Summary
组织特异性分析的毛囊再生模型，利用慢病毒介导增益或损失的功能。
Abstract
毛囊形态发生是一个复杂的过程，需要上皮细胞衍生的角质形成细胞和底层的间充质细胞之间的相互作用，是一个有吸引力的模型系统来研究器官发育和组织特异性的信号。虽然毛囊的发展是听话的基因，快速，重现性的分析，这个过程中的重要因素仍然是一个挑战。在这里，我们描述一个过程来产生有针对性的过表达或短发夹环介导的击倒的因素，使用慢病毒中的组织特异性的方式。使用修改后的版本毛发再生模型5，6，11，我们可以实现强大的增益或损失的小鼠原代角质细胞或皮肤细胞的功能分析，以方便上皮-间质的信号转导途径，导致毛囊形态发生的研究。我们描述了如何隔离新鲜小鼠角质形成细胞和真皮细胞，它含有毛乳头细胞和它们的前体，提供慢病毒含有宁shRNA或cDNA的一个细胞种群，细胞结合起来，以产生完全形成的裸小鼠的背部上的毛囊。这种方法允许需要在三个星期内产生毛囊组织的具体因素分析，现有的遗传模型提供了一个方便快捷的同伴。
Protocol
1。准备0〜2日龄新生小鼠的皮肤解剖
- 安乐死鼠标幼仔使用CO 2室为至少20分钟。离开幼崽在冰上了一个小时，直到解剖。移植产量较低，结果在P0-P2小鼠的，强烈建议准备从年纪较大的老鼠的细胞祖能力降低。准备一盘70％乙醇（1.3）和三道菜的清洗液（步骤3）当准备进行皮肤解剖。解冻中性蛋白酶的解决方案，并保持在4°C.颈椎脱臼的幼崽后，CO 2曝光过度，确保安乐死。
- 将安乐死的幼崽在冰上转移到无菌的流罩在培养皿中。
- 洗净幼仔通过简要浸渍在70％乙醇和无菌培养皿上的地方。
2。解剖小鼠皮肤
- 在该基地的躯干，用无菌剪刀切断每一个四肢和尾巴。
- 牢牢把握身体之间的对铜rved钳和，沿着背部皮肤做一个切口从头部到尾部使用手术刀，不渗透的基础筋膜。
- 小心剥离的皮肤远离中线的鼠标。
- 牢牢抓住暴露的鼠标的长边弯钳和插入另一对皮肤下的鼠标在后端弯钳，轻轻拉向腹侧半的鼠标臀部皮肤。
- 小心地剥开皮完全关闭鼠标在一个流畅的动作，丢弃的尸体。
3。清洗皮肤和孵育中性蛋白酶解决方案
- 将皮肤的真皮侧的洗涤液中的第一道菜。传播的皮肤，并，搅拌用钳子。解剖下的皮肤，使肌肤的第一道菜的洗涤液。
- 放置下一个解剖皮肤的洗涤溶液中的第一道菜后，现有的皮肤转移到洗涤溶液中的第二盘。保持皮肤在日E二次洗涤液，直到收集所有的皮肤。将所有的皮肤，最后洗，搅拌简要介绍。
- 无菌的10厘米的培养皿中加入10毫升冰冷的中性蛋白酶。传输的皮肤中性蛋白酶的解决方案和展平皮肤的真皮侧。
- 浮动皮肤8-16小时，在4°C（替代方案：1小时，在37°C）。
4。独立的真皮和表皮
- 皮肤转移到一个新的无菌培养皿中，并展平皮肤的真皮侧。从一个角落里，用手术刀小心地按住真皮。
- 抓住镊子，慢慢地剥离表皮从真皮。表皮应剥离为一块。表皮是白色的，薄的，应该是褐色的，更厚，胶质和真皮。
- 分开的两个组织成单独的无菌培养皿中。
- 为了使真皮特定基因敲除/过度表达移植，真皮和剁碎成非常小的碎片与T禾手术刀。丢弃的表皮。在一天的感染（步骤7），解剖另一组的小鼠的皮肤，以制备新鲜的，未经处理的表皮细胞结合与慢病毒感染的皮肤细胞。
- 为了使表皮细胞的特定基因敲除/过度表达移植，每一个表皮切片为6 - 8个更小的碎片。舍弃真皮。在一天的感染（步骤7），解剖另一组的小鼠的皮肤，以制备新鲜的，未经处理的皮肤细胞与慢病毒感染的表皮细胞结合。
5。游离小鼠原代的真皮细胞（MDCS），肝等组织
- 游离MDCS培养真皮片和新鲜的的胶原酶溶液在37°C 1小时。使用鼠标小狗的胶原酶溶液每10毫升。
- 轻轻地混合溶液真皮每10分钟。在显微镜下检查的离解的程度;消化的细胞悬浮液应该是大多是单细胞。该解决方案应该从明确到多云从真皮真皮细胞解离。
- 添加FBS的胶原酶解含有真皮胶原酶的活性降低至10％最终体积。
- 通过细胞悬液通过一个70微米到一个新的50ml管中去除大量未消化的团块和整个毛囊细胞过滤器。 DMEM/10％FBS中加入10毫升每30毫升的流量通过，以进一步稀释的胶原酶。
- 离心管中，在桌面上离心5分钟，以进一步除去整个毛囊在30×g离心含有消化真皮。
- 小心地将上清转移到一个新的50ml管。通过在200×g离心5分钟，在台式离心机离心沉淀细胞。
- DMEM/10％FBS（1毫升每只幼犬）重悬细胞并计数细胞。板细胞Amniomax C-100感染的媒体（步骤7），或结合慢病毒感染的KC，用于接枝（步骤9）。典型的产量是20×10 6细胞每只幼犬。
6。游离主角质细胞（KC），肝等组织
- 通过表皮片与新鲜解冻的0.05％胰蛋白酶-EDTA在37℃下孵育15分钟，游离KC。使用胰蛋白酶-EDTA每毫升鼠标小狗。
- 轻轻旋转解决方案，包含表皮，每隔5分钟。
- 和溶液加入等体积的胰蛋白酶-EDTA含表皮中的胰蛋白酶的活性降低。
- 通过在200×g离心5分钟，在台式离心机离心沉淀细胞。剩余未消化的组织，浮在上面。
- 小心倒出上清液与未消化的组织。除去剩余的上清液与10毫升的移液管，而不会干扰细胞沉淀。用PBS重悬细胞沉淀。如果在角质形成是不完全沉淀，倒出上清液，并，，直到大多数细胞沉淀重复离心。
- 菌株细胞悬浮液通过70μm的细胞过滤网进新管中，以除去剩余的组织或团块。
- 颗粒细胞离心在200×g离心5分钟，在台式离心机。
- CNT-07的媒体或PBS（1毫升每只幼犬）和计数细胞的悬浮细胞。使用CNT-07的电镀感染的细胞（步骤7），用PBS结合的慢病毒感染的mDC移植术（步骤9）。典型的产量为3-10×10 6个细胞的小狗。
7。感染原代细胞的慢病毒载体的shRNA或cDNA
天感染解剖另一组的小鼠的皮肤以制备新鲜的，未经处理的主枯否或的mDC到与天的接枝（步骤9）的病毒感染的细胞结合。
- 有关的mDC，板4×10 6个，每10厘米板的mDC AmnioMAX-C100媒体和孵育在37°C + 5％CO 2的50％的细胞密度在第二天感染。一般3-4板的mDC被用于产生一种接枝，并总共10-12板都需要在一个实验中产生三个移植。或者，让MDCS连接和扩展F或至少在37℃下2小时+，5％CO 2，并执行感染当天细胞镀。 MDCS成纤维细胞样形态。
- KC，板12×10 6 KC每10厘米的板CNT-07的媒体和孵化，在37°C + 5％CO 2次日感染。或者，让KC附加和扩散为至少2小时，在37°C + 5％CO 2，并在同一天进行感染。一般3-4板的KC被用于产生一种接枝。共10-12板需要以产生三个移植一个实验。的枯否将有铺路石样形态。
- 垫上预温育5-10分钟的细胞8微克/毫升聚凝胺在37℃下解+，5％CO 2。
- 交换介质，并添加慢病毒+ 8微克/毫升聚凝胺的解决方案。慢病毒的滴度会有所不同，这取决于使用的结构和前应确定感染。
- 在200 XG离心板在台式离心机1小时，在32℃，C慢病毒感染的细胞。
- 删除慢的媒体和增添新的媒体。对于KC，用PBS洗涤细胞一次，然后再添加新鲜的媒体。一般感染的细胞恢复过夜，在37℃下，5％CO 2。或者，允许至少两个小时的恢复，在37°C + 5％CO 2的胰酶消化细胞移植前。继续培养感染的细胞中的一小部分，以检查代表结果部分中所描述的感染效率。
8。准备受感染的细胞移植
- 新鲜的mDC或KCS隔离皮肤使用步骤4-6。在冰冷的无菌PBS悬浮细胞。计数细胞。
- 对于皮肤的特定的基因敲除/过度接枝，游离从板8分钟，在37℃下用0.05％胰蛋白酶-EDTA的感染的mDC。
- 表皮细胞的特定基因敲除/过度表达移植，游离受感染的KC板USI纳克0.125％胰蛋白酶-EDTA在37℃下15分钟。
- 中性化胰蛋白酶的活性，用DMEM +10％FBS（MDCS）或中和剂溶液（KC）。胰蛋白酶处理细胞转移到一个50毫升的试管。
- 通过在200×g离心5分钟，在台式离心机离心沉淀细胞。
- 在冰冷的无菌PBS悬浮细胞。计数细胞。
- 结合与新鲜制备的未处理对应的信元类型的病毒感染的细胞。对于一个移植物，结合7-10×10 6的mDC 7-10×10 6个角质形成在冰冷的无菌PBS和颗粒的细胞浆在台式离心机中在4℃下在50元-100μL冰冷的无菌PBS悬浮细胞。保持细胞置于冰上，直到nu / nu小鼠室准备。
9。创建返回nu / nu小鼠的伤口床和修复商会到
接枝的前一天，灭菌用高压釜中，无菌硅腔的外科手术工具，通过浸泡在70％乙醇中。更换70％的ETHA在使用前腔北环线，用无菌PBS。
- 麻醉nu / nu小鼠（7-12周龄雌性）（8毫克/毫升）使用氯胺酮/赛拉嗪（1.6毫克/毫升），经腹腔注射（100μl/10g体重）或其他优选的方法。应用眼睛润滑油。将加热鼠标垫下。
- 裸鼠背部皮肤用碘酒消毒，并用酒精棉签清洁。
- 加入1-3滴0.25％布比卡因切口部位的局部。在基地的脖子用钳子捏住裸小鼠背部皮肤。
- 在捏皮肤，用无菌剪刀剪了一个小的圆形孔（直径在1厘米）。
- 将无菌室到伤口床，盖上腔的边缘与周围皮肤。
- 安全室分成室边缘的缝合线沿每个腔室（6针），如在图2A中示出的地方。
- 室都准备好了，轻轻摇动细胞浆，并绘制成1毫升注射器23号针头。如果细胞浆液已凝结在底部，轻轻重悬画进针前，用1毫升移液枪枪头。
- 穿刺针，慢慢地滴细胞到伤口室。
- 将小鼠到干净，蒸压笼。楼2小鼠每笼和饮水中添加抗生素和泰诺（3毫克/毫升）。根据我们的经验，并没有导致不良反应室的创伤，移植物，或动物的雌性小鼠的每笼。
- 将变暖垫下半笼，观察小鼠，直到麻醉消退。
10。删除后7-9天会
- 麻醉腔nu / nu小鼠在步骤9.1。应用眼睛润滑油。
- 消毒室，碘和周围的皮肤用酒精棉签清洁。
- 精心裁剪的针和删除从一个房间。
- 轻轻删除腔鼠标。如果新的皮肤移植枝室，抬起室室使用镊子轻轻分开移植。保持移植的过程中去除室。移植物应该厕所K表枯燥和图2B不透明的。
- 应用非粘附垫入到位（2针）的开放的伤口和缝合线的抗生素对用薄膜。
- 围绕鼠标缠绕绷带，以保护垫，保护伤口。缝合包扎到位。
- 的硅腔室是通过用温和的肥皂擦洗清洁，并用去离子水彻底冲洗。腔浸泡在70％乙醇过夜，空气干燥，和存储。
11。检查鼠标对头发的生长
- 取出绷带和垫后3天室去除。移植应干燥，不透明的褐色的颜色。
- 定期检查小鼠对头发的生长。头发应在移植后第16天开始显示。
步骤概述
1天（2-3小时）：牺牲新生幼崽，去除角质，并留下分离酶在4℃过夜。
第2天（2-3小时）：从皮肤隔离的初级细胞和板推荐的细胞密度。
第3天（3-4小时）：用慢病毒感染的细胞。删除从另一组的新生幼崽离开皮肤上分离酶在4℃过夜。
第4天（6-8小时）：从皮肤中分离出原代细胞，计数，和留在冰上。恢复慢病毒感染的细胞用胰蛋白酶消化，离心，计数，并结合每移植到50-100μl的PBS 7-10×10 6真皮细胞和角质形成细胞。创建对小鼠的伤口床，连接室，应用细胞混合物的伤口床。
替代过程概述
替代程序的轮廓将缩短程序从四天三年。
- 结合第1天，第2天治疗小鼠皮肤在分散酶，在37℃下为一小时（估计时间5-7小时）。
- 结合第2天，第3天，通过电镀细胞两小时（估计时间5-7小时）后，用慢病毒感染细胞。
Representative Results
在图1中，我们显示的结果真皮特定的慢病毒shRNA击倒的平滑（SMO），一个关键的Shh信号组件，在为期3周的再生头发移植。单独使用慢病毒载体的控制移植强大的头发生长（ 图1A）。相比之下，真皮特异性抑制毛发的生长（ 图1B）的损失的Smo结果。苏木精和曙红染色示出的阶段，在对照组和实验条件（ 图1C，D） 的毛囊。从类似的处理头发的生长表型可以是可变的在实验中，与慢病毒载体单独感染包括阳性对照。因此，积极控制移植应始终包含在每一个实验作为参考30％的移植失败的结果疤痕或不完整的移植附件。在测试两个因素，如过度的因素之一的cDNA之间的相互作用的情况下重新短发夹介导的击倒的scue的另一个因素，每个人都应该包括击倒单独的移植到明显的损失的功能在每个实验结果。这将提供一个必要的范围内，以确定一个特定基因如何扰动毛囊再生途径和两个基因如何交互。
去除室（ 图2A），必须小心。新成立的移植应该是稍微暗淡表面的不透明的（ 图2B）。移植室，所以轻轻地举起一面坚持是很重要的，以确保移植物保持连接的伤口床。移植是相当稳定的三天后取出敷料时，应当出示什么困难。鲁棒的头发生长，应观察到三个星期后（ 图2C）。省略无论是MDCS或KCS将导致恢复的伤口部位没有任何毛发（ 图2D）11。之一中的细胞死亡或细胞损失细胞类型的查询结果在没有头发，相反，减少毛发再生，如在图1B中所示的真皮Smo的击倒。
为了确保一个成功的试验，这是至关重要的实现大于90％的病毒感染的细胞，用适当的过表达或击倒效率接枝前。由于移植手术的时间限制的，我们建议开始前一个嫁接试验的故障排除病毒感染效率，并始终保存的一小部分细胞移植手术当天，以验证损失或增益的表达。慢病毒的滴度会有所不同，这取决于使用的结构，应确定感染前达到90-100％的效率。我们监测与GFP共表达的慢病毒载体病毒感染效率。我们定期进行定量PCR和/或Western印迹击倒或过度表达程度来决定。利用双表达载体与荧光标记，标记病毒感染的细胞，提供了一个方法来报告perdurance表达我们构建在成熟移植的细胞的信号和数目。我们使用由CMV启动子驱动的，从pSicoR-CMV-GFP组合Smo的短发夹10的慢病毒载体的绿色荧光蛋白。在图3中，我们展示了3周的皮肤特异性移植，其中GFP的慢病毒载体表达有代表性的毛囊的毛乳头。
图1。毛囊生长的组织学分析。（A）的控制毛发再生术与空慢病毒载体和未经处理的角质细胞与皮肤细胞感染。（B）磨平了击倒使用在皮肤细胞的慢病毒shRNA结合，与未经处理的角质形成细胞在毛囊损失。 （C）苏木精和曙红染色显示生长期发氟ollicles在控制移植到真皮层向下延伸（D）磨平了击倒毛囊继续发育不良，基本上不存在。所有图片均为3周后移植。比例尺表示100微米。
图2。嫁接原代细胞。（A）nu / nu小鼠与缝合室住房主要皮肤细胞和角质形成细胞（B）新成立的皮肤去除室公开是枯燥和不透明的字符。（C）完全成长的毛发移植野生输入主要的皮肤细胞和角质形成细胞在三个星期后移植。（D）增加的主要皮肤角质形成细胞的细胞没有导致无毛，后三个星期。类似的结果被认为加入初级的角质形成细胞无真皮细胞。
图3。维护GFP表达在真皮乳头。共聚焦图像从3周龄再生移植的毛乳头。 GFP的表达在真皮细胞种群从慢病毒载体，在真皮乳头（绿色）检测。聚糖（红色）划定的毛乳头和细胞核用Hoechst（蓝色）的标签。注意GFP的真皮细胞中特异表达的，但不是在周围的角质细胞。比例尺是指20微米。
Discussion
头发重建试验研究的从头毛囊形成的机制提供了一个独特的器官再生模型。在这里，我们描述了修改后的腔头发检测，可用于确定毛囊形成的基因的功能。我们的测定是基于报告室头发重建测定5星，6,11，这是我们修改引入慢病毒的表达技术来实现的真皮或表皮细胞类型的基因过表达或击倒在。我们的分析提供了一个快速的替代品产生组织特异性基因敲除。此法使我们能够在短短的三个星期内，用慢病毒感染原代细胞移植收集在毛囊形成的基因功能演示。我们的检测可扩展，以解决使用组合短发夹/慢病毒的cDNA交付到一个单元格12型的遗传相互作用，以及允许信令之间的真皮和表皮细胞典型的检查ES。
我们的头发测定是最适合于检测强的增益或损失的函数在毛囊再生的表型，而微妙的缺陷是难以观察到。我们已经成功地证明的几个基因，用我们的头发再生实验1,12的真皮特定基因的功能。基于GFP标记的共表达的慢病毒载体shRNA表达10，我们表明，再生的毛发移植供体皮肤细胞的shRNA表达坚持。 GFP阳性细胞中存在的（ 图3）的再生毛囊真皮乳头（DP）。 DP细胞可能包括不同程度的基因敲除细胞不同程度的GFP表达，从而观察到毛囊型范围从遗传hypomorph，为空。
此法的改进之一将是建立一个快速和有效的选择的shRNA表达细胞前graftin克如使用流式细胞仪，净化强烈的绿色荧光蛋白表达细胞。另一种方法是在此试验中9替代突变或条件性敲除细胞。另一方面，培养系统，可以保留DP细胞的功能是非常有用的，作为DP一旦主真皮细胞传代，逐渐失去效力。潜在的文化系统，包括使用生物材料来自人工的利基或聚集文化2,7,8,13。另一项改进将是产生一个可靠的表皮细胞的冷冻法具有高细胞的回收率，因为这将减少使用鼠标幼仔（步骤7）的第二组以产生新鲜的角质形成细胞，在真皮特定的损耗或增益功能的研究。
该室头发分析产生类似正常小鼠皮肤毛囊的密度和质量，但头发的生长是略低于同步和卵泡定位更随机。有一些限制的头发再生的基因检测含e是需要大量的慢病毒和细胞的数量，这是非常劳力密集的手术方法相比，其他形式的头发重建试验，如补丁和襟翼检测3,4,14。然而，毛囊和时间表的质量检测头发的生长优于其他实验4。我们的目标毛发再生现有的遗传模型分析提供了一个方便快捷的同伴。
Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
这项工作是由美国国立卫生研究院NRSA 1F32CA14208701（SXA）和国立卫生研究院资助AR052785 AR046786（AEO和W-MW）的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PBS | Invitrogen | 14190-144 | |
| HBSS | Invitrogen | 14170-122 | |
| DMEM | Invitrogen | 11995-065 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Invitrogen | 25200-056 | |
| Cnt-07 | Cell N Tec | CnT-07 | |
| AminoMAX-C100 | Invitrogen | 17001-074 | |
| AminoMAX-C100 Supplement | Invitrogen | 12556-015 | |
| FBS | Invitrogen | 26140-079 | |
| Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | |
| Fungizone | Invitrogen | 15290-018 | |
| Gentamycin | Invitrogen | 15710-064 | |
| Dispase | Roche | 4942078001 | |
| Collagenase, Type 1 | Sigma | C-0130 | |
| Polybrene | Sigma | 107689-10G | |
| Tissue culture dish | Fisher Scientific | 08-772E | |
| Dissecting Scissors | Fisher Scientific | 11-999 | |
| Forceps | Fisher Scientific | 10-275 | curved |
| Scalpal | Medex Supply | GRF-2975#10 | Size no. 10 |
| 70 μm cell stainer | VWR | 21008-952 | |
| 15 ml conical centrifuge tube | Fisher Scientific | 14-959-49D | |
| Alcohol swabs | Fisher Scientific | 1368063 | |
| 23 gauge needle | Fisher Scientific | 14-821-13F | |
| Eye lubricant | CVS | 8883660 | |
| Providone-lodine swabs | Fisher Scientific | NC0116841 | |
| Silicon Chambers | Renner GmbH | F2U, 30268 | |
| Sutures | Acuderm | SUP3524 | |
| Flexible bandage | Fisher Scientific | 22-363-100 | |
| Non-adherent dressing | TELFA | 1050 | |
| Materials | |||
Wash solution PBS Dispase solution HBSS Neutralizing media HBSS Polybrene solution HBSS |
|||
References
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