Summary
Vävnadsspecifik analys av en hårsäck förnyelse modell med lentivirus att förmedla vinst-eller förlust-av-funktion.
Abstract
Hårsäcken morfogenes, en komplicerad process som kräver interaktion mellan epitel-härledda keratinocyter och den underliggande mesenkymceller, är ett attraktivt modellsystem för att studera utvecklingen av organ och vävnads-specifik signalering. Även hårsäcken utveckling är genetiskt lätthanterlig, snabb och reproducerbar analys av faktorer som är väsentliga för denna process är fortfarande en utmaning. Här beskriver vi ett förfarande för att generera riktade överuttryck eller shRNA-medierad ÖVERVÄLDIGANDE av faktorer med lentivirus i en vävnadsspecifikt sätt. Med hjälp av en modifierad version av en hår förnyelse modell 5, 6, 11, kan vi uppnå robusta vinst-eller förlust-av-funktion analys i primära muskeratinocyter eller dermal celler för att underlätta studier av epitel-mesenkymala signalvägar som leder till hårsäcken morfogenes . Vi beskriver hur att isolera nya primära muskeratinocyter och dermal celler, som innehåller dermal papilla celler och deras prekursorer, leverera lentivirus contaiNING antingen shRNA eller cDNA till en av de cellpopulationer, och kombinera cellerna att generera fullt formade hårsäckarna på ryggen av nakna möss. Detta tillvägagångssätt gör analys av vävnad-specifika faktorer som krävs för att generera hårsäckarna inom tre veckor och ger en snabb och bekväm följeslagare till befintliga genetiska modeller.
Protocol
1. Förbered 0 till 2 dagar gamla nyfödda möss för Skin Dissection
- Euthanize mus ungar med en CO 2 kammare under minst 20 minuter. Lämna valpar på is fram till en timme tills dissektion. P0-P2 möss rekommenderas som celler framställda av äldre möss har minskat stamfader kapacitet som resulterar i lägre transplantat avkastning. Förbered en maträtt av 70% etanol (för steg 1,3) och tre rätter av tvättlösning (för steg 3) när du är klar för att utföra huden dissektion. Tina Dispase Solution och lämna det vid 4 ° C. Cervikal rubba valpar efter CO 2 överexponering för att dödshjälp.
- Placera euthanized ungar i en kultur maträtt på is och överföring till ett sterilt flöde huva.
- Tvätta ungar genom att kort nedsänkning i 70% etanol och plats på steril odlingsskål.
2. Dissekera mushud
- Klipp av varje lem och svans vid basen av bålen med steril sax.
- Tag i kroppen stadigt mellan ett par curved pincett och göra ett snitt längs den dorsala huden från huvud till svans med en skalpell utan att penetrera underliggande fascia.
- Dra försiktigt huden från mittlinjen av musen.
- Ta tag i utsatta musen ordentligt med långsidan av de böjda pincett och sätt i ett annat par krökta tång under huden vid den bakre änden av musen och dra försiktigt huden över höfterna mot ventrala delen av musen.
- Dra försiktigt huden helt bort musen i en jämn rörelse och kasta kadavret.
3. Tvätta hud och Odla med Dispase lösning
- Placera huden i den första skålen tvättlösning med dermis nedåt. Sprid huden ut och skaka med pincett. Låt huden i den första skålen tvättlösning under dissekera nästa huden.
- Efter placering av nästa dissekerade huden i den första skålen tvättlösning, överföra den tidigare huden till den andra skålen tvättlösning. Håll skinn i the andra tvätt-lösning tills alla skinn samlas. Överför alla skinn till den slutliga tvätten, skaka kort.
- Tillsätt 10 ml iskall Dispase till en steril 10 cm odlingsskål. Överför huden till Dispase lösning och platta hud dermis nedåt.
- Float huden under 8-16 h vid 4 ° C (alternativ: 1 timme vid 37 ° C).
4. Separat dermis och epidermis
- Överför hud till en ny steril odlingsskål och platta hud dermis nedåt. Försiktigt håll dermis från ett hörn med en skalpell.
- Ta tag i epidermis med pincett och dra långsamt bort från dermis. Epidermis bör skala bort i ett stycke. Epidermis är vit och tunn och dermis vara brunaktig, tjockare och gelatinös.
- Separera de två vävnaderna i separata sterila odlingsplattor.
- För att göra en dermal specifik gen ÖVERVÄLDIGANDE / överuttryck transplantat, ta dermis och finhacka i mycket små bitar med two skalpeller. Släng epidermis. På dagen för infektion (steg 7), dissekera en annan uppsättning av mus skinn att framställa färska, obehandlade epidermala celler att kombinera med lentiviral-infekterade dermala celler.
- För att göra en epidermal specifik gen ÖVERVÄLDIGANDE / överuttryck transplantat, skiva varje epidermis i 6 till 8 mindre bitar. Släng dermis. På dagen för infektion (steg 7), dissekera en annan uppsättning av mus skinn att framställa färska, obehandlade dermala celler att kombinera med lentiviral-infekterade epidermala celler.
5. Dissociera Primära mus dermala celler (mDCs) av malet Tissue
- Avstånd mDCs genom att inkubera dermala bitar med nybakade kollagenaslösning vid 37 ° C under 1 timme. Använd 10 ml kollagenaslösning per mus valp.
- Blanda försiktigt lösning innehållande dermis varje 10 min. Kontrollera omfattningen av dissociation under ett mikroskop, den nedbrutna cellsuspensionen bör vara mest enstaka celler. Lösningen bör ändras från klar till grumlig somdermala celler dissocieras från dermis.
- Lägg FBS till kollagenaslösning innehåller dermis till 10% slutvolym att minska aktiviteten hos kollagenas.
- Passera cellsuspensionen genom en 70 | im cellfilter i en ny 50 ml tub att avlägsna stora osmälta klumpar och hela folliklar. Tillsätt 10 ml DMEM/10% FBS per 30 ml av flödet, genom att ytterligare späda ut kollagenas.
- Centrifugrör innehållande digererad dermis vid 30 x g på en bordscentrifug under 5 minuter för att ytterligare avlägsna hela folliklar.
- Försiktigt överföra supernatanten till ett nytt 50 ml rör. Pelletera celler genom centrifugering vid 200 x g på en bordscentrifug under 5 minuter.
- Resuspendera celler med DMEM/10% FBS (1 ml per valp) och räkna cellerna. Plate celler med Amniomax C-100 medier för infektion (steg 7), eller att kombinera med lentivirus-infekterade KC för ympning (steg 9). Typisk avkastning är 20 x 10 6 celler per valp.
6. Dissocierar Primär keratinocyts (KC) från Malet Tissue
- Dissociera KC genom att inkubera epidermala bitar med färskt tinade 0,05% trypsin-EDTA vid 37 ° C under 15 minuter. Använd 7 ml trypsin-EDTA per mus valp.
- Snurra försiktigt innehållande epidermis var 5 min.
- Lägg lika stor volym neutraliserande lösning till trypsin-EDTA innehåller epidermis för att minska aktiviteten hos trypsin.
- Pelletera celler genom centrifugering vid 200 x g på en bordscentrifug under 5 minuter. Kvarvarande osmält vävnad bör flyta ovanpå.
- Häll försiktigt bort det mesta av supernatanten med osmält vävnad. Avlägsna kvarvarande supernatanten med en 10 ml pipett utan att störa cellpellet. Resuspendera cellpelleten med PBS. I fall KCS är inte pelleteras fullständigt, häll bort det mesta av supernatanten och upprepa centrifugeringen tills de flesta av cellerna pelleteras.
- Stam cellsuspension genom 70 im cellfilter in i ett nytt rör för att avlägsna kvarvarande vävnad eller klumpar.
- Pelletera celler genom centrifugeringvid 200 xg i en bordscentrifug under 5 min.
- Återsuspendera cellerna i CNT-07 medium eller PBS (1 ml per valp) och celler räknas. Använd CnT-07 för plätering celler för infektion (steg 7), använd PBS för att kombinera med lentivirus-infekterade mDCs för ympning (steg 9). Typisk avkastning är 3-10 x 10 6 celler per valp.
7. Smitta primära celler med Lentivirus innehållande shRNA eller cDNA
På dagen för infektion dissekera annan uppsättning av mus skinn att framställa färska, obehandlade primära KCS eller mDCs att kombinera med virusinfekterade celler på dag av ympning (steg 9).
- För mDCs, plattan 4 x 10 6 mDCs per 10-cm platta med AmnioMAX-C100 medium och inkubera vid 37 ° C + 5% CO 2 för nästa dag infektion vid 50% celltäthet. Vanligtvis 3-4 plattor av mDCs används för att generera en transplantat, och totalt 10-12 plattor behövs för att generera tre transplantat i ett experiment. Alternativt, låt mDCs fäster och sprida feller minst 2 h vid 37 ° C + 5% CO 2 och utför infektion samma dag av cell plätering. mDCs har fibroblastliknande morfologi.
- För KC, plattan 12 x 10 6 KC per 10-cm platta med CNT-07 medium och inkuberas vid 37 ° C + 5% CO 2 för nästa dag infektion. Alternativt låt KC bifoga och sprida i minst 2 timmar vid 37 ° C + 5% CO 2 och utföra infektion på samma dag. Vanligtvis 3-4 plattor av KC används för att generera en transplantat. Totalt 10-12 plattor behövs för att generera tre transplantat för ett experiment. KCS har kullersten morfologi.
- Preinkubera celler för 5-10 min med 8 pg / ml polybren lösning vid 37 ° C + 5% CO 2.
- Växlingsmediet och lägga lentivirus + 8 ug / ml polybren lösning. Lentiviral titer varierar beroende på den använda konstruktionen och bör bestämmas innan infektion.
- Centrifugera plattorna vid 200 x g på en bordscentrifug under 1 timme vid 32 °, C att infektera celler med lentivirus.
- Ta lentivirus innehållande media och lägga till färska medier. För KC, tvätta cellerna en gång med PBS innan du lägger tillbaka färskt medium. Vanligtvis infekterade celler återhämta natten vid 37 ° C + 5% CO 2. Alternativt att minst två timmars återhämtning vid 37 ° C + 5% CO 2 innan trypsinizing cellerna för ympkvistar. Fortsätt att kulturen en liten del av infekterade celler för att kontrollera infektion effektivitet som beskrivs i den representativa resultat avsnittet.
8. Förbered infekterade celler för ympning
- Isolera färska primära mDCs eller KCS från huden med hjälp av steg 4-6. Återsuspendera cellerna i iskall steril PBS. Räkna celler.
- För dermal specifik gen ÖVERVÄLDIGANDE / överexpression transplantat, dissociera infekterade mDCs från plattor med 0,05% trypsin-EDTA vid 37 ° C under 8 minuter.
- För epidermal specifik gen ÖVERVÄLDIGANDE / överexpression transplantat, dissociera infekterade KC från plattorna USIng 0,125% trypsin-EDTA vid 37 ° C under 15 minuter.
- Neutralisera trypsinaktivitet med DMEM + 10% FBS (mDCs) eller neutraliserande lösning (KC). Överför trypsinerade cellerna till en 50 ml rör.
- Pelletera celler genom centrifugering vid 200 x g på en bordscentrifug under 5 minuter.
- Återsuspendera cellerna i iskall steril PBS. Räkna celler.
- Kombinera de virusinfekterade celler med den nyframställda obehandlade motsvarighet celltyp. För en transplantat, kombinera 7-10 x 10 6 mDCs med 7-10 x 10 6 KCS i iskall steril PBS och pelletera celluppslamningen i en bordscentrifug vid 4 ° C. Återsuspendera cellerna i 50 -100 ul iskall steril PBS. Hålla cellerna på is tills nu / nu möss kammare är redo.
9. Skapa sårbädden och Fix kammare på baksida nu / nu Mus
En dag innan ympning, sterilisera kirurgiska verktyg med autoklav och steril kisel kammare genom blötläggning i 70% etanol. Byt 70% etaNol med steril PBS innan kamrarna.
- Söva nu / nu möss (7-12 veckor gamla honor) med ketamin (8 mg / ml) / xylazin (1,6 mg / ml) via intraperitoneal injektion (100 μl/10 g kroppsvikt) eller annan föredragen metod. Applicera öga smörjmedel. Placera värmedynan i musen.
- Desinficera naken hud mus tillbaka med jod och rengör med spritsuddar.
- Lägg 1-3 droppar 0,25% Bupivicaine till incisionsstället lokalt. Nyp den nakna huden musen tillbaka på basen av halsen med pincett.
- Skär ett litet cirkulärt hål (~ 1 cm i diameter) i hudvecket med steril sax.
- Placera steril kammare på sårbädden och täcka kammare kanter med omgivande hud.
- Säker kammare på plats med suturer längs kammaren kanter (6 maskor per kammare) såsom visas i figur 2A.
- När kammare är redo, snurra försiktigt celluppslamningen och dra upp i 23 gauge nål fäst vid 1 ml spruta. Om celluppslamningen har kondenserat på botten, försiktigtåtersuspendera med 1 ml pipettspets innan man drar in nålen.
- Punktering kammare med nål och sakta droppa celler på såret.
- Placera möss i rena, autoklaverade burar. Hus 2 möss per bur och lägga antibiotika och Tylenol (3 mg / ml) till dricksvatten. Enligt vår erfarenhet har två honmöss per bur resulterade inte i negativ trauma till kammaren, transplantat eller djur.
- Placera uppvärmningen pad under halva buren och observera möss tills anestesi avtar.
10. Ta kammaren efter 7-9 dagar
- Söva kammare nu / nu möss som i steg 9,1. Applicera öga smörjmedel.
- Desinficera huden runt kammare med jod och rengör med spritsuddar.
- Skär försiktigt stygn och ta ur kammaren.
- Ta försiktigt bort kammaren från mus. Om nya hudtransplantation fastnar kammaren, lyft en del av kammaren och försiktigt separat transplantat från kammare med pincett. Håll transplantat nere under avlägsnande av kammaren. Graft bör look tråkig och ogenomskinlig såsom i figur 2B.
- Applicera en icke-vidhäftande dyna med en tunn film av antibiotika på det öppna såret och sutur på plats (2 stygn).
- Wrap förband runt musen för att säkra dynan och skydda såret. Sutur bandaget på plats.
- De kisel kamrarna rengörs genom skrubbning med mild tvål och sköljdes noggrant med avjoniserat vatten. Blötlägg kamrarna i 70% etanol under natten, lufttorka och förvara.
11. Undersök musen för hårväxt
- Avlägsna bandage och dynan efter 3 dagars kammarens borttagning. Graft ska vara torr och ogenomskinlig till brun i färgen.
- Kolla möss regelbundet för hårväxt. Hår ska börja visa på 16 dagar efter transplantat.
Procedur Outline
Dag 1 (2-3 tim): Sacrifice nyfödda valpar, ta bort hud och låt verka dispas vid 4 ° C över natten.
Dag 2 (2-3 tim): Isolera primära celler från hud ochplatta vid rekommenderad celltäthet.
Dag 3 (3-4 tim): infektera celler med lentivirus. Ta hud från en annan uppsättning av nyfödda ungar och lämna på dispas vid 4 ° C över natten.
Dag 4 (6-8 tim): Isolera primära celler från hud, räkna och lämna på is. Recover lentivirus-infekterade celler genom trypsinering och centrifugering, räkna och kombinera 7-10 x 10 6 dermal celler och keratinocyter i 50-100 fil PBS per transplantat. Skapa sårbädden på mus, fast kammare, och tillämpa cellblandningen att sårbädden.
Alternativt förfarande konturer
Alternativt förfarande konturer kommer att förkorta förfarandet från fyra dagar till tre.
- Kombinera Dag 1 och Dag 2 genom behandling mus skinn i dispas vid 37 ° C under en timme (beräknad tid 5-7 timmar).
- Kombinera Dag 2 och Dag 3 genom att infektera celler med lentivirus efter plätering celler i två timmar (beräknad 5-7 timmar).
Representative Results
I figur 1 visar vi resultatet av dermal-specifik Lentiviral shRNA ÖVERVÄLDIGANDE av Smoothened (Smo), en kritisk Shh signalering komponent, i en 3-veckors gamla regenerativ hår transplantat. Kontroll transplantat använder lentivirusvektor enbart visar stark hårväxt (figur 1A). Däremot, dermal-specifik ÖVERVÄLDIGANDE av Smo resulterar i förlust av hårväxt (figur 1B). Hematoxylin och eosin fläcken visar stadium hårsäckarna i kontroll och experimentella förhållanden (Figur 1C, D). Den hårväxt fenotyp från liknande behandlingar kan vara variabel bland experiment, inklusive den positiva kontrollen med lentivirusvektor enbart infektion. Därför positiv kontroll transplantat bör alltid ingå i varje experiment som en referens som 30% av transplantat kan misslyckas på grund av ärrbildning eller ofullständig fastsättning av transplantat. I fallet med testa en interaktion mellan två faktorer såsom överuttryck cDNA av ett faktor att återscue shRNA-medierad ÖVERVÄLDIGANDE en annan faktor bör man inkludera alltid knockdown enbart transplantat att manifestera förlust av funktion resulterar i varje experiment. Detta kommer att ge ett nödvändigt område för att avgöra hur en viss gen stör hår vägen follikelstimulerande förnyelse och hur två gener samverkar.
Avlägsnande av kammaren (Figur 2A) måste göras med försiktighet. Den nybildade transplantatet bör vara något ogenomskinlig med en matt yta (figur 2B). Transplantatet kan fastna på kammaren, så försiktigt lyfta ena sidan är viktigt att se till att transplantatet förblir fäst till sårbädden. Transplantatet är ganska stabil efter tre dagar och ska presentera lite svårt när du tar bort förbandet. Robust hårväxt bör observeras efter tre veckor (Figur 2C). Utelämna antingen mDCs eller KCS kommer att resultera i en återvunnen sårställe utan hår (Figur 2D) 11. Celldöd eller cellförlust i en avcelltyper resulterar också i något hår, i motsats till minskad hår regenerering i dermal-Smo ÖVERVÄLDIGANDE såsom visas i figur 1B.
För att säkerställa en lyckad analys är det viktigt att få mer än 90% virusinfektion av celler med lämpliga överuttryck eller ÖVERVÄLDIGANDE effektivitet innan ympning. På grund av tidsbrist hos ympning förfarande, rekommenderar vi felsöka virusinfektion effektivitet innan en ympning experiment och alltid spara en liten del av celler på dag ympning förfarande för att kontrollera förlust eller vinst-of-uttryck. Lentiviral titer varierar beroende på den använda konstruktionen och bör bestämmas före infektion för att uppnå 90-100% effektivitet. Vi övervakar virusinfektion effektivitet med GFP samuttrycks från lentivirusvektor. Vi utför rutinmässigt kvantitativ PCR och / eller Western blöt för att bestämma omfattningen av knockdown eller överuttryck. Använda dubbla expressionsvektorer med fluorescerande markörer för att märkavirusinfekterade celler är ett sätt att rapportera perdurance av signal och antal celler som uttrycker våra konstruktioner i mogna transplantat. Vi använder GFP drivs av en CMV-promotor från lentivirusvektor pSicoR-CMV-GFP 10 i kombination med Smo shRNA. I figur 3 visar vi en 3-veckors gamla dermal-specifik transplantat där GFP är lentivirally-uttryck i dermal papilla en representativ hårsäcken.
Figur 1. Histologisk analys av hårsäcken tillväxt. (A) Visa kontroll hår förnyelse transplantat med dermala celler infekterade med tom lentivirusvektor och obehandlade keratinocyter. (B) Smoothened ÖVERVÄLDIGANDE med Lentiviral shRNA i dermala celler i kombination med obehandlade keratinocyter resulterar i förlust av hårsäckar. (C) hematoxylin och eosinfärgning visar anagent hår follicles i kontroll transplantat sträcker sig ned i dermis och (D) Smoothened knockdown hårsäckar förblir hämmad och till stor del frånvarande. Alla bilder är tre veckor efter transplantation. Skalstock betecknar 100 | im.
Figur 2. Ympning primära celler.. (A) nu / nu möss med suturerade primärkammaren bostäder dermala celler och keratinocyter (B) Avlägsnande av kammaren exponerar nybildade hud som är matt och ogenomskinlig karaktär. (C) fullvuxen hår på transplantat med vild- typ primära dermala celler och keratinocyter vid tre veckor efter ympning. (D) Tillsats av primära dermala celler utan keratinocyter leder till inget hår efter tre veckor. Liknande resultat ses med tillsats av primära keratinocyter utan dermala celler.
Figur 3. Underhåll av GFP uttryck i dermal papilla. Konfokala bilder av dermal papilla från en 3-veckors regenererade gamla transplantat. GFP uttrycktes i den dermala cellpopulationen från en lentivirusvektor och detekteras i den dermala papillen (grön). Versikan (röd) avgränsar dermal papilla och kärnor var etikett med Hoechst (blå). Obs GFP uttrycks specifikt i dermala celler men inte i de omgivande keratinocyter. Skalstock betecknar 20 | im.
Discussion
Hår rekonstituering analyser ger en unik modell organregenerering för att undersöka mekanismen för de novo hårsäcken bildas. Här beskriver vi en modifierad testkammaren hår användbar för bestämning av genfunktion i hårsäcken bildning. Vår analys är baserad på den rapporterade kammarens hår rekonstitution analys 5, 6,11, som vi modifieras för att införa en lentiviral uttryck teknik för att uppnå gen överuttryck eller ÖVERVÄLDIGANDE i antingen de dermala eller epidermala celltyper. Vår analys ger en snabb alternativ att generera vävnadsspecifik genetisk knockout. Denna analys ger oss möjlighet att visa genfunktion i hårsäcken bildas i så lite som tre veckor från att infektera primära celler med lentivirus att ympa samling. Vår analys kan utsträckas för att ta itu genetiska interaktioner med kombinationen shRNA / cDNA-leverans av lentivirus i en celltyp 12, liksom tillåter undersökning av signalering mellan den dermala och epidermala cell-types.
Vårt hår analys är bäst lämpad för att upptäcka starka vinst-eller förlust-av-funktion fenotyper i hårsäcken förnyelse, medan subtila defekter är svårare att observera. Vi har framgångsrikt visat dermal specifik genfunktion av några gener med vår analys hår förnyelse 1,12. Baserat på GFP-markören samuttryckt från lentivirus vektor som uttrycker shRNA 10, visade vi att shRNA uttryckande donator dermala celler kvarstod i de regenererade hår ympkvistar. GFP-positiva celler var närvarande i den dermala papillen (DP) av de regenererade hårsäckarna (Figur 3). DP cellerna bestod sannolikt av olika gen ÖVERVÄLDIGANDE som celler uttryckte olika nivåer av GFP, alltså den observerade hårsäcken fenotyp var ett område från genetisk hypomorph till null.
En förbättring för denna analys är att skapa en snabb och effektiv selektion för de höga shRNA uttryckande celler innan grafting såsom användning av FACS för att rena starka GFP-uttryckande celler. Ett alternativ är att ersätta mutant eller villkorlig knockout celler i denna analys 9. Å andra sidan, är ett odlingssystem som kan bevara DP cellfunktion mycket användbar som DP potens gradvis förlorade när de primära dermala cellerna passeras. Potentiella odlingssystem innefattar användning av biomaterial som härrör från konstgjorda nisch eller kulturer aggregering 2,7,8,13. En annan förbättring är att alstra en tillförlitlig metod epidermal cell frysning med en hög cellåtervinning takt eftersom detta kommer att reducera användningen av den andra uppsättningen av mus ungar (steg 7) för att generera nya keratinocyter i dermal-specifik förlust eller vinst-av- funktionsstudier.
Denna kammare hår analys ger densitet hårsäcken och kvalitet som liknar normal mushud men hårväxt är något mindre synkroniserad och follikelstimulerande orientering är mer slumpmässig. Några begränsningar av håret regenerering genetiska analys inklue kravet av stora mängder lentivirus och cellantal, och det är mycket arbetskrävande när det gäller kirurgiska metoder jämfört med andra former av analyser hår rekonstitution såsom plåstret och analyserna flik 3,4,14. Dock är kvaliteten på hårsäckarna och tidsplan för att upptäcka hårväxt överlägsen andra analyser 4. Vår riktade hår förnyelse analys ger en snabb och bekväm följeslagare till befintliga genetiska modeller.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av NIH NRSA 1F32CA14208701 (SXA) och NIH bidrag AR052785 och AR046786 (AEO och W.-MW).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PBS | Invitrogen | 14190-144 | |
| HBSS | Invitrogen | 14170-122 | |
| DMEM | Invitrogen | 11995-065 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Invitrogen | 25200-056 | |
| Cnt-07 | Cell N Tec | CnT-07 | |
| AminoMAX-C100 | Invitrogen | 17001-074 | |
| AminoMAX-C100 Supplement | Invitrogen | 12556-015 | |
| FBS | Invitrogen | 26140-079 | |
| Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | |
| Fungizone | Invitrogen | 15290-018 | |
| Gentamycin | Invitrogen | 15710-064 | |
| Dispase | Roche | 4942078001 | |
| Collagenase, Type 1 | Sigma | C-0130 | |
| Polybrene | Sigma | 107689-10G | |
| Tissue culture dish | Fisher Scientific | 08-772E | |
| Dissecting Scissors | Fisher Scientific | 11-999 | |
| Forceps | Fisher Scientific | 10-275 | curved |
| Scalpal | Medex Supply | GRF-2975#10 | Size no. 10 |
| 70 μm cell stainer | VWR | 21008-952 | |
| 15 ml conical centrifuge tube | Fisher Scientific | 14-959-49D | |
| Alcohol swabs | Fisher Scientific | 1368063 | |
| 23 gauge needle | Fisher Scientific | 14-821-13F | |
| Eye lubricant | CVS | 8883660 | |
| Providone-lodine swabs | Fisher Scientific | NC0116841 | |
| Silicon Chambers | Renner GmbH | F2U, 30268 | |
| Sutures | Acuderm | SUP3524 | |
| Flexible bandage | Fisher Scientific | 22-363-100 | |
| Non-adherent dressing | TELFA | 1050 | |
| Materials | |||
Wash solution PBS Dispase solution HBSS Neutralizing media HBSS Polybrene solution HBSS |
|||
References
- Bershteyn, M., Atwood, S. X., Woo, W. M., Li, M., Oro, A. E. MIM and cortactin antagonism regulates ciliogenesis and hedgehog signaling. Dev Cell. 19, 270-283 (2010).
- Driskell, R. R., Juneja, V. R., Connelly, J. T., Kretzschmar, K., Tan, D. W., Watt, F. M. Clonal growth of dermal papilla cells in hydrogels reveals intrinsic differences between Sox2-positive and -negative cells in vitro and in vivo. J. Invest. Dermatol. 132, 1084-1093 (2012).
- Lee, L. F., Jiang, T. X., Garner, W., Chuong, C. M. A simplified procedure to reconstitute hair-producing skin. Tissue Eng. Part C Methods. 17, 391-400 (2011).
- Liang, Y., Silva, K. A., Kennedy, V., Sundberg, J. P. Comparisons of mouse models for hair follicle reconstitution. Exp. Dermatol. 20, 1011-1015 (2011).
- Lichti, U., Anders, J., Yuspa, S. H. Isolation and short-term culture of primary keratinocytes, hair follicle populations and dermal cells from newborn mice and keratinocytes from adult mice for in vitro analysis and for grafting to immunodeficient mice. Nat. Protoc. 3, 799-810 (2008).
- Lichti, U., Weinberg, W. C., Goodman, L., Ledbetter, S., Dooley, T., Morgan, D., Yuspa, S. H. In vivo regulation of murine hair growth: insights from grafting defined cell populations onto nude mice. J. Invest. Dermatol. 101, 124S-129S (1993).
- Lutolf, M. P., Gilbert, P. M., Blau, H. M. Designing materials to direct stem-cell fate. Nature. 462, 433-441 (2009).
- Osada, A., Iwabuchi, T., Kishimoto, J., Hamazaki, T. S., Okochi, H. Long-term culture of mouse vibrissal dermal papilla cells and de novo hair follicle induction. Tissue Eng. 13, 975-982 (2007).
- Rendl, M., Polak, L., Fuchs, E. BMP signaling in dermal papilla cells is required for their hair follicle-inductive properties. Genes Dev. 22, 543-557 (2008).
- Ventura, A., Meissner, A., Dillon, C. P., McManus, M., Sharp, P. A., Van Parijs, L., Jaenisch, R., Jacks, T. Cre-lox-regulated conditional RNA interference from transgenes. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 10380-10385 (2004).
- Weinberg, W. C., Goodman, L. V., George, C., Morgan, D. L., Ledbetter, S., Yuspa, S. H., Lichti, U. Reconstitution of hair follicle development in vivo: determination of follicle formation, hair growth, and hair quality by dermal cells. J. Invest. Dermatol. 100, 229-236 (1993).
- Woo, W. -M., Zhen, H. H., Oro, A. E. Shh maintains dermal papilla identity and hair morphogenesis via a Noggin-Shh regulatory loop. Genes Dev. 26, 1235-1246 (2012).
- Young, T. H., Lee, C. Y., Chiu, H. C., Hsu, C. J., Lin, S. J. Self-assembly of dermal papilla cells into inductive spheroidal microtissues on poly(ethylene-co-vinyl alcohol) membranes for hair follicle regeneration. Biomaterials. 29, 3521-3530 (2008).
- Zheng, Y., Du, X., Wang, W., Boucher, M., Parimoo, S., Stenn, K. Organogenesis from dissociated cells: generation of mature cycling hair follicles from skin-derived cells. J. Invest. Dermatol. 124, 867-876 (2005).
