידי אמרגן CMV מוקטור lentiviral pSicoR-CMV-GFP 10 בשילוב עם SMO shRNA. באיור 3, אנו מראים שתל ישן 3-שבוע עור ספציפי שבו GFP-הביע lentivirally בפטמית עור של זקיק שערה יציגה.

איור 1
איור 1. ניתוח היסטולוגית של צמיחת זקיקי שיער. () צפה בשתל התחדשות שיער שליטה עם תאי עור נגוע בוקטור lentiviral ריק והקרטינוציטים שלא טופלו. (ב) מציאה תתפוגג באמצעות shRNA lentiviral בתאי עור בשילוב עם תוצאות הקרטינוציטים לא טופלו בהפסד של זקיקי שיער. (ג) Hematoxylin ומכתים eosin מראים f שיער anagen ollicles בשתלי בקרה להאריך לתוך הדרמיס ו( ד ') זקיקי שיער מציאה יתפוגגו יישארו ננסיים וברובו נעדר. כל התמונות הן שלושה שבועות לאחר ההשתלה. סרגל קנה מידה מציין 100 מיקרומטר.

איור 2
איור 2. השתלת תאים ראשוניים. () עכבר נו / נו עם תאים תפר קאמריים דיור עיקריים עור והקרטינוציטים. (ב ') להסרה של תאי עור שנוצרה חושפת הוא עמום ומעורפל בדמות חדשה. (C) שערות גדלו באופן מלא על שתל באמצעות פרועות הקלד תאים ראשוניים עור והקרטינוציטים בשלושה שבועות לאחר ההשתלה. (ד ') תוספת של תאי עור ראשוניים ללא הקרטינוציטים מובילה לשום שיער לאחר שלושה שבועות. תוצאות דומות נצפו עם תוספת של הקרטינוציטים ראשוניים ללא תאי עור.

עמודים = "תמיד"> איור 3
איור 3. תחזוקה של ביטוי של GFP בגבשושיות עור. תמונות confocal של גבשושיות עור משתל 3-בן שבוע מחדש. GFP לידי ביטוי באוכלוסיית תאי העור מוקטור lentiviral וזוהה בפטמית עורי (ירוק). Versican (אדום) תוחם את הגבשושיות וגרעיני עורי היו תווית עם Hoechst (כחול). GFP ההערה מתבטא במיוחד בתאי עור, אך לא בקרטינוציטים שמסביב. סרגל קנה מידה מציין 20 מיקרומטר.

Discussion

מבחני כינון מחדש שיער לספק מודל התחדשות איבר ייחודי לבחינת מנגנון היווצרות זקיק שיער דה נובו. כאן, אנו מתארים assay שיער קאמרי שונה שימושי לקביעת תפקוד גן במבנה זקיק שיער. הבדיקה שלנו מבוססת על הבדיקה דיווחה הקאמרית שיער הכינון מחדש 5, 6,11, שאנו שונים כדי להציג את טכניקת ביטוי lentiviral להשיג ביטוי יתר מציאת גן או באחד משני סוגי תאי עור או האפידרמיס. הבדיקה שלנו מספקת חלופה מהירה ליצירת נוקאאוט הגנטי רקמות ספציפיות. בדיקה זו מאפשרת לנו להפגין תפקוד גן במבנה זקיק שיער קטן כמו 3 שבועות מהדבקת תאים ראשוניים עם lentivirus לאוסף שתל. הבדיקה שלנו ניתן להאריך להתייחס אינטראקציות גנטיות באמצעות שילוב shRNA / משלוח cDNA ידי lentivirus לסוג תא אחד 12, כמו גם מאפשר בדיקה של איתות בין תאי העור האופייני ואפידרמיסes.

בדיקת השיער שלנו היא מתאימה ביותר לאיתור רווח או פסד--of-פונקצית פנוטיפים חזקים בהתחדשות זקיקי שיער, ואילו פגמים עדינים קשים יותר לצפות. אנחנו הוכחנו הצלחת תפקוד גן מסוים עור של כמה גנים באמצעות assay התחדשות השיער שלנו 1,12. בהתבסס על סמן GFP שיתוף הביע מוקטור lentivirus להביע shRNA 10, הראינו כי shRNA להביע תורם בתאי עור התמיד בשתלי השיער מחדש. תאי ה-GFP חיוביים נכחו בפטמית עורי (DP) של זקיקי שיער ההתחדשות (איור 3). התאים העקורים סבירים כללו רמות שונות של מציאת גן כתאים הביעו רמות שונות של GFP, ובכך הפנוטיפ זקיק השיער שנצפה היה ממגוון הגנטי hypomorph לnull.

שיפור אחד assay זה יהיה להקים בחירה מהירה ויעילה לתאים הגבוהים shRNA להביע לפני graftinז כגון שימוש FACS לטהר תאים חזקים GFP להביע-. אלטרנטיבה היא להחליף תאי נוקאאוט מוטציה או מותנים בבדיקת 9 זה. מצד השני, מערכת תרבות שיכול לשמר את תפקוד תא DP היא מאוד שימושית כעצמת DP היא אבדה בהדרגה את תאי עורי פעם אחת העיקריים הם passaged. מערכות תרבות אפשריות כוללות שימוש בחומרים ביולוגיים הנגזרים מנישה מלאכותית או תרבויות צבירה 2,7,8,13. שיפור נוסף יהיה ליצור שיטה אמינה אפידרמיס תא קפוא עם שיעור החלמה גבוהה תא כמו זה יהיה להפחית את השימוש בסט השני של גורי עכברים (צעד 7) כדי לייצר הקרטינוציטים טריים באובדן או ספציפי לעור רווח-of- מחקרי פונקציות.

בדיקת שיער תא זה מייצרת צפיפות ואיכות דומה לעור עכבר רגיל זקיק שיער, למרות שצמיחת שיער היא מעט פחות מסונכרנת וכיוון זקיק הוא יותר אקראי. כמה מגבלות של הבדיקה הגנטית התחדשות שיער includדואר הדרישה של כמות גדולה של lentivirus ומספרים סלולריים, וזה מאוד עבודה אינטנסיבית במונחים של שיטות ניתוחיות בהשוואה לצורות אחרות של מבחני כינון מחדש שיער כגון תיקון ומבחני דש 3,4,14. עם זאת, האיכות של זקיקי שיער וצייר זמן כדי לזהות צמיחת שיער היא מעולה למבחנים אחרים 4. assay התחדשות השיער הממוקד שלנו מספק לוויה מהירה ונוחה למודלים גנטיים קיימים.

Disclosures

אין ניגודי האינטרסים הכריזו.

Acknowledgments

עבודה זו נתמכה על ידי NIH NRSA 1F32CA14208701 (SXA) ומענקי NIH AR052785 וAR046786 (AEO ווו-MW).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
PBS Invitrogen 14190-144
HBSS Invitrogen 14170-122
DMEM Invitrogen 11995-065
0.25% Trypsin-EDTA Invitrogen 25200-056
Cnt-07 Cell N Tec CnT-07
AminoMAX-C100 Invitrogen 17001-074
AminoMAX-C100 Supplement Invitrogen 12556-015
FBS Invitrogen 26140-079
Penicillin/Streptomycin Invitrogen 15140-122
Fungizone Invitrogen 15290-018
Gentamycin Invitrogen 15710-064
Dispase Roche 4942078001
Collagenase, Type 1 Sigma C-0130
Polybrene Sigma 107689-10G
Tissue culture dish Fisher Scientific 08-772E
Dissecting Scissors Fisher Scientific 11-999
Forceps Fisher Scientific 10-275 curved
Scalpal Medex Supply GRF-2975#10 Size no. 10
70 μm cell stainer VWR 21008-952
15 ml conical centrifuge tube Fisher Scientific 14-959-49D
Alcohol swabs Fisher Scientific 1368063
23 gauge needle Fisher Scientific 14-821-13F
Eye lubricant CVS 8883660
Providone-lodine swabs Fisher Scientific NC0116841
Silicon Chambers Renner GmbH F2U, 30268
Sutures Acuderm SUP3524
Flexible bandage Fisher Scientific 22-363-100
Non-adherent dressing TELFA 1050
Materials

Wash solution

PBS
500 μg/ml Penicillin/Streptomycin
12.5 μg/ml Fungizone
100 μg/ml Gentamycin

Dispase solution

HBSS
2.5 mg/ml final Dispase
100 μg/ml Gentamycin

Neutralizing media

HBSS
15% (Collagenase solution
DMEM
0.25% (w/v) Collagenase, Type I
100 μg/ml
Penicillin/Streptomycin
2.5 μg/ml Fungizone
50 μg/ml Gentamycin v/v) FBS

Polybrene solution

HBSS
8 μg/mL (w/v) Polybrene

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bershteyn, M., Atwood, S. X., Woo, W. M., Li, M., Oro, A. E. MIM and cortactin antagonism regulates ciliogenesis and hedgehog signaling. Dev Cell. 19, 270-283 (2010).
  2. Driskell, R. R., Juneja, V. R., Connelly, J. T., Kretzschmar, K., Tan, D. W., Watt, F. M. Clonal growth of dermal papilla cells in hydrogels reveals intrinsic differences between Sox2-positive and -negative cells in vitro and in vivo. J. Invest. Dermatol. 132, 1084-1093 (2012).
  3. Lee, L. F., Jiang, T. X., Garner, W., Chuong, C. M. A simplified procedure to reconstitute hair-producing skin. Tissue Eng. Part C Methods. 17, 391-400 (2011).
  4. Liang, Y., Silva, K. A., Kennedy, V., Sundberg, J. P. Comparisons of mouse models for hair follicle reconstitution. Exp. Dermatol. 20, 1011-1015 (2011).
  5. Lichti, U., Anders, J., Yuspa, S. H. Isolation and short-term culture of primary keratinocytes, hair follicle populations and dermal cells from newborn mice and keratinocytes from adult mice for in vitro analysis and for grafting to immunodeficient mice. Nat. Protoc. 3, 799-810 (2008).
  6. Lichti, U., Weinberg, W. C., Goodman, L., Ledbetter, S., Dooley, T., Morgan, D., Yuspa, S. H. In vivo regulation of murine hair growth: insights from grafting defined cell populations onto nude mice. J. Invest. Dermatol. 101, 124S-129S (1993).
  7. Lutolf, M. P., Gilbert, P. M., Blau, H. M. Designing materials to direct stem-cell fate. Nature. 462, 433-441 (2009).
  8. Osada, A., Iwabuchi, T., Kishimoto, J., Hamazaki, T. S., Okochi, H. Long-term culture of mouse vibrissal dermal papilla cells and de novo hair follicle induction. Tissue Eng. 13, 975-982 (2007).
  9. Rendl, M., Polak, L., Fuchs, E. BMP signaling in dermal papilla cells is required for their hair follicle-inductive properties. Genes Dev. 22, 543-557 (2008).
  10. Ventura, A., Meissner, A., Dillon, C. P., McManus, M., Sharp, P. A., Van Parijs, L., Jaenisch, R., Jacks, T. Cre-lox-regulated conditional RNA interference from transgenes. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 10380-10385 (2004).
  11. Weinberg, W. C., Goodman, L. V., George, C., Morgan, D. L., Ledbetter, S., Yuspa, S. H., Lichti, U. Reconstitution of hair follicle development in vivo: determination of follicle formation, hair growth, and hair quality by dermal cells. J. Invest. Dermatol. 100, 229-236 (1993).
  12. Woo, W. -M., Zhen, H. H., Oro, A. E. Shh maintains dermal papilla identity and hair morphogenesis via a Noggin-Shh regulatory loop. Genes Dev. 26, 1235-1246 (2012).
  13. Young, T. H., Lee, C. Y., Chiu, H. C., Hsu, C. J., Lin, S. J. Self-assembly of dermal papilla cells into inductive spheroidal microtissues on poly(ethylene-co-vinyl alcohol) membranes for hair follicle regeneration. Biomaterials. 29, 3521-3530 (2008).
  14. Zheng, Y., Du, X., Wang, W., Boucher, M., Parimoo, S., Stenn, K. Organogenesis from dissociated cells: generation of mature cycling hair follicles from skin-derived cells. J. Invest. Dermatol. 124, 867-876 (2005).

Tags

גנטיקה גיליון 72 הנדסת רקמות רפואה הנדסה ביו רפואית ביולוגיה תאית כירורגיה ביולוגית אפיתל התחדשות קאמרי שיער זקיק הדרמיס תאי עור תרבות keratinocyte שתל אפיתל תא lentivirus מציאה shRNA בתיווך מציאה ביטוי יתר עכברים עכברים הטרנסגניים מודל חיה
ניתוח גנטי מהיר של איתות אפיתל-mesenchymal במהלך התחדשות שיער
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Woo, W. M., Atwood, S. X., Zhen, H.… More

Woo, W. M., Atwood, S. X., Zhen, H. H., Oro, A. E. Rapid Genetic Analysis of Epithelial-Mesenchymal Signaling During Hair Regeneration. J. Vis. Exp. (72), e4344, doi:10.3791/4344 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter