Summary
ऊतक विशेष एक बाल कूप उत्थान lentivirus का उपयोग करने के लिए लाभ या हानि का समारोह मध्यस्थता के मॉडल का विश्लेषण.
Abstract
बाल कूप morphogenesis, एक जटिल प्रक्रिया epithelia व्युत्पन्न keratinocytes और अंतर्निहित mesenchyme के बीच बातचीत की आवश्यकता होती है, एक आकर्षक मॉडल अंग विकास और ऊतक विशेष के संकेत का अध्ययन करने के लिए प्रणाली है. हालांकि बाल कूप विकास आनुवंशिक विनयशील, इस प्रक्रिया के लिए आवश्यक कारकों में से तेजी से और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य विश्लेषण एक चुनौती बनी हुई है. यहाँ हम एक लक्षित overexpression या एक ऊतक विशेष तरीके में lentivirus का उपयोग करने वाले कारकों के shRNA की मध्यस्थता पछाड़ना उत्पन्न करने की प्रक्रिया का वर्णन करता है. एक बाल उत्थान 5 मॉडल, 6, 11 का एक संशोधित संस्करण का उपयोग करना है, हम मजबूत लाभ या नुकसान का समारोह प्राथमिक माउस keratinocytes या त्वचीय कोशिकाओं में विश्लेषण उपकला-mesenchymal संकेत दे रास्ते कि बाल कूप morphogenesis नेतृत्व के अध्ययन की सुविधा प्राप्त करने के लिए कर सकते हैं . हम वर्णन कैसे अलग करने के लिए ताजा प्राथमिक माउस keratinocytes और त्वचीय कोशिकाओं है, जो त्वचीय papilla कोशिकाओं और उनके पूर्ववर्ती होते, lentivirus contai वितरित करने के लिएएक सेल आबादी के लिए या तो shRNA या सीडीएनए ning, और कोशिकाओं को गठबंधन करने के लिए पूरी तरह का गठन नग्न चूहों की पीठ पर बालों के रोम उत्पन्न. इस दृष्टिकोण ऊतक विशेष के तीन सप्ताह के भीतर बालों के रोम को उत्पन्न करने के लिए आवश्यक कारकों का विश्लेषण की अनुमति देता है और मौजूदा आनुवंशिक मॉडल के लिए एक तेज और सुविधाजनक साथी प्रदान करता है.
Protocol
1. त्वचा विच्छेदन के लिए 0 से 2 दिनों के पुराने नवजात चूहों की तैयारी
- माउस कम से कम 20 मिनट के लिए एक सीओ 2 कक्ष का उपयोग पिल्ले euthanize. विच्छेदन जब तक एक घंटे के लिए बर्फ पर पिल्ले छोड़ें. P0-P2 चूहों अत्यधिक बड़े चूहों से तैयार कोशिकाओं के रूप में सिफारिश कर रहे हैं पूर्वज क्षमता को कम कर दिया है कि कम भ्रष्टाचार की पैदावार में परिणाम. 70% इथेनॉल के एक डिश (1.3 चरण के लिए) और धोने के समाधान के तीन व्यंजन (3 चरण के लिए) तैयार जब त्वचा विच्छेदन प्रदर्शन के लिए तैयार है. Dispase समाधान पिघलना और यह 4 पर छोड़ ° सी. सरवाइकल सीओ 2 overexposure के बाद पिल्ले सरकाना के लिए इच्छामृत्यु सुनिश्चित.
- बर्फ और एक बाँझ प्रवाह हुड के स्थानांतरण पर एक संस्कृति डिश में euthanized पिल्ले रखें.
- संक्षेप में 70% और बाँझ संस्कृति डिश पर इथेनॉल जगह में डुबो कर पिल्ले धो लें.
2. माउस त्वचा टुकड़े करना
- बंद और बाँझ कैंची के साथ धड़ के आधार पर प्रत्येक अंग पूंछ कट.
- शरीर घन की एक जोड़ी के बीच मजबूती से समझrved संदंश और सिर से पूंछ अंतर्निहित प्रावरणी मर्मज्ञ बिना एक स्केलपेल का उपयोग पृष्ठीय त्वचा के साथ एक चीरा बनाने.
- ध्यान से माउस के midline से दूर त्वचा छील.
- घुमावदार संदंश के लंबे पक्ष मजबूती के साथ उजागर माउस और मुट्ठी डालने के माउस के पीछे अंत में त्वचा के नीचे घुमावदार संदंश की एक जोड़ी और धीरे माउस के उदर आधे की ओर कूल्हों पर त्वचा खींच.
- ध्यान माउस पूरी तरह से बंद एक निर्बाध गति में त्वचा छील और लोथ त्यागें.
3. Dispase समाधान के साथ धो त्वचा और सेते
- Dermis पक्ष के साथ धोने समाधान की पहली पकवान में त्वचा के नीचे रखें. त्वचा से बाहर फैला और संदंश के साथ को उत्तेजित करना है. धो समाधान के 1 पकवान में त्वचा छोड़ दो जबकि अगले त्वचा विदारक.
- धो समाधान के 1 पकवान में अगले dissected त्वचा रखने के बाद, धोने के समाधान के दूसरे पकवान पूर्व त्वचा हस्तांतरण. वें में खाल रखेंई 2 धोने समाधान जब तक सभी खाल एकत्र कर रहे हैं. अंतिम धोने के लिए खाल के सभी स्थानांतरण, संक्षेप को उत्तेजित करना है.
- एक बाँझ 10 सेमी संस्कृति डिश 10 मिलीलीटर बर्फ के ठंडे Dispase जोड़ें. Dispase समाधान त्वचा स्थानांतरण और dermis ओर त्वचा के नीचे समतल.
- 4 में 8-16 घंटे के लिए त्वचा फ्लोट ° C (वैकल्पिक विकल्प: 37 पर 1 घंटा डिग्री सेल्सियस).
4. अलग डर्मिस और एपिडर्मिस
- एक नया बाँझ संस्कृति डिश त्वचा स्थानांतरण और dermis ओर त्वचा के नीचे समतल. ध्यान एक स्केलपेल के साथ एक कोने से नीचे dermis पकड़.
- संदंश के साथ epidermis समझ और धीरे धीरे छील dermis से दूर. एपिडर्मिस दूर छील एक टुकड़े के रूप में होना चाहिए. epidermis सफेद और पतली हो और dermis भूरा, मोटा, और पतला होना चाहिए.
- अलग बाँझ संस्कृति बर्तन में अलग दो ऊतकों.
- एक चमड़े का विशिष्ट जीन भ्रष्टाचार / पछाड़ना overexpression, dermis ले और टी के साथ बहुत छोटे टुकड़ों में बोटी - बोटी करनाwo नलियां. Epidermis त्यागें. संक्रमण (7 कदम) के दिन, माउस खाल का एक और सेट काटना ताजा, इलाज epidermal कोशिकाओं lentiviral संक्रमित त्वचीय कोशिकाओं के साथ गठबंधन के लिए तैयार है.
- एक epidermal विशिष्ट जीन भ्रष्टाचार / पछाड़ना overexpression, 6 में प्रत्येक epidermis टुकड़ा - 8 छोटे टुकड़े. Dermis त्यागें. संक्रमण (7 कदम) के दिन, माउस खाल का एक और सेट काटना ताजा, अनुपचारित त्वचीय कोशिकाओं lentiviral संक्रमित epidermal कोशिकाओं के साथ गठबंधन के लिए तैयार है.
5. कीमा ऊतक से प्राथमिक माउस त्वचीय कोशिकाओं (mDCs) अलग कर देना
- ताजा बना 1 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर Collagenase समाधान के साथ त्वचीय टुकड़े incubating द्वारा mDCs अलग कर देना. पिल्ला माउस प्रति Collagenase समाधान के 10 मिलीलीटर का प्रयोग करें.
- धीरे समाधान युक्त dermis हर 10 मिनट मिश्रण. एक खुर्दबीन के नीचे हदबंदी की हद तक की जाँच करें, पचा सेल निलंबन ज्यादातर एकल कक्षों होना चाहिए. समाधान स्पष्ट से बादल छाए रहेंगे के रूप में बदलना चाहिएत्वचीय कोशिकाओं dermis से अलग कर रहे हैं.
- Collagenase समाधान के लिए एक 10% अंतिम मात्रा dermis युक्त कोलैजिनेज की गतिविधि को कम FBS जोड़ें.
- एक नया 50 मिलीलीटर ट्यूब बड़े पचाया नहीं clumps और पूरे के रोम को हटाने में एक 70 सुक्ष्ममापी सेल झरनी के माध्यम से सेल निलंबन पास. की 30 मिलीलीटर प्रति DMEM/10% FBS की 10 मिलीलीटर जोड़ें प्रवाह के माध्यम से करने के लिए आगे कोलैजिनेज जलमिश्रित.
- 5 मिनट के लिए आगे पूरे के रोम को हटाने के लिए एक tabletop अपकेंद्रित्र पर 30 XG पर अपकेंद्रित्र ट्यूबों पचा dermis युक्त.
- ध्यान से एक नया 50 मिलीलीटर ट्यूब तैरनेवाला हस्तांतरण. 5 मिनट के लिए एक tabletop अपकेंद्रित्र पर 200 XG centrifuging द्वारा गोली कोशिकाओं.
- Resuspend DMEM/10% FBS के साथ कोशिकाओं (पिल्ला प्रति 1 मिलीग्राम) और कोशिकाओं गिनती. संक्रमण के लिए Amniomax सी 100 मीडिया (7 कदम) के साथ प्लेट कोशिकाओं, या ग्राफ्टिंग (9 कदम) के लिए lentivirus संक्रमित के.सी. के साथ गठबंधन करने के लिए. ठेठ उपज 20 x 10 पिल्ला प्रति 6 कोशिकाओं है.
6. प्राथमिक केरेटिनकोशिकाएं अलग कर देनाकीमा ऊतक से (सी)
- हौसले से thawed 0.05% ट्रिप्सिन-EDTA epidermal टुकड़े के साथ 15 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर incubating द्वारा के.सी. अलग कर देना. ट्रिप्सिन-EDTA के पिल्ला माउस प्रति 7 मिलीलीटर का प्रयोग करें.
- धीरे ज़ुल्फ़ हर 5 मिनट epidermis युक्त समाधान.
- Trypsin की गतिविधि को कम करने के लिए ट्रिप्सिन EDTA युक्त epidermis उदासीन समाधान के बराबर मात्रा में जोड़ें.
- 5 मिनट के लिए एक tabletop अपकेंद्रित्र पर 200 XG centrifuging द्वारा गोली कोशिकाओं. शेष पचाया नहीं ऊतक शीर्ष पर नाव चाहिए.
- सावधानी से पचाया नहीं ऊतक के साथ सतह पर तैरनेवाला के सबसे डालना. परेशान सेल गोली के बिना एक 10 मिलीलीटर विंदुक के साथ शेष तैरनेवाला निकालें. पीबीएस के साथ सेल गोली Resuspend. मामले KCS में pelleted पूरी तरह से नहीं कर रहे हैं, बंद तैरनेवाला की सबसे डालना और centrifugation दोहराएँ जब तक कोशिकाओं के अधिकांश pelleted हैं.
- 70 सुक्ष्ममापी सेल झरनी के माध्यम से एक नया ट्यूब में सेल निलंबन शेष ऊतक या clumps को दूर करने के लिए तनाव.
- Centrifuging द्वारा गोली कोशिकाओं5 मिनट के लिए एक tabletop अपकेंद्रित्र पर 200 XG पर.
- CNT मीडिया 07-या पीबीएस (पिल्ला प्रति 1 मिलीग्राम) और गिनती की कोशिकाओं में Resuspend कोशिकाओं. संक्रमण के लिए चढ़ाना कोशिकाओं (7 कदम) के लिए CNT-07 का प्रयोग करें, Pbs उपयोग ग्राफ्टिंग (9 कदम) के लिए lentivirus संक्रमित mDCs के साथ गठबंधन है. ठेठ उपज 3-10 x 10 पिल्ला प्रति 6 कोशिकाओं है.
7. ShRNA या सीडीएनए युक्त lentivirus के साथ प्राथमिक कोशिकाओं को संक्रमित
संक्रमण के दिन पर माउस की खाल के एक और सेट काटना लिए ताजा, इलाज प्राथमिक KCS या mDCs ग्राफ्टिंग (9 कदम) के दिन पर वायरस से संक्रमित कोशिकाओं के साथ गठबंधन को तैयार है.
- लिए mDCs, 4 प्लेट 10 x 10 सेमी प्रति प्लेट 37 AmnioMAX-C100 पर मीडिया और सेते के साथ 6 mDCs ° सी + अगले दिन के संक्रमण के लिए 5% 50% घनत्व सेल में सीओ 2. MDCs आमतौर पर 3-4 प्लेटों को एक अनुचित लाभ कमाने की चेष्टा करना उत्पन्न करने के लिए उपयोग किया जाता है, और 10-12 प्लेटों के कुल एक प्रयोग में तीन grafts उत्पन्न करने के लिए की जरूरत है. वैकल्पिक रूप से, mDCs देते हैं और च फैलया 37 में 2 घंटे की एक न्यूनतम ° C + 5% सीओ 2 और संक्रमण सेल चढ़ाना के एक ही दिन प्रदर्शन. mDCs आकारिकी fibroblast की तरह होगा.
- के.सी. के लिए, 12 प्लेट x 10 CNT 07 और 37 पर मीडिया सेते साथ 6 10 सेमी प्रति प्लेट के.सी. ° सी + अगले दिन के संक्रमण के लिए 5% सीओ 2. वैकल्पिक रूप से, चलो, के.सी. देते हैं और 37 में 2 घंटे की एक न्यूनतम के लिए फैल ° C + 5% सीओ 2 और उसी दिन पर संक्रमण प्रदर्शन. के.सी. के आमतौर पर 3-4 प्लेटों को एक अनुचित लाभ कमाने की चेष्टा करना उत्पन्न करने के लिए उपयोग किया जाता है. कुल 10-12 प्लेटों के एक प्रयोग के लिए तीन grafts उत्पन्न करने के लिए की जरूरत है. KCS cobblestone आकारिकी होगा.
- 8/37 ग्राम मिलीलीटर Polybrene समाधान ° C 2 + 5% सीओ के साथ 5-10 मिनट के लिए कोशिकाओं Preincubate.
- Exchange मीडिया और lentivirus जोड़ें + 8 / ग्राम मिलीलीटर Polybrene समाधान. Lentiviral अनुमापांक का निर्माण किया है और संक्रमण से पहले निर्धारित किया जाना चाहिए के आधार पर अलग अलग होंगे.
- 200 XG प्लेटें 32 में 1 घंटे के लिए एक tabletop अपकेंद्रित्र पर अपकेंद्रित्र °Lentivirus साथ कोशिकाओं को संक्रमित सी.
- Lentivirus युक्त मीडिया निकालें और ताजा मीडिया जोड़ें. के.सी. के लिए, कोशिकाओं पीबीएस के साथ एक बार वापस ताजा मीडिया को जोड़ने से पहले धो लो. आमतौर पर संक्रमित कोशिकाओं को 37 पर रात भर ° C + 5% सीओ 2 ठीक हो. वैकल्पिक रूप से, 37 में वसूली के कम से कम दो घंटे की अनुमति ° सी + grafts के लिए कोशिकाओं को trypsinizing पहले 5% सीओ 2. संक्रमित कोशिकाओं के एक छोटे से हिस्से की संस्कृति के लिए जारी करने के लिए संक्रमण दक्षता के लिए जांच के रूप में प्रतिनिधि परिणाम खंड में वर्णित है.
8. ग्राफ्टिंग के लिए संक्रमित कोशिकाओं को तैयार
- 4-6 चरणों का उपयोग कर त्वचा से ताजा प्राथमिक mDCs या KCS अलग. बर्फ के ठंडे बाँझ पीबीएस में Resuspend कोशिकाओं. कोशिकाओं गिनो.
- त्वचीय विशिष्ट जीन भ्रष्टाचार / पछाड़ना overexpression के लिए, 37 डिग्री सेल्सियस में 8 मिनट के लिए 0.05% ट्रिप्सिन-EDTA का उपयोग प्लेटों से संक्रमित mDCs को अलग कर देना.
- Epidermal विशिष्ट जीन भ्रष्टाचार / पछाड़ना overexpression, प्लेटें उसी से संक्रमित के.सी. को अलग कर देना37 में 0.125% ट्रिप्सिन-EDTA एनजी ° सी 15 मिनट के लिए.
- बेअसर trypsin गतिविधि DMEM 10 +% FBS (mDCs) या उदासीन समाधान (सी) का उपयोग. एक 50 मिलीलीटर ट्यूब trypsinized कोशिकाओं में स्थानांतरित.
- 5 मिनट के लिए एक tabletop अपकेंद्रित्र पर 200 XG centrifuging द्वारा गोली कोशिकाओं.
- बर्फ के ठंडे बाँझ पीबीएस में Resuspend कोशिकाओं. कोशिकाओं गिनो.
- हौसले से तैयार अनुपचारित समकक्ष सेल प्रकार के वायरस से संक्रमित कोशिकाओं का मिश्रण. एक अनुचित लाभ कमाने की चेष्टा करना, 7-10 x 10 बर्फ ठंड बाँझ पीबीएस और एक tabletop अपकेंद्रित्र में सेल घोल गोली में 6 KCS साथ 4 डिग्री सेल्सियस पर 7-10 x 6 10 mDCs गठबंधन 50 -100 μl बर्फ ठंड बाँझ पीबीएस में Resuspend कोशिकाओं. बर्फ पर कोशिकाओं रखें जब तक परमाणु / परमाणु माउस कक्षों के लिए तैयार हैं.
9. परमाणु / परमाणु माउस की पीठ पर घाव बिस्तर और फिक्स चैंबर बनाएँ
कलम बांधने का काम एक दिन पहले, आटोक्लेव और बाँझ सिलिकॉन कक्षों के साथ 70% इथेनॉल में भिगोने से सर्जिकल उपकरण बाँझ. 70% etha बदलेंबाँझ पीबीएस के साथ कक्षों का उपयोग करने से पहले nol.
- Anesthetize परमाणु / परमाणु माउस (7-12 सप्ताह पुरानी महिलाओं) intraperitoneal इंजेक्शन (100 μl/10 शरीर के वजन छ) या अन्य पसंदीदा विधि के माध्यम से ketamine (8 मिलीग्राम / एमएल) / xylazine (1.6 मिग्रा / मिली) का उपयोग. लागू आँख स्नेहक. माउस के तहत प्लेस हीटिंग पैड.
- आयोडीन के साथ नग्न माउस वापस त्वचा कीटाणुरहित और शराब swabs के साथ साफ.
- 1-3 0.25% चीरा साइट Bupivicaine topically बूँदें जोड़ें. संदंश के साथ गर्दन के आधार पर नंगा माउस वापस त्वचा चुटकी.
- बाँझ कैंची से pinched त्वचा में एक छोटे परिपत्र छेद (~ व्यास में 1 सेमी) काटें.
- घाव बिस्तर पर बाँझ कक्ष रखें और त्वचा के आसपास के साथ कक्ष किनारों को कवर.
- चैम्बर किनारों के साथ sutures (चैम्बर प्रति 6 टांके) के रूप में चित्रा 2A में दिखाया के साथ जगह में सुरक्षित कक्ष.
- जब कक्षों तैयार कर रहे हैं, धीरे ज़ुल्फ़ सेल गारा और 23 गेज 1 मिलीलीटर सिरिंज जुड़ी सुई में आकर्षित. यदि सेल घोल तल पर सघन है धीरे,सुई में ड्राइंग से पहले 1 मिलीलीटर विंदुक टिप के साथ resuspend.
- सुई के साथ पंचर चैम्बर और धीरे धीरे घाव पर कोशिकाओं ड्रिप.
- साफ, autoclaved पिंजरों में जगह चूहों. हाउस पिंजरे प्रति 2 चूहों और पीने के पानी के लिए एंटीबायोटिक दवाओं और Tylenol (3 मिलीग्राम / एमएल) जोड़ने. हमारे अनुभव में, पिंजरे प्रति दो मादा चूहों के चैम्बर के लिए प्रतिकूल आघात, भ्रष्टाचार, या जानवरों में नहीं हुई है.
- आधे पिंजरे में वार्मिंग पैड प्लेस और चूहों का पालन जब तक संज्ञाहरण बंद पहनता है.
10. 7-9 दिनों के बाद चैंबर निकालें
- 9.1 चरण में संभाग / परमाणु परमाणु माउस anesthetize. लागू आँख स्नेहक.
- चैम्बर के आसपास की त्वचा को आयोडीन के साथ और कीटाणुरहित शराब swabs के साथ साफ.
- ध्यान टांके कटौती और कक्ष से हटा दें.
- धीरे माउस से कक्ष हटा दें. यदि नए त्वचा चैम्बर भ्रष्टाचार चिपक संदंश का उपयोग कर कक्ष से कक्ष का हिस्सा है और धीरे अलग अनुचित लाभ कमाने की चेष्टा करना उठा. भ्रष्टाचार कक्ष के हटाने के दौरान नीचे पकड़ो. भ्रष्टाचार शौचालय चाहिएकश्मीर सुस्त और चित्रा 2B में के रूप में अपारदर्शी है.
- खुला और जगह (2 टाँके) में घाव सीवन पर एंटीबायोटिक दवाओं की एक पतली फिल्म के साथ एक गैर पक्षपाती पैड लागू करें.
- पैड सुरक्षित और घाव की रक्षा के लिए माउस के चारों ओर पट्टी लपेटें. जगह में पट्टी सीवन.
- सिलिकॉन कक्षों हल्के साबुन के साथ scrubbing द्वारा साफ कर रहे हैं और अच्छी तरह से विआयनीकृत पानी से rinsed. 70% रातोंरात इथेनॉल, शुष्क हवा, और दुकान में कक्षों भिगोएँ.
11. बाल विकास के लिए माउस की जांच
- चैम्बर हटाने के 3 दिनों के बाद पट्टियों और पैड निकालें. भ्रष्टाचार शुष्क और भूरे रंग में अपारदर्शी होना चाहिए.
- बाल विकास के लिए चूहों समय समय पर जांच. बाल अनुचित लाभ कमाने की चेष्टा करना के बाद 16 दिनों में दिखाने शुरू करना चाहिए.
प्रक्रिया को रेखांकित
1 दिन (2-3 घंटा): नवजात पिल्ले बलिदान, त्वचा को हटा दें, और 4 ° C रातोंरात के पर dispase पर छोड़ दें.
2 दिन (2-3 घंटा): त्वचा से प्राथमिक कोशिकाओं को अलग औरसिफारिश की सेल घनत्व में थाली.
3 दिन (3-4 घंटा): lentivirus साथ कोशिकाओं को संक्रमित. नवजात पिल्ले के दूसरे सेट से त्वचा निकालें और 4 ° C रातोंरात के में dispase पर छोड़ दें.
4 दिन (6-8 घंटा): प्राथमिक कोशिकाओं को अलग से त्वचा, गिनती, और बर्फ पर छोड़ दें. Trypsinization और centrifugation द्वारा ठीक lentivirus संक्रमित कोशिकाओं, गिनती, और अनुचित लाभ कमाने की चेष्टा करना प्रति 50-100 पीबीएस μl में 7-10 x 10 6 त्वचीय कोशिकाओं और keratinocytes गठबंधन. माउस पर घाव बिस्तर बनाएँ, चैम्बर देते हैं, और सेल मिश्रण को लागू करने के लिए बिस्तर घाव.
वैकल्पिक प्रक्रिया की रूपरेखा
वैकल्पिक प्रक्रिया की रूपरेखा तीन चार दिनों से प्रक्रिया को छोटा होगा.
- माउस खाल dispase में एक घंटे (अनुमानित समय 5-7 घंटा) के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इलाज करने से दिन 1 और 2 दिन का मिश्रण.
- Lentivirus साथ दो घंटे के लिए चढ़ाना कोशिकाओं (अनुमानित समय 5-7 घंटा) के बाद कोशिकाओं को संक्रमण से 2 दिन और 3 दिन से जुडा है.
Representative Results
चित्रा 1 में हम एक तीन सप्ताह पुरानी पुनर्योजी बाल भ्रष्टाचार में त्वचीय विशिष्ट smoothened (एसएसओ) के एक महत्वपूर्ण घटक संकेत श्श्श lentiviral shRNA पछाड़ना का परिणाम दिखाते हैं. Lentiviral वेक्टर नियंत्रण का उपयोग कर अकेले grafts मजबूत बाल विकास (चित्रा 1 ए) दिखा. इसके विपरीत करके, बाल विकास (चित्रा 1 बी) के नुकसान में एसएमओ परिणामों के त्वचीय विशिष्ट पछाड़ना. Hematoxylin और लाल भामसान रंग दाग नियंत्रण में बालों के रोम और प्रयोगात्मक शर्तों (चित्रा 1C, डी) के स्तर को दर्शाया गया है. इसी तरह के उपचार से बाल विकास phenotype प्रयोगों के बीच में चर lentiviral वेक्टर अकेले संक्रमण के साथ सकारात्मक नियंत्रण सहित, हो सकता है. इसलिए सकारात्मक नियंत्रण grafts हमेशा एक संदर्भ के रूप में grafts के 30% scarring या grafts के अधूरा लगाव का एक परिणाम के रूप में असफल हो सकता है के रूप में हर प्रयोग में शामिल किया जाना चाहिए. एक कारक की सीडीएनए overexpressing जैसे दो कारकों के बीच एक संवाद का परीक्षण करने के लिए फिर से करने के मामले मेंएक और पहलू की scue shRNA की मध्यस्थता पछाड़ना, एक हमेशा अकेले पछाड़ना प्रत्येक प्रयोग में परिणाम प्रकट नुकसान का समारोह grafts करने के लिए शामिल करना चाहिए. यह एक आवश्यक सीमा निर्धारित करने के लिए कैसे एक विशेष जीन बाल कूप के उत्थान के मार्ग और कैसे दो जीन बातचीत perturbs प्रदान करेगा.
चैम्बर (2A चित्रा) के हटाने सावधानी से किया जाना चाहिए. नवगठित अनुचित लाभ कमाने की चेष्टा करना थोड़ा सुस्त सतह (चित्रा 2B) के साथ अपारदर्शी होना चाहिए. अनुचित लाभ कमाने की चेष्टा करना चैम्बर के लिए छड़ी, तो धीरे एक तरफ उठाने लगता है भ्रष्टाचार घाव बिस्तर के साथ संलग्न रहता है के लिए महत्वपूर्ण है. भ्रष्टाचार के तीन दिन बाद काफी स्थिर है और थोड़ा मुश्किल पेश जब ड्रेसिंग को हटाने चाहिए. मजबूत बाल विकास तीन सप्ताह (चित्रा 2C) के बाद मनाया जाना चाहिए. छोड़ना या तो mDCs या KCS एक बरामद बिना किसी भी बाल (चित्रा 2 डी) 11 घाव साइट में परिणाम देगा. सेल या एक में सेल नुकसान की मौतकोई बालों में सेल प्रकार भी त्वचीय एसएमओ पछाड़ना में कम बाल उत्थान के रूप में चित्रा 1 बी में दिखाया के विपरीत में, परिणाम है.
एक सफल परख सुनिश्चित करने के लिए है, यह महत्वपूर्ण है 90% से अधिक ग्राफ्टिंग कोशिकाओं के वायरल संक्रमण से पहले हासिल उपयुक्त overexpression या पछाड़ना दक्षता के साथ. कलम बांधने का काम प्रक्रिया के समय की कमी के कारण, हम एक ग्राफ्टिंग प्रयोग शुरू करने से पहले मुसीबत शूटिंग वायरल संक्रमण क्षमता की सलाह देते हैं, और हमेशा प्रक्रिया कलम बांधने का काम के दिन पर कोशिकाओं के एक छोटे से हिस्से को बचाने के लिए हानि या लाभ की अभिव्यक्ति की पुष्टि. Lentiviral अनुमापांक का निर्माण किया है और पहले संक्रमण 90-100% दक्षता प्राप्त करने के लिए निर्धारित किया जाना चाहिए के आधार पर अलग अलग होंगे. हम GFP साथ वायरल संक्रमण दक्षता lentiviral वेक्टर से coexpressed की निगरानी. हम नियमित रूप से मात्रात्मक पीसीआर और या वेस्टर्न ब्लॉट / प्रदर्शन पछाड़ना या overexpression की सीमा निर्धारित है. फ्लोरोसेंट टैग के साथ दोहरे अभिव्यक्ति वैक्टर उपयोग करने के लिए लेबलvirally संक्रमित कोशिकाओं को संकेत और हमारे परिपक्व grafts में constructs व्यक्त कोशिकाओं की संख्या की perdurance की रिपोर्ट के लिए एक रास्ता प्रदान करता है. हम lentiviral वेक्टर एसएमओ shRNA साथ संयोजन में 10 pSicoR सीएमवी GFP से एक सीएमवी प्रमोटर द्वारा संचालित GFP का उपयोग करें. चित्रा 3 में, हम एक 3 सप्ताह पुरानी भ्रष्टाचार जहां त्वचीय विशिष्ट GFP एक प्रतिनिधि बाल कूप के त्वचीय papilla में lentivirally व्यक्त दिखाते हैं.
चित्रा 1. बाल कूप विकास के histological विश्लेषण () त्वचीय खाली lentiviral वेक्टर और अनुपचारित keratinocytes साथ संक्रमित कोशिकाओं के साथ नियंत्रण बाल उत्थान भ्रष्टाचार के (बी) smoothened त्वचीय कोशिकाओं में lentiviral shRNA का उपयोग पछाड़ना बालों के रोम के नुकसान में इलाज keratinocytes परिणामों के साथ संयुक्त है. (सी) Hematoxylin और लाल भामसान रंग धुंधला हो जाना ऐनाजेन बाल च से पता चलता हैनियंत्रण grafts में ollicles dermis में नीचे विस्तार और (डी) smoothened पछाड़ना बालों के रोम अवरुद्ध और काफी हद तक अनुपस्थित रहते हैं. सभी छवियों कलम बांधने का काम तीन सप्ताह के बाद कर रहे हैं. पैमाने बार 100 सुक्ष्ममापी अर्थ.
चित्रा 2. प्राथमिक कोशिकाओं (ए) sutured कक्ष आवास प्राथमिक त्वचीय कोशिकाओं और keratinocytes के साथ परमाणु परमाणु माउस / ग्राफ्टिंग. (बी) के चैम्बर के हटाने के नव त्वचा कि सुस्त और चरित्र में अपारदर्शी है का गठन उजागर (सी) भ्रष्टाचार पूर्ण विकसित बाल जंगली का उपयोग करते हुए ग्राफ्टिंग के बाद प्राथमिक त्वचीय कोशिकाओं और तीन सप्ताह में keratinocytes लिखें. (डी) keratinocytes बिना प्राथमिक त्वचीय कोशिकाओं के अलावा तीन सप्ताह के बाद कोई बाल की ओर जाता है. इसी तरह के परिणाम त्वचीय कोशिकाओं के बिना प्राथमिक keratinocytes के अलावा के साथ देखा जाता है.
चित्रा 3. एक 3 सप्ताह पुराने पुनर्जीवित भ्रष्टाचार से त्वचीय papilla की त्वचीय papilla में GFP अभिव्यक्ति का रखरखाव. Confocal छवियों. GFP त्वचीय सेल की आबादी में एक lentiviral वेक्टर से व्यक्त की गई थी और त्वचीय papilla (हरा) में पाया. Versican (लाल) demarcates त्वचीय papilla और नाभिक Hoechst (नीला) के साथ लेबल थे. नोट GFP त्वचीय कोशिकाओं में विशेष रूप से है, लेकिन आसपास के keratinocytes में व्यक्त की है. स्केल बार 20 सुक्ष्ममापी अर्थ.
Discussion
बाल पुनर्गठन assays डी Novo बाल कूप गठन की व्यवस्था की जांच के लिए एक अनूठा अंग उत्थान मॉडल प्रदान करते हैं. यहाँ, हम एक संशोधित कक्ष बाल बाल कूप गठन में जीन समारोह का निर्धारण करने के लिए उपयोगी परख का वर्णन करता है. हमारी परख रिपोर्ट चैम्बर बाल पुनर्गठन 5 परख, 6,11, जो हम एक lentiviral अभिव्यक्ति या चमड़े या epidermal प्रकार की कोशिकाओं में जीन overexpression या पछाड़ना हासिल तकनीक परिचय संशोधित पर आधारित है. हमारी परख एक तेजी से ऊतक विशेष आनुवंशिक पीटा पैदा करने के लिए विकल्प प्रदान करता है. इस परख हमें जीन समारोह के रूप में छोटे रूप में तीन हफ्तों में भ्रष्टाचार संग्रह करने के लिए lentivirus साथ प्राथमिक कोशिकाओं को संक्रमित करने से बाल कूप गठन में प्रदर्शित करने के लिए अनुमति देता है. हमारी परख के लिए आनुवंशिक lentivirus द्वारा एक सेल 12 प्रकार में संयोजन shRNA / सीडीएनए वितरण का उपयोग कर बातचीत के लिए बढ़ाया जा सकता है, के रूप में के रूप में अच्छी तरह से चमड़े और epidermal सेल typ के बीच संकेत के परीक्षा की अनुमति देता हैतों.
हमारे बाल परख सर्वश्रेष्ठ बाल कूप उत्थान में मजबूत लाभ या हानि का समारोह phenotypes का पता लगाने के लिए अनुकूल है, जबकि सूक्ष्म दोष निरीक्षण करने के लिए कठिन हैं. हम सफलतापूर्वक त्वचीय हमारे बाल उत्थान 1,12 परख का उपयोग कुछ जीनों के विशिष्ट जीन समारोह का प्रदर्शन किया है. Lentivirus वेक्टर 10 shRNA व्यक्त GFP मार्कर के आधार पर सह व्यक्त की, हम प्रदर्शन है कि दाता त्वचीय कोशिकाओं व्यक्त shRNA पुनर्जीवित बाल grafts में बनी. GFP पॉजिटिव कोशिकाओं को पुनर्जीवित बालों के रोम (3 चित्रा) के त्वचीय papilla (डीपी) में मौजूद थे. डी पी सेल की संभावना के रूप में जीन पछाड़ना के विभिन्न स्तरों के शामिल कोशिकाओं GFP के स्तर अलग व्यक्त की है, इस तरह से मनाया बाल कूप phenotype रेंज आनुवंशिक hypomorph से एक अशक्त करने के लिए गया था.
इस परख के लिए एक सुधार के लिए उच्च shRNA व्यक्त की कोशिकाओं के लिए एक त्वरित और कारगर चयन graftin पहले स्थापित हो जाएगाछ FACS का उपयोग करने के लिए मजबूत GFP-व्यक्त कोशिकाओं को शुद्ध के रूप में. एक विकल्प के लिए इस परख में 9 उत्परिवर्ती या सशर्त पीटा कोशिकाओं विकल्प है. दूसरी ओर, एक संस्कृति प्रणाली है कि डी पी सेल समारोह की रक्षा कर सकते हैं बहुत ही उपयोगी है डी पी शक्ति के रूप में धीरे - धीरे एक बार प्राथमिक त्वचीय कोशिकाओं passaged खो दिया है. संभावित संस्कृति प्रणालियों कृत्रिम आला या एकत्रीकरण 2,7,8,13 संस्कृतियों से व्युत्पन्न biomaterials का उपयोग शामिल है. एक और सुधार करने के लिए एक उच्च सेल वसूली दर के साथ एक विश्वसनीय epidermal सेल ठंड विधि के रूप में इस माउस पिल्ले के दूसरे सेट (7 कदम) के उपयोग को कम करने के लिए चमड़े का विशिष्ट नुकसान या ताजा keratinocytes उत्पन्न होगा उत्पन्न होगा लाभ समारोह का अध्ययन करता है.
इस कक्ष बाल परख बाल कूप घनत्व और सामान्य माउस त्वचा के लिए इसी तरह की गुणवत्ता का उत्पादन, हालांकि बाल विकास थोड़ा कम सिंक्रनाइज़ और कूप उन्मुखीकरण अधिक यादृच्छिक है. बाल उत्थान आनुवंशिक परख की कुछ सीमाएँ समेतlentivirus और सेल नंबर की एक बड़ी राशि की आवश्यकता है, और यह शल्य चिकित्सा पद्धतियों के मामले में बहुत श्रम गहन जब बाल पैच और प्रालंब assays 3,4,14 के रूप में पुनर्गठन assays के अन्य रूपों की तुलना में है. हालांकि, बालों के रोम और समय की गुणवत्ता का पता लगाने के लिए बाल विकास अन्य 4 assays के लिए बेहतर है. हमारे लक्षित बाल उत्थान परख मौजूदा आनुवंशिक मॉडल के लिए एक तेज और सुविधाजनक साथी प्रदान करता है.
Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
यह काम NIH एनआरएसए (SXA) 1F32CA14208701 और NIH (AEO और डब्ल्यू मेगावाट) AR052785 और AR046786 अनुदान द्वारा समर्थित किया गया.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PBS | Invitrogen | 14190-144 | |
| HBSS | Invitrogen | 14170-122 | |
| DMEM | Invitrogen | 11995-065 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Invitrogen | 25200-056 | |
| Cnt-07 | Cell N Tec | CnT-07 | |
| AminoMAX-C100 | Invitrogen | 17001-074 | |
| AminoMAX-C100 Supplement | Invitrogen | 12556-015 | |
| FBS | Invitrogen | 26140-079 | |
| Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | |
| Fungizone | Invitrogen | 15290-018 | |
| Gentamycin | Invitrogen | 15710-064 | |
| Dispase | Roche | 4942078001 | |
| Collagenase, Type 1 | Sigma | C-0130 | |
| Polybrene | Sigma | 107689-10G | |
| Tissue culture dish | Fisher Scientific | 08-772E | |
| Dissecting Scissors | Fisher Scientific | 11-999 | |
| Forceps | Fisher Scientific | 10-275 | curved |
| Scalpal | Medex Supply | GRF-2975#10 | Size no. 10 |
| 70 μm cell stainer | VWR | 21008-952 | |
| 15 ml conical centrifuge tube | Fisher Scientific | 14-959-49D | |
| Alcohol swabs | Fisher Scientific | 1368063 | |
| 23 gauge needle | Fisher Scientific | 14-821-13F | |
| Eye lubricant | CVS | 8883660 | |
| Providone-lodine swabs | Fisher Scientific | NC0116841 | |
| Silicon Chambers | Renner GmbH | F2U, 30268 | |
| Sutures | Acuderm | SUP3524 | |
| Flexible bandage | Fisher Scientific | 22-363-100 | |
| Non-adherent dressing | TELFA | 1050 | |
| Materials | |||
Wash solution PBS Dispase solution HBSS Neutralizing media HBSS Polybrene solution HBSS |
|||
References
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