Summary
De heterologe biosynthese van erythromycine A door
Abstract
De heterologe productie van complexe natuurlijke producten is een benadering ontwikkeld om de huidige beperkingen en toekomstige mogelijkheden aan te pakken. Het is bijzonder nuttig voor die verbindingen die therapeutische waarde bezitten, maar niet voldoende geproduceerd of zou profiteren van een verbeterde vorm van productie. De betrokken experimentele procedures kunnen worden onderverdeeld in drie componenten: 1) genetische overdracht, 2) heterologe reconstitutie, en 3) productanalyse. Elke experimentele component is onder voortdurende optimalisatie om de uitdagingen te ontmoeten en te anticiperen op de mogelijkheden in verband met deze opkomende benadering.
Heterologe biosynthese begint met de identificatie van een genetische sequentie die verantwoordelijk is voor een waardevol natuurproduct. Overdracht van deze sequentie een heterologe gastheer wordt gecompliceerd door de biosynthese complexiteit verantwoordelijk voor productvorming. Het antibioticum erytromycine A is een goed voorbeeld. Twintig genen (in totaal> 50 kb) zijn vereist voor eventuele biosynthese. Daarnaast zijn drie van deze genen coderen megasynthases, multi-domein enzymen elk ~ 300 kDa in grootte. Dit genetische materiaal moet zodanig zijn ontworpen en naar E. coli voor gereconstitueerd biosynthese. Het gebruik van PCR isolatie, operon constructie, meerdere cystronic plasmiden en electro-transformatie worden beschreven in de overdracht van erytromycine A genetische cluster E. coli.
Het overgezette E. coli cel moet ondersteunen uiteindelijke biosynthese. Dit proces wordt ook uitdagend, gezien de grote verschillen tussen E. coli en meest originele gastheren die verantwoordelijk zijn voor complexe natuurlijke producten formatie. De cel moet noodzakelijk substraten biosynthese ondersteunen en gecoördineerd overgedragen drukken de genetische cluster actieve enzymen. In het geval van erythromycine A, de E. coli cel moest worden ontworpen om de twee voorlopers (pr biedenopionyl-CoA en (2S)-methylmalonyl-CoA) vereist voor biosynthese. Daarnaast werden gensequentie wijzigingen plasmide kopienummer, chaperonine co-expressie, post-translationele modificatie enzymatische en procestemperatuur ook vereist om definitief erythromycine A mogelijk formatie.
Tenslotte moet succesvolle productie worden beoordeeld. Voor het erythromycine A geval we twee methoden. De eerste is vloeistofchromatografie-massaspectrometrie (LC-MS) te bevestigen en te kwantificeren productie. De bioactiviteit van erytromycine A wordt ook bevestigd door het gebruik van een biologische bepaling waarbij de antibiotische activiteit getoetst Bacillus subtilis. De beoordeling assays vestigen erythromycine A biosynthese van E. coli en de weg geëffend voor toekomstige engineering inspanningen te verbeteren of te diversifiëren productie en voor de productie van nieuwe complexe natuurlijke verbindingen met behulp van deze aanpak.
Introduction
Erythromycine A is een polyketide antibioticum geproduceerd door de Gram-positieve bacterie Saccharopolyspora erythraea, en de lopende productie is stapsgewijs verbeterd ~ 10 g / L door decennia van traditionele mutagenese en screening protocollen en recenter door procesoptimalisatie's 1-6. Mutagenese en screening strategieën voor in natuurlijke antibiotica productontwikkeling als gevolg van moeilijkheden bij het kweken en / of genetisch manipuleren natieve productie gastheren en omdat beschikbaar antibiotische werking of verbeterde groei fenotypen aan selectie steun. In het geval van erythromycine A, S. erythraea wordt begrensd door een langzame groei profiel en het ontbreken van meer directe genetische manipulatietechnieken (vergeleken met organismen zoals E. coli), dus belemmert snelle verbetering van de productie en de biosynthese van nieuwe derivaten. Na opname van de productie problemen en ontgrendeld diversificatiop mogelijkheden verbindingen zoals erythromycine A, onderzoekers begon het idee van heterologe biosynthese (figuur 1) 7 oefenen. Deze inspanningen samen met de beschikbare sequentie-informatie voor de erythromycine A gencluster 8-11. Benadrukt moet worden dat het aantal van opeenvolgende complexe natuurlijke product genclusters sterk is 12 tot 16 uitgebreid, die de aanzet tot verdere inspanningen in heterologe biosynthese om gecodeerde therapeutische kracht te openen. Hiertoe heterologe gereconstitueerd de nieuwe gastheer de behoeften van de specifieke biosynthetische route. E. coli biedt technische gemak, een breed verspreid set van moleculair-biologische technieken, en metabole en procestechniek strategieën voor productontwikkeling. Maar vergeleken met natief productie gastheren, E. coli vertoont niet dezelfde mate van complexe natuurlijke product productie. Het was dan ook niet bekend of E. coli kan dienen als een haalbare optie voor heterologe complexe natuurlijke product biosynthese. Er werd aangenomen dat E. coli zou ideaal zijn als gastheerorganisme heterologe biosynthese kon worden.
Met dit doel voor ogen, de eerste pogingen begonnen de polyketide aglycon produceren 6-deoxyerythronolide B (6dEB) tot en met E. coli. Echter, inheemse E. coli metabolisme konden geen aanzienlijke niveaus van propionyl-CoA en (2S)-methylmalonyl-CoA precursors nodig 6dEB biosynthese ondersteunen noch kon de nieuwe gastheer posttranslationeel wijzigen deoxyerythronolide B synthase (DEBS) enzymen. Om deze problemen te verhelpen werd een metabolische route uit natieve en heterologe enzymen ingebouwd in E. coli zodanig dat exogeen gevoed propionaat intracellulair omgezet tot propionyl-CoA en (2S)-methylmalonyl-CoA, tijdens de engineering Dit pad voltooien werd een sfp gen geplaatst in the chromosoom van E. coli BL21 (DE3) een nieuwe stam te produceren BAP1 genoemd. Het enzym is een Sfp phosphopantetheinyl transferase kan bevestigen van de 4'-cofactor phosphopantetheine de DEBS enzymen 17,18. De drie DEBS-genen (elk ~ 10 kb) werden daarna afzonderlijk op twee selecteerbare expressievectoren die induceerbare T7 promoters. Na een correctiesleutel na inductie van temperatuur (22 ° C) werden de DEBS-genen die binnen gecoördineerd BAP1 in een actieve toestand kunnen genereren 6dEB 19.
Het streven naar volledige erytromycine A biosynthese begon toen met een analoog gencluster van Micromonospora megalomicea of een hybride pad bestaat uit genen van S. erythraea, S. fradiae, en S. venezuelae die de tussenproducten erythromycine C en 6-D deoxyerythromycin respectievelijk 20-22 geproduceerd. Onlangs heeft onze groep uitgebreid deze inspanningen door het produceren van erythromycin A (de meest klinisch relevante vorm van erythromycine) tot en met E. coli. In tegenstelling tot eerder werk, onze strategie gecoördineerd sprak de 20 originele S. erythraea genen die nodig zijn voor polyketide biosynthese, deoxysugar biosynthese en gehechtheid, extra tailoring, en zelf-weerstand (figuur 2). In totaal werden 26 (autochtone en heterologe) genen ontworpen om E. coli tegen erytromycine A produceren bij 4 mg / L 23,24. Dit resultaat vastgesteld volledige productie van een complex polyketide natuurlijk product met E. coli en dient als basis om gebruik te maken van deze nieuwe productie-optie of de uitoefening van nieuwe.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Onderstaande tekst is specifiek voor het erythromycine A antibioticum, maar de stappen zijn ontworpen om algemeen toepasbaar op andere natuurlijke producten als kandidaten voor heterologe biosynthese.
1. Erytromycine A Genetic Cluster Transfer
- Ontwerp PCR primers om alle genen geassocieerd met de erythromycine A cluster in de S. amplificeren erythraea chromosoom. Deze stap is specifiek voor die natuurlijke product kandidaten die genetische sequenties bepaald. Alternatief kan de gewenste genen worden gesynthetiseerd (via verschillende commerciële verkoper opties) met als voordeel dat de nieuw gesynthetiseerde genen worden ontworpen voor optimale codongebruik in de nieuwe E. coli gastheer. Als DNA-synthese wordt nagestreefd, wordt een stroom uitdaging genereren megasynthase genen die meer dan 10 kb in lengte. Technisch gezien kan de synthese worden bereikt, maar het is moeilijk en kostbaar. Verwacht wordt dat voortdurende improvemouders in gensynthese technologie aan de huidige nadelen en deze benadering te valideren voor het verstrekken van heterologe genetisch materiaal.
- Voer PCR met vers bereide S. erythraea genomisch DNA als template. Het chromosomale DNA kan worden bereid uit kweken van S. erythraea of bevroren voorraden van de bacterie (Figuur 3) 25. PCR reacties kunnen profiteren van de toevoeging van DMSO (4 pi in 50 pi reacties) om rekening te houden hoog G+ C gehalte in het doel S. erythraea genen. Elke geamplificeerde gen worden gesequenced om te bevestigen dat het volledige gen is opgehaald en dat geen mutaties zijn geïntroduceerd tijdens de PCR proces.
- Door restrictiedigest en ligatie, plaatst elk van de geïsoleerde genen in expressievectoren ontwikkeld voor E. coli (Figuur 3). Dit wordt geïnitieerd door het ontwerpen van restrictieplaatsen in de PCR primers voor digestie en ligatie toestaan in geschikte expression vectoren (een voorbeeld is in figuur 3). We hebben zowel pET21 en pET28 vectoren. De pET28 vector maakt het opnemen van leider een 5 'sequentie die genexpressie geholpen in de erytromycine A case. Bevestigen individuele genexpressie door RT-PCR, SDS-PAGE analyse (met oplosbare proteïnefracties) of gemakkelijk fenotypische testen (figuur 4).
- Construct operons basis genen succes tot expressie van individuele expressieplasmiden (figuur 3). We hebben traditioneel combinaties van compatibele cohesieve restrictie-enzymen (zoals Xba I en Spe I) 24 sequentieel genen converteren naar operons, maar de restrictieplaatsen gekozen operon constructie mag niet wonen in (of worden verwijderd uit) de geïsoleerde gensequenties (een kwestie die kan worden vermeden als gensynthese wordt gebruikt). Deze stap versterkt de 20 erythromycine A genen voor E. coli transformatie. Momenteel hebben wij deze methode te zijn tot 20 kb vreemd DNA in een standaard pET vector (twee genen van ~ 10 kb elk). Verder hebben we deze benadering operons met negen genen. Het is onbekend hoeveel DNA of hoeveel genen kunnen worden geïntegreerd in pET-type plasmiden, maar de metrics aangehaald als referentie voor de gecompliceerde systemen zoals erytromycine biosyntheseroute. Tenslotte standaard in vitro ligatiestappen en daaropvolgende succesvolle transformatie stappen steeds moeilijker als operon en plasmide schaalvergroting. Ligatie temperatuur (12-22 ° C) en tijd (3-24 uur) zijn gevarieerd en electro-transformatie wordt gebruikt voor het productieproces uiteindelijke plasmide constructen steun.
- Transformeer de nieuw ontworpen biosynthetische plasmiden in E. coli-stam BAP1 met behulp van elektro-transformatie (figuur 5). De procedure kan worden uitgevoerd wanneer plasmiden geïntroduceerd sequentiële of in combination. Bij het transformeren size-staat of verschillende plasmiden hebben we traditioneel elektro-transformatie (in tegenstelling tot chemische omzetting). Eenmaal getransformeerd, cellen op de plaat vast LB medium dat tetracycline (5 mg / l), carbenicilline (100 mg / l), kanamycine (50 mg / l), streptomycine (50 mg / l) en apramycin (50 mg / l ) om voor plasmide onderhoud. Het is zeer ongebruikelijk om te gebruiken zes verschillende selectie antibiotica na de transformatie van een E. coli cel, maar wordt simpelweg het aantal plasmiden nodig uiteindelijke erythromycine A mogelijk biosynthese. Terwijl mogelijk is, zal de aanpak beperkt de productiemogelijkheden van de verbinding zodra het kweken is begonnen (zie hieronder).
2. E. coli Biosynthetische Reconstitutie
- Strain BAP1 is ontworpen om de vereiste substraten voor biosynthese bieden en post-translationeel wijzigen deoxyerythronolide B megasynthase. Individuele genen van de erythromycin Een pad zijn getest op genexpressie en geconsolideerd operons in expressieplasmiden. Deze sectie is gewijd aan kweekomstandigheden te testen voor gezamenlijke activiteit van het volledige erytromycine A weg.
- Neem 3 afzonderlijke kolonies van vers getransformeerde BAP1 en beënt 1,5 ml LB kweken die de gewenste plasmide selectie antibiotica (in dezelfde concentraties hierboven te selecteren op transformanten op een vast medium), Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG, 100 uM ) en arabinose (2 mg / ml) om genexpressie en 20 mM natrium propionaat intracellulaire biosynthetische precursor vorming ondersteunen induceren. Zodra de productie is bevestigd, kunnen grotere cultures worden uitgevoerd in een poging te schalen en maximaliseren product titers.
- Cultuur de cellen bij 22 ° C en 250 rpm gedurende 24-48 uur. In dit geval antibioticumselectie zodat de vereiste plasmiden worden gehandhaafd in de vroege stadia van cellulaire cultuur. Echter plasmides kan gemakkelijk verloren selectie antibioticum niveau veranderen tijdens de kweekperiode. Dit kan leiden tot instabiliteit plasmide (dat wil zeggen, het verlies van een of meer plasmiden in cultuur), die dan beperkt productiecapaciteit. Het probleem wordt verergerd wanneer onverenigbaar plasmiden gebruikt om een compleet heterologe gen cluster voeren. Dit is het geval voor de erytromycine Verbinding (Figuur 5) en moeten worden opgevuld net overproductie de verbinding uit E. coli. Echter, voor het demonstreren van de eerste productie, worden dergelijke ontwerpfouten getolereerd omwille van snel om de haalbaarheid van het heterologe benadering.
- Verduidelijken de kweken door centrifugeren bij 10.000 rpm in een Eppendorf microcentrifuge. Verwijder het supernatant en bewaar bij 4 ° C voor analyse.
- In het geval van erythromycine A, geen verbinding productie aangepakt door de toevoeging van de GroES / EL chaperonine (met pGro7specifiek gebrek aan activiteit van de enzymen post-expressie) en de opname van additionele genkopieën (voor die genen verdacht zwakke expressie / activiteit) te pakken. Soortgelijke strategieën kunnen nodig met andere heterologe natuurlijke productiecapaciteit inspanningen.
3. Product Analysis
- Om te bevestigen en te kwantificeren erytromycine A formatie, injecteer de kweeksupernatant op een LC-MS systeem (Figuur 6). Handel verkrijgbare erythromycine A werd gebruikt om de productie bevestigen en als standaard tijdens kwantificering. Voor gevallen zonder handel verkrijgbaar normen, LC-MS analyse extra chemische karakterisering door NMR en hoge resolutie massaspectrometrie.
- Vergelijk de productie tussen de 3 kolonies / culturen uit de BAP1 transformatie. Kies de hoogste producent en bereiden een glycerol voorraad van de kolonie bron. Deze stap kan in parallel met de productie culturen van protocol van2 met een klein gedeelte van de culturen glycerol voorraad te bereiden. Bewaar de glycerol voorraad in een -80 ° C vriezer.
- Met behulp van de bevestigde, hoogste producerende cellen voorraad, beginnen aan een afzonderlijke productie-cultuur en pak de laatste supernatant met 2x volume ethylacetaat. Gebruik een vacuum verdampingssysteem het extract drogen en in 100 pl methanol mengen. Breng het extract een steriele filter disk (~ 1/4 inch diameter) en laat de schijf drogen. Afzonderlijk, cultuur B. Subtillis in LB vloeibaar 's nachts. Voeg 20 ul van het B. subtilis cultuur 20 ml vloeibaar LB-agar bij 45 ° C. Agar plaat en het laten stollen. Plaats de filterschijf op de plaat en incubeer bij 37 ° C (Figuur 7). Alternatief kan het extract worden toegevoegd aan vloeibare culturen in een 96-wells plaat met de activiteit met een plaatlezer (Figuur 7) kwantificeren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Het gewenste resultaat van deze aanpak is de productie van een volledig biologisch actieve natuurlijk product uit de E. coli heterologe gastheer. Dit blijkt het best uit de LC-MS resultaten gebruikt om te bevestigen en te kwantificeren productie (Figuur 6) en het antibacteriële bioassay gebruikt om de laatste activiteit bevestigen (Figuur 7). In de algemene regeling van heterologe biosynthese, dit resultaat definieert succes. Eenmaal bereikt, onderzoeksinspanningen vervolgens tot optimalisatie (zowel op cellulair en proces schalen) en moleculaire engineering. De eindtermen omvatten economische productieprocessen voor de oorspronkelijke verbinding en controle over het heterologe systeem zodanig dat rationele wijzigingen van het proces kan worden verwezen naar varianten van de oorspronkelijke verbinding met de mogelijkheid van een verhoogde activiteit of verbreed spectrum produceren.
Als u de gewenste verbinding te produceren triggers vervolgens tal van rampenplannen to beoordelen welk deel van de aanpak is succesvol biosynthese verbieden. Veel van deze trouble-shooting mechanismen zijn in-gebouwd binnen de hierboven beschreven procedure. In onze ervaring is het van belang, op zijn minst voor succesvolle genexpressie (SDS-PAGE analyse van oplosbare biosynthetische enzymen) van de nieuw geïntroduceerde gen cluster dit na te proberen biosynthese van het gevormde product natuurlijke beoordelen. Na expressie, zoals hierboven aangegeven is het gebruik van eiwitvouwing chaperones, verbeterde genkopieaantal en procestemperatuur effectief middel waardoor eventuele biosynthese.
Figuur 1. Een algemene voorstelling van de heterologe natuurlijk product biosynthetische regeling met de erytromycine A verbinding. De vereiste experimentele stappen omvatten 1) het ontwerp en de overdracht van de erytromycine gencluster frOM S. erythraea naar E. coli; 2) reconstructie van de biosynthese in E. coli en 3) productanalyse van erythromycine A.
Figuur 2. A. De erytromycine gencluster als georganiseerd in de inheemse S. erythraea chromosoom. B. Erythromycine A biosynthese. Binnen E. coli is de Sfp enzym dat noodzakelijk is posttranslationele modificatie van het DEBS1, 2 en 3 polyketidesynthase enzymen (elk> 300 kDa), wordt dit aangegeven met de verbindingsarm bij elk ACS domein. De DEBS enzymen vormen een α β 2 2 γ 2 complex onderverdeeld in module eenheden die de opeenvolgende condensatie van een starter propionyl-CoA unit en zes (2S) katalyseren-methylmalonyl-CoA extender units de polyketide 6-deoxyerythronolide B (6dEB) vormen. KS-ketosynthase; AT-acyl transferase, ACS-acyldragerproteïne; KR-ketoreductase (met de inactieve KR vermeld in module 3); DH-dehydratase, ER-enoyl reductase, TE-thioesterase. Een PrpE (propionyl-CoA synthetase) en PCC (propionyl-CoA carboxylase, samengesteld uit twee eiwitsubeenheden) moeten exogene propionaat converteren naar de startpositie substraten propionyl-CoA en (2S)-methylmalonyl-CoA. De genen voor Sfp en PrpE werden eerder ontworpen binnen de BAP1 E. coli chromosoom 19. Conversie van de 6dEB molecuul tegen erytromycine wordt bereikt door de deoxysugar biosynthese en gehechtheid, extra tailoring, en zelf-weerstand enzymen. Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .
Figuur 3. A. Isolatie van individuele genen vereist voor erythromycine A biosynthese (zonder deze drie genen DEBS). Individuele plasmide ontwerp inclusief de PCR-oligonucleotide primers gebruikt voor het isoleren eryCI; primer restrictieplaatsen zijn vetgedrukt en complementaire sequentie wordt onderstreept. Ook zijn de restrictie-analyse van de resulterende pET21 en pET28 vectoren die individuele genen en operons. B. i. Consolidatie van de biosynthetische genen die nodig zijn voor polyketide maatwerk als operons voor kennismaking met E. .. coli ii restrictieplaats en andere expressie-elementen betrokken bij operon constructie en het ontwerp; X / S geeft de compatible-samenhangende ligatie van Xba I en Spe I sites die resulteert in een nieuwe sequentie herkend door een restrictiop enzym. Klik hier om figuur 3 te bekijken .
Figuur 4. A. SDS-PAGE analyse van de afzonderlijke genen weergegeven in figuur 3. De sterretjes duiden die genen uitgedrukt met 5 'leader sequenties als gevolg van de pET28 expressievector. B. Fenotypische beoordeling van ermE (erytromycine A resistentie). Erythromycine A in het vaste medium gebruikt om E. testen coli-stammen plasmiden met of zonder het ermE erythromycine A resistentiegen. Celgroei wordt gered met met ermE uitdrukking.
Figuur 5. A. Schematische voorstelling van de volledige erythromycine A pathway geïntroduceerd E. coli, waaronder een plasmide voor de GroEL / ES chaperonine (pGro7) en een plasmide dat een extra kopie van Eryk. B. Transformatie vergelijking tussen chemische en electro met beide methoden combinatie (i) en sequentiële (ii) introductie van plasmiden. C. Plasmide stabiliteit van getransformeerde stam. Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .
Figuur 6. Een standaard LC-MS spoor van erytromycine A uit E. coli.
Figuur 7. A. Vaste fase bioassay van filter schijven met i. Halen uit een niet-geïnduceerde BAP1 E. coli negatieve controle; ii handel verkrijgbaar erythromycine A (positieve controle).. erythromycine A en iii uit een geïnduceerde E. BAP1 coli systeem. De schijven werden uitgeplaat op een grasveld van B. subtilis bacteriën en de daaruit voortvloeiende remmingszones dan antibiotische activiteit. B. Assay aangetoond in vloeibare fase met 96 putjes tijdsverloop monsters. Klik hier om groter bedrag bekijken .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kritische stappen in heterologe biosynthese worden aangetroffen in elk van de drie procedurele punten in het proces: 1) genetische overdracht, 2) biosynthetische reconstitutie en 3) productanalyse. Een probleem in elk stadium zal ontsporen het uiteindelijke doel van de oprichting van heterologe biosynthese. Misschien het moeilijkste aspect van het proces is het vaststellen gereconstitueerde biosynthese, aangezien dit absoluut noodzakelijk voor succesvolle analyse mogelijk is. Echter reconstitutie is afhankelijk zorgvuldig ontwerp en overdracht van het genetische materiaal verantwoordelijk voor eventuele biosynthese. Ook gevestigd, kunnen gevoelige analytische methoden (zoals LC-MS) te detecteren kleine titer niveaus die anders kan worden uitgelegd als een gebrek aan productie. Het is het hoogtepunt van deze situaties, dat maakt heterologe biosynthese uitdagend.
Met betrekking tot de erythromycine A voorbeeld werden bevestigd gensequenties geïsoleerd door PCR individueel getest expression voorafgaand aan de consolidatie van de genen voor gecoördineerde expressie en natuurlijk product formatie. In eerste pogingen tot product analyse werden tussenproducten eerst geïdentificeerd wanneer een chaperonine (GroEL / ES) werd co-expressie met de vereiste gencluster. Het eindproduct werd alleen geproduceerd als een extra kopie van het gen verantwoordelijk voor de laatste stap in de biosynthese (Eryk) opgenomen. Beide maatregelen geprofiteerd van de gevoelige LC-MS analysemethode heeft gebruikt om te beoordelen productie.
Nu dat de productie is bevestigd, de E. coli cellulaire achtergrond biedt tal van technische mogelijkheden. De eerste daarvan is het optimaliseren van de productie natieve erythromycine A verbinding. Dit zou een alternatief bieden voor de productie route met potentiële besparingen in doorlooptijd en kosten. Bovendien is de erythromycine A traject worden gemanipuleerd ten behoeve van diversificatie productvorming. Nieuwe analogen bieden depotentieel van nieuwe antibiotica (of andere therapeutische) activiteit. Deze zelfde mogelijkheden bestaan voor algemene toepassingen van heterologe biosynthese en bieden de primaire motivatie voor de aanpak, verder ondersteund door de uitdagingen die zich met veel originele producerende organismen. Continue toepassingen en verbeteringen van de aanpak beschreven in dit artikel zal de frequentie van toekomstige heterologe biosynthetische succes.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
De auteurs danken de NIH (AI074224 en GM085323) en NSF (0712019 en 0924699) voor financiering van projecten gericht op heterologe biosynthese te ondersteunen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PCR machine | Eppendorf | Mastercycler personal | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Fisher | BP231 | |
| Electroporator | BioRad | Micropulser | |
| IPTG | Fisher | BP1620 | |
| Sodium propionate | Sigma | P1880 | |
| L-arabinose | Sigma | A3256 | |
| Refrigerated Shaker | Thermo Scientific | MaxQ 4000 | |
| Microfuge | Eppendorf | Centrifuge 5415D | |
| pGro7 | Takara | Chaperone Plasmid Set (3340) | |
| pET21, pET28, pCDF-Duet-1 | EMD Chemicals | 69742-3, 69864, 71340 | |
| LC-MS | Applied Biosystems | 3200 Q-Trap | |
| Ethyl acetate | Sigma | 270989 | |
| Methanol | Sigma | 322415 | |
| Vacuum centrifuge | Eppendorf | Concentrator 5301 | |
| Rotary Evaporator | Buchi | R-200 |
References
- Adrio, J. L., Demain, A. L. Genetic improvement of processes yielding microbial products. FEMS Microbiol. Rev. 30, 187-214 (2006).
- Brunker, P., Minas, W., Kallio, P. T., Bailey, J. E. Genetic engineering of an industrial strain of Saccharopolyspora erythraea for stable expression of the Vitreoscilla haemoglobin gene (vhb). Microbiology. 144 (Pt. 9), 2441-2448 (1998).
- Chen, Y., et al. Genetic modulation of the overexpression of tailoring genes eryK and eryG leading to the improvement of erythromycin A purity and production in Saccharopolyspora erythraea fermentation. Appl. Environ. Microbiol. 74, 1820-1828 (2008).
- McGuire, J. M., Bunch, R. L., Anderson, R. C., Boaz, H. E., Flynn, E. H., Powell, H. M., Smith, J. W. "Ilotycin," a new antibiotic. Antibiot & Chemother. 2, 281-284 (1952).
- Minas, W., Brunker, P., Kallio, P. T., Bailey, J. E. Improved erythromycin production in a genetically engineered industrial strain of Saccharopolyspora erythraea. Biotechnol. Prog. 14, 561-566 (1998).
- Zou, X., Hang, H. F., Chu, J., Zhuang, Y. P., Zhang, S. L. Oxygen uptake rate optimization with nitrogen regulation for erythromycin production and scale-up from 50 L to 372 m3 scale. Bioresour. Technol. 100, 1406-1412 (2009).
- Zhang, H., Boghigian, B. A., Armando, J., Pfeifer, B. A. Methods and options for the heterologous production of complex natural products. Nat. Prod. Rep. 28, 125-151 (2011).
- Cortes, J., Haydock, S. F., Roberts, G. A., Bevitt, D. J., Leadlay, P. F. An unusually large multifunctional polypeptide in the erythromycin-producing polyketide synthase of Saccharopolyspora erythraea. Nature. 348, 176-178 (1990).
- Donadio, S., Staver, M. J., McAlpine, J. B., Swanson, S. J., Katz, L. Modular organization of genes required for complex polyketide biosynthesis. Science. 252, 675-679 (1991).
- Salah-Bey, K., et al. Targeted gene inactivation for the elucidation of deoxysugar biosynthesis in the erythromycin producer Saccharopolyspora erythraea. Mol. Gen. Genet. 257, 542-553 (1998).
- Summers, R. G., et al. Sequencing and mutagenesis of genes from the erythromycin biosynthetic gene cluster of Saccharopolyspora erythraea that are involved in L-mycarose and D-desosamine production. Microbiology. 143, 3251-3262 (1997).
- Corre, C., Challis, G. L. New natural product biosynthetic chemistry discovered by genome mining. Nat. Prod. Rep. 26, 977-986 (2009).
- McAlpine, J. B. Advances in the understanding and use of the genomic base of microbial secondary metabolite biosynthesis for the discovery of new natural products. J. Nat. Prod. 72, 566-572 (2009).
- Nett, M., Ikeda, H., Moore, B. S. Genomic basis for natural product biosynthetic diversity in the actinomycetes. Nat. Prod. Rep. 26, 1362-1384 (2009).
- Oliynyk, M., et al. Complete genome sequence of the erythromycin-producing bacterium Saccharopolyspora erythraea NRRL23338. Nat. Biotechnol. 25, 447-453 (2007).
- Wilkinson, B., Micklefield, J. Mining and engineering natural-product biosynthetic pathways. Nat. Chem. Biol. 3, 379-386 (2007).
- Gokhale, R. S., Tsuji, S. Y., Cane, D. E., Khosla, C. Dissecting and exploiting intermodular communication in polyketide synthases. Science. 284, 482-485 (1999).
- Quadri, L. E., et al. Characterization of Sfp, a Bacillus subtilis phosphopantetheinyl transferase for peptidyl carrier protein domains in peptide synthetases. Biochemistry. 37, 1585-1595 (1998).
- Pfeifer, B. A., Admiraal, S. J., Gramajo, H., Cane, D. E., Khosla, C. Biosynthesis of complex polyketides in a metabolically engineered strain of E. coli. Science. 291, 1790-1792 (2001).
- Lee, H. Y., Khosla, C. Bioassay-guided evolution of glycosylated macrolide antibiotics in Escherichia coli. PLoS Biol. 5, e45 (2007).
- Peiru, S., Menzella, H. G., Rodriguez, E., Carney, J., Gramajo, H. Production of the potent antibacterial polyketide erythromycin C in Escherichia coli. Appl Environ Microbiol. 71, 2539-2547 (2005).
- Peiru, S., Rodriguez, E., Menzella, H. G., Carney, J. R., Gramajo, H. Metabolically engineered Escherichia coli for efficient production of glycosylated natural products. Microbial Biotechnology. 1, 476-486 (2008).
- Zhang, H., Skalina, K., Jiang, M., Pfeifer, B. A. Improved E. coli erythromycin a production through the application of metabolic and bioprocess engineering. Biotechnol. Prog. 28, 292-296 (2012).
- Zhang, H., Wang, Y., Wu, J., Skalina, K., Pfeifer, B. A. Complete biosynthesis of erythromycin A and designed analogs using E. coli as a heterologous host. Chem. Biol. 17, 1232-1240 (2010).
- Kieser, T., Bibb, M. J., Buttner, M. J., Chater, K. F., Hopwood, D. A. Practical Streptomyces Genetics. , The John Innes Foundation. Norwich, UK. (2000).
