Summary
La biosynthèse hétérologue de l'érythromycine A travers
Abstract
La production hétérologue de produits naturels complexes est une approche visant à remédier aux limitations actuelles et les possibilités futures. Il est particulièrement utile pour les composés qui possèdent une valeur thérapeutique, mais peut-être pas suffisamment produites ou bénéficieraient d'une forme améliorée de la production. Les procédures expérimentales impliquées peuvent être subdivisés en trois volets: 1) le transfert génétique; 2) la reconstitution hétérologue, et 3) l'analyse du produit. Chaque composante expérimentale est en cours d'optimisation continue pour relever les défis et anticiper les opportunités liées à cette nouvelle approche.
Biosynthèse hétérologue commence par l'identification d'une séquence génétique responsable d'un produit naturel précieux. Le transfert de cette séquence à un hôte hétérologue est compliquée par la complexité voie de biosynthèse responsable de la formation du produit. L'antibiotique érythromycine A est un bon exemple. Vingt gènes (un total de> 50 kb) sont nécessaires pour la biosynthèse éventuelle. En outre, trois de ces gènes codent megasynthases, multi-domaines enzymes chacun 300 ~ kDa dans la taille. Ce matériel génétique doit être conçu et transféré à E. coli pour la biosynthèse reconstitué. Le recours à l'isolement PCR, la construction opéron, multi-cystronic plasmides et électro-transformation sera décrite dans le transfert de l'érythromycine Un cluster génétique de E. coli.
Une fois transféré, l'E. coli cellule doit prendre en charge la biosynthèse éventuelle. Ce processus est également difficile étant donné les différences substantielles entre E. coli et la plupart des hôtes d'origine responsables de la formation produit naturel complexe. La cellule doit fournir des substrats nécessaires pour soutenir la biosynthèse et coordonnée exprimer le cluster génétique transféré à produire des enzymes actives. Dans le cas de l'érythromycine A, la E. coli cellule a dû être conçu pour fournir les deux précurseurs (RPopionyl-CoA et l'acide (2S)-méthylmalonyl-CoA) nécessaire à la biosynthèse. En outre, des modifications de séquences de gènes, le nombre de copies du plasmide, chaperonine co-expression, de modification post-traductionnelle enzymatique, et la température de processus ont également été nécessaire pour permettre à l'érythromycine finale A de formation.
Enfin, la production doit être évaluée avec succès. Pour l'érythromycine A cas, nous présentons deux méthodes. La première est la chromatographie liquide-spectrométrie de masse (LC-MS) pour confirmer et quantifier la production. La bioactivité de l'érythromycine A seront également confirmés par l'utilisation d'un test biologique dans lequel l'activité antibiotique est testé contre Bacillus subtilis. Les tests d'évaluation établissent la biosynthèse de l'érythromycine A partir de E. coli et préparer le terrain pour les futurs efforts d'ingénierie pour améliorer ou diversifier la production et à la production de nouveaux composés naturels complexes en utilisant cette approche.
Introduction
L'érythromycine est un antibiotique A polykétide produite par le Gram positif bactérie du sol Saccharopolyspora erythraea et la production actuelle a été progressivement améliorée à ~ 10 g / L pendant des décennies de mutagenèse traditionnelle et protocoles de dépistage et, plus récemment, grâce à des programmes d'optimisation des processus 1-6. Stratégies de mutagenèse et de criblage sont courantes dans le développement de produits antibiotique naturel en raison des difficultés de culture et / ou manipuler génétiquement hôtes de production indigènes et en raison de l'activité antibiotique ou facilement disponibles phénotypes de croissance améliorées pour faciliter la sélection. Dans le cas de l'érythromycine A, S. erythraea est limitée par un profil de croissance lente et l'absence de plus directs techniques de manipulation génétique (par rapport à des organismes comme E. coli), donc, ce qui entrave l'amélioration rapide de la production et de la biosynthèse de nouveaux produits dérivés. Ayant reconnu les problèmes de production et déverrouillé diversificatisur les possibilités avec des composés tels que l'érythromycine A, la communauté scientifique a commencé à poursuivre l'idée de la biosynthèse hétérologue (Figure 1) 7. Ces efforts ont coïncidé avec des informations de séquence disponible pour l'érythromycine Un cluster 8-11 gène. Il convient de souligner que le nombre de séquences complexes naturels groupes de gènes de produits s'est considérablement élargie 12-16, fournissant l'impulsion de poursuivre les efforts dans la biosynthèse hétérologue d'accès codé potentiel médicinal. Pour ce faire, la reconstitution hétérologue exige que le nouvel hôte de répondre aux besoins de la voie de biosynthèse spécifique. E. coli offre une commodité technique, un ensemble large couvrant des techniques de biologie moléculaire, et des stratégies d'ingénierie métabolique et le processus de développement de produits. Pourtant, lorsqu'on les compare à des hôtes de production indigènes, E. coli ne présentent pas le même niveau de production produit complexe naturel. Il était donc ignore si E. coli pourrait servir comme une option viable pour la biosynthèse hétérologue produit naturel complexe. Cependant, il a été supposé que E. coli serait un organisme hôte idéal si biosynthèse hétérologue pourrait être accompli.
Avec cet objectif à l'esprit, les efforts initiaux ont commencé à produire de l'aglycone polycétide 6-désoxyérythronolide B (6dEB) à E. coli. Cependant, natif E. coli métabolisme n'a pas pu fournir des niveaux appréciables de la propionyl-CoA et de (2S)-méthylmalonyl-CoA précurseurs nécessaires pour soutenir la biosynthèse 6dEB ne pouvait le nouvel hôte post-traductionnelle modifier la synthase B désoxyérythronolide (DEBS) enzymes. Pour remédier à ces problèmes, une voie métabolique composé d'enzymes natives et hétérologues a été construite dans E. coli telles que le propionate de manière exogène a été alimenté à une transformation intracellulaire propionyl-CoA et l'acide (2S)-méthylmalonyl-CoA, au cours de l'ingénierie pour effectuer cette voie, un gène sfp a été placé dans the chromosome de E. coli BL21 (DE3) pour produire une nouvelle souche appelée BAP1. L'enzyme est une Sfp capable phosphopantéthéinyle transférase de fixation du cofacteur 4'-phosphopantéthéine aux enzymes DEBS 17,18. Les trois gènes DEBS (chaque ~ 10 kb) ont ensuite été placés sur deux vecteurs d'expression contenant sélectionnables séparément promoteurs inductibles T7. Après un ajustement de la clé après l'induction de la température (de 22 ° C), les gènes DEBS été coordonnée au sein BAP1 exprimé dans un état actif capable de générer 6dEB 19.
La poursuite de l'érythromycine A la biosynthèse complète puis a commencé à utiliser un cluster de gènes analogues de Micromonospora megalomicea ou une voie hybride composé de gènes de S. erythraea, S. fradiae et S. venezuelae qui a produit l'érythromycine intermédiaires C et 6-désoxyérythromycine D, respectivement 20-22. Récemment, notre groupe a étendu ces efforts en produisant erythromycin A (la forme la plus cliniquement pertinente de l'érythromycine) à E. coli. Contrairement aux travaux antérieurs, notre stratégie coordonnée exprimé le S. 20 d'origine gènes erythraea nécessaire pour la biosynthèse des polykétides, deoxysugar biosynthèse et de fixation, couture supplémentaire, et l'auto-résistance (figure 2). Au total, 26 (natif et hétérologues) gènes ont été conçus pour permettre E. coli pour produire de l'érythromycine A à 4 mg / L 23,24. Ce résultat place la production complète d'un produit complexe naturel polycétide utilisant E. coli et sert de base pour tirer parti de cette possibilité nouvelle production ou de poursuivre de nouvelles.
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Protocol
Le texte ci-dessous est spécifique de l'antibiotique érythromycine A, mais les étapes sont généralement conçus pour être applicable à d'autres produits naturels comme candidats pour la biosynthèse hétérologue.
1. Érythromycine A Transfert génétique Cluster
- Conception des amorces de PCR pour amplifier l'ensemble des gènes associés à l'érythromycine Un cluster dans le S. chromosome erythraea. Cette étape est spécifique à ces produits candidats naturels dont le patrimoine génétique des séquences ont été déterminées. Alternativement, les gènes nécessaires peuvent être synthétisés (par le biais de plusieurs options de fournisseur commercial) avec l'avantage que les gènes nouvellement synthétisées seraient conçues pour une utilisation optimale dans le codon E. nouvelle coli hôte. Si la synthèse d'ADN est poursuivi, un défi actuel est la génération gènes megasynthase qui peuvent dépasser 10 kb de longueur. Techniquement, la synthèse peut être accompli, mais il est difficile et coûteux. Il est prévu que improvem continueents dans la technologie de synthèse de gène abordera inconvénients actuels et valider davantage cette approche pour fournir du matériel génétique hétérologue.
- Effectuer PCR en utilisant fraîchement préparée S. erythraea ADN génomique comme matrice. L'ADN chromosomique peut être préparé à partir de cultures de S. erythraea ou de stocks congelés de la bactérie (figure 3) 25. Les réactions de PCR peuvent bénéficier de l'ajout de DMSO (4 pi sur 50 pi de réactions) pour tenir compte de haute teneur en G+ C dans la cible S. gènes erythraea. Chaque gène amplifié doivent être séquencés pour confirmer que le gène complet a été récupéré et qu'aucune mutation ont été introduites au cours du processus PCR.
- Grâce digestion de restriction et de ligature, insérez chacune des gènes isolés dans des vecteurs d'expression conçus pour E. coli (figure 3). Ce processus est amorcé par la conception de sites de restriction dans les amorces de PCR afin de permettre la digestion et ligation dans l'ex appropriévecteurs Pression (un exemple a été inclus dans la figure 3). Nous avons utilisé à la fois pET21 et pET28 vecteurs. Le vecteur pET28 permet l'inclusion d'une séquence leader 5 'qui a facilité l'expression des gènes dans le cas érythromycine A. Confirmer l'expression des gènes individuels par le biais de RT-PCR, analyse SDS-PAGE (avec fractions protéiques solubles) ou pratiques tests phénotypiques (figure 4).
- Construire opérons sur la base de gènes exprimés avec succès à partir des plasmides d'expression individuels (Figure 3). Nous avons toujours utilisé des combinaisons d'enzymes de restriction compatibles cohésifs (comme Xba I et Spe I) 24 à convertir séquentiellement gènes des opérons, mais les sites de restriction choisis pour la construction opéron ne doit pas résider dans (ou doit être retiré de) l'isolement séquences de gènes (un problème qui peut être évité si la synthèse de gène est utilisé). Cette étape renforce l'érythromycine, 20 A gènes avant E. coli transformation. Actuellement, nous avons utilisé cette méthode pour inclure jusqu'à 20 kb d'ADN étranger dans un vecteur pET standard (deux gènes de ~ 10 ko chacune). En outre, nous avons utilisé cette approche pour générer opérons contenant neuf gènes. On ne sait pas exactement combien d'ADN ou combien de gènes peuvent être intégrés dans pET plasmides de type, mais les mesures citées ci-dessus fournissent une référence pour les systèmes complexes comme la voie de biosynthèse érythromycine. Enfin, la norme aux étapes de ligature in vitro et des étapes ultérieures de transformation réussie de plus en plus difficile, car opéron et augmentation de la taille du plasmide. Température de ligature (12-22 ° C) et le temps (3-24 h) sont variés et électro-transformation est utilisé pour aider le processus de production finales constructions plasmidiques.
- Transformer les plasmides biosynthétiques nouvellement conçus dans E. coli souche BAP1 utilisant l'électro-transformation (figure 5). La procédure peut être tentée avec des plasmides introduits de façon séquentielle ou en collaborationmbination. Lors de la transformation de taille mesure ou de nombreux plasmides, nous avons utilisé traditionnellement électro-transformation (par opposition à la transformation chimique). Une fois transformé, plaque les cellules sur milieu solide LB contenant de la tetracycline (5 mg / l), la carbénicilline (100 mg / l), à la kanamycine (50 mg / l), la streptomycine (50 mg / l), et apramycine (50 mg / l ) pour sélectionner une opération de maintenance plasmide. Il est très inhabituel pour utiliser six choix différent des antibiotiques après la transformation d'un E. cellule coli, mais cela reflète simplement le nombre total de plasmides nécessaires pour permettre à l'érythromycine finale A biosynthèse. Bien que possible, l'approche va limiter les capacités de production du composé fois la culture a commencé (s'il vous plaît voir ci-dessous).
2. E. Reconstitution biosynthétique coli
- BAP1 souche a été conçu pour fournir les substrats nécessaires pour la biosynthèse et de post-traductionnelle modifier le megasynthase B désoxyérythronolide. Les gènes individuels du erythromycin Une voie ont été testés pour l'expression des gènes et consolidée à compter opérons dans des plasmides d'expression. Cette section est consacrée aux conditions de culture pour tester l'activité concertée de l'érythromycine A pleine voie.
- Prendre 3 colonies séparées de la BAP1 fraîchement transformé et inoculer 1,5 ml des cultures LB contenant les antibiotiques nécessaires sélection plasmidiques (aux mêmes concentrations indiquées ci-dessus pour sélectionner les transformants sur milieu solide), isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG; 100 uM ) et de l'arabinose (2 mg / ml) pour induire l'expression des gènes, et le propionate de sodium 20 mM à soutenir la formation intracellulaire précurseur biosynthétique. Une fois que la production a été confirmée, les grandes cultures peuvent être menées dans le but d'intensifier et d'optimiser titres pour ce produit.
- Culture des cellules à 22 ° C et 250 rpm pendant 24-48 heures. Dans ce cas, le choix des antibiotiques en sorte que les plasmides requis sont maintenus dans les premiers stades de la culture cellulaire. Cependant, un plasmides peut être facilement perdu dans des niveaux de sélection antibiotique changer au cours de la période de culture. Cela peut conduire à une instabilité plasmidique (c.-à-la perte d'un ou plusieurs plasmides lors de la culture), qui serait alors de limiter la capacité de production. Le problème est exacerbé lorsque les plasmides incompatibles sont utilisés pour mettre en place un groupe de gènes hétérologues complète. Tel est le cas pour l'érythromycine A composé (Figure 5) et devrait être remédié à surproduire vraiment le composé de E. coli. Cependant, dans le but de démontrer la production initiale, ces défauts de conception sont tolérés pour des raisons de célérité établir la faisabilité de l'approche hétérologue.
- Clarifier les cultures par centrifugation à 10000 rpm dans une centrifugeuse Eppendorf. Enlever le surnageant et conserver à 4 ° C pour analyse.
- Dans le cas de l'érythromycine A, le manque de production composé a été adressée par l'inclusion de la chaperonine GroES / EL (en utilisant pGro7spécifiquement pour traiter le manque d'activité des enzymes de la post-expression) et l'inclusion de copies de gènes supplémentaires (pour les gènes soupçonnés de faible expression / activité). Des stratégies similaires peuvent être nécessaires avec d'autres hétérologues naturelles efforts de production des produits.
3. Analyse du produit
- Pour confirmer et de quantifier l'érythromycine A la formation, injecter le surnageant de culture sur un système LC-MS (Figure 6). Érythromycine A disponible dans le commerce a été utilisée pour confirmer la production et en tant que norme lors de la quantification. Pour les cas sans normes disponibles dans le commerce, analyse LC-MS exigerait une caractérisation chimique supplémentaire par RMN et spectrométrie de masse haute résolution.
- Comparer production entre les 3 colonies / cultures de la transformation BAP1. Choisissez le plus grand producteur et préparer un stock de glycérol à partir de la source de la colonie. Cette étape peut être effectuée en parallèle avec les cultures de production de la section Protocole2 à l'aide d'une petite partie des cultures de préparer des stocks de glycérol. Stocker le stock de glycérol dans un congélateur à -80 ° C.
- Utilisation de la confirmation, le plus élevé des cellules productrices, commencer une culture de production séparée et extraire le surnageant final avec 2x volume d'acétate d'éthyle. Utilisez un système de vide par évaporation pour sécher l'extrait et remettre en suspension dans 100 ul de méthanol. Transférer l'extrait vers un disque de filtre stérile (diamètre ~ 1/4 pouce) et le disque de permettre de sécher. Par ailleurs, la culture B. subtillis à l'état liquide LB pendant la nuit. Ajouter 20 ul de la B. subtilis culture de 20 ml de gélose LB liquide à 45 ° C. Plaque de l'agar-agar et laisser se solidifier. Placez le disque filtre sur la plaque et incuber à 37 ° C (figure 7). En variante, l'extrait peut être ajoutée à des cultures liquides dans une plaque 96-puits pour quantifier l'activité en utilisant un lecteur de plaque (Figure 7).
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Representative Results
Le résultat attendu de cette approche est la production d'un produit entièrement naturel bioactif de l'E. coli hétérologues hôte. Ceci est mieux représenté par les résultats de LC-MS utilisé pour confirmer et quantifier la production (figure 6) et le bio-essai antibactérien utilisé pour confirmer l'activité finale (figure 7). Dans le régime général de la biosynthèse hétérologue, ce résultat définit le succès. Une fois accompli, les efforts de recherche alors se tourner vers l'optimisation (à la fois à l'échelle cellulaire et processus) et de l'ingénierie moléculaire. Les objectifs finaux comprennent les processus de production économiques pour le composé d'origine et le contrôle du système hétérologue tel que des modifications rationnelles à ce processus peut être fait pour produire des variantes du composé d'origine avec la possibilité d'un spectre d'activité accrue ou élargi.
Le défaut de produire le composé souhaité déclenche alors des plans d'urgence de nombreux to évaluer quelle partie de l'approche interdisant la biosynthèse de succès. Bon nombre de ces mécanismes de dépannage sont en construction dans la procédure décrite ci-dessus. Dans notre expérience, il est important, au minimum, pour confirmer l'expression génique efficace (analyse SDS-PAGE des enzymes de biosynthèse solubles) du groupe de gènes nouvellement introduite avant de tenter de mesurer la biosynthèse du produit formé naturel. Message d'expression, comme indiqué ci-dessus, l'utilisation de repliement des protéines chaperons, renforcée nombre de copies du gène et de la température processus ont été des moyens efficaces permettant de biosynthèse éventuelle.
Figure 1. Une représentation globale du système hétérologue biosynthèse des produits naturels avec l'érythromycine A composé. Les étapes expérimentales nécessaires comprennent: 1) la conception et le transfert de l'érythromycine gène de cluster from S. erythraea à E. coli, 2) la reconstitution de la biosynthèse de l'intérieur E. coli, et l'analyse du produit 3) de l'érythromycine A.
Figure 2. A. Le groupe de gènes que l'érythromycine organisé à l'indigène S. chromosome erythraea. B. érythromycine A biosynthèse. Dans E. coli, l'enzyme est nécessaire pour Sfp modification post-traductionnelle de la DEBS1, 2, et 3 enzymes de polycétide-synthase (par 300> kDa), ce qui est indiqué par le bras de liaison associé à chaque domaine ACP. Les enzymes DEBS former un α 2 β 2 γ 2 complexe divisé en unités modulaires qui catalysent les condensations successives de démarreur une unité de propionyl-CoA et six (2 S)-méthylmalonyl-Les unités d'extension CoA pour former le polycétide 6-désoxyérythronolide B (6dEB). KS-cétosynthase; AT-acyl transférase; ACP-protéine porteuse d'acyle; KR-cétoréductase (avec les inactifs KR noté dans le Module 3); DH-déshydratase; ER-énoyl réductase; TE-thioestérase. Un PRPE (propionyl-CoA synthétase) et de PCC (propionyl-CoA carboxylase, composée de deux sous-unités protéiques) sont nécessaires pour convertir le propionate exogène au départ substrats propionyl-CoA et (2 S)-méthylmalonyl-CoA. Les gènes de la SFP et PRPE ont déjà été conçu au sein de l'E. BAP1 coli chromosome 19. La conversion de la molécule 6dEB à l'érythromycine est accompli par la biosynthèse deoxysugar et de l'attachement, la couture supplémentaire, et l'auto-résistance enzymes. Cliquez ici pour agrandir la figure .
Figure 3. A. Isolement des gènes individuels nécessaires à la biosynthèse de l'érythromycine A (à l'exception des trois gènes de DEBS). Conception individuelle plasmide, y compris les amorces de PCR oligonucléotidiques utilisées pour isoler; eryCI sites de restriction amorces ont été indiquées dans l'ordre gras et complémentaire a été souligné. On y trouve aussi l'analyse de restriction des pET21 et pET28 résultent des vecteurs contenant des gènes et opérons. B. i. Consolidation des gènes de biosynthèse nécessaires pour la couture polycétide telle opérons pour l'introduction de E. .. coli ii Restriction site et d'autres éléments d'expression impliquées dans la construction et la conception opéron, X / S représente la ligature compatible cohésif de Xba I et Spe I des sites qui se traduit par une nouvelle séquence non reconnu par soit restrictisur l'enzyme. Cliquez ici pour voir la figure 3 .
Figure 4. A. Analyse SDS-PAGE des gènes individuels présentés dans la figure 3. Les astérisques indiquent les gènes exprimés avec des séquences de tête 5 'résultant de vecteur pET28 expression. B. évaluation phénotypique des Erme (érythromycine A résistance). Érythromycine A dans le milieu solide utilisé pour tester E. coli hébergeant des plasmides avec ou sans l'érythromycine ermE Un gène de résistance. La croissance cellulaire est sauvé avec l'expression ermE.
Figure 5. Schéma de l'érythromycine A. Un parcours complet présenté à E. coli, y compris un plasmide pour l'chaperonine GroEL / ES (pGro7) et une comparaison de transformation plasmide contenant une copie supplémentaire du Eryk. B. entre les méthodes chimiques et électro combinaison utilisant à la fois (i) et séquentielle (ii) l'introduction de plasmides. C. la stabilité du plasmide de la souche transformée. Cliquez ici pour agrandir la figure .
Figure 6. Une norme LC-MS trace de l'érythromycine A produite à partir de E. coli.
Figure 7. A. bioessai en phase solide des disques de filtration contenant i. Extrait d'un non induit E. BAP1 contrôle négatif coli; ii érythromycine disponible dans le commerce A (contrôle positif);.. iii érythromycine A extraite d'un E. induite BAP1 coli du système. Les disques ont été étalées sur une pelouse de B. bactéries subtilis et les zones résultant de l'inhibition indiquent une activité antibiotique. B. Essai démontré en phase liquide à l'aide de 96 puits échantillons de plaques de temps de cours. Cliquez ici pour agrandir la figure .
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Discussion
Les étapes critiques dans la biosynthèse hétérologue sont rencontrés à chacun des trois points de procédure dans le processus: 1) de transfert génétique, analyse des produits et 3), 2) la reconstitution de biosynthèse. Un problème à n'importe quelle étape fera dérailler l'objectif ultime d'établir la biosynthèse hétérologue. Peut-être l'aspect le plus difficile du processus est d'établir la biosynthèse reconstitué, car cela est absolument nécessaire pour permettre une analyse réussie. Toutefois, la reconstitution dépend de la conception minutieuse et le transfert du matériel génétique responsable de la biosynthèse éventuelle. De même, mis en place, les méthodes analytiques sensibles (comme LC-MS) peut détecter des niveaux de titrage petits qui, autrement, pourraient être interprétés comme un manque de production. Elle est l'aboutissement de ces situations qui rendent difficile la biosynthèse hétérologue.
En ce qui concerne l'érythromycine A, par exemple, des séquences de gènes isolés confirmés par PCR ont été testés individuellement pour expression avant la consolidation des gènes codant pour l'expression coordonnée et la formation produit naturel. Pendant les premières tentatives à l'analyse des produits, composés intermédiaires ont d'abord été identifiées que lorsque une chaperonine (GroEL / ES) a été co-exprimé avec le groupe de gènes requis. Le produit final a été seulement produit lors d'une copie supplémentaire du gène responsable de la dernière étape de la biosynthèse (Eryk) a été inclus. Ces deux mesures ont bénéficié de la sensibilité LC-MS méthode analytique utilisée pour évaluer initialement la production.
Maintenant que la production a été confirmée, le E. fond coli cellulaire offre des possibilités nombreuses d'ingénierie. Dont le premier est d'optimiser la production de l'érythromycine A native composé. Cela offrirait une voie alternative de production avec les économies potentielles en temps de traitement et les coûts. En outre, la voie de l'érythromycine A peut être manipulé en vue de la diversification de la formation du produit. Offrir de nouveaux analogues de lapotentiel de nouvel antibiotique (ou thérapeutique autre) activité. Ces mêmes possibilités existent pour des applications générales de la biosynthèse hétérologue et fournir la motivation première de l'approche, renforcée par les difficultés rencontrées par de nombreux organismes producteurs d'origine. Applications et des améliorations continues de l'approche décrite dans cet article va augmenter la fréquence de la réussite future de biosynthèse hétérologue.
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Disclosures
Aucun conflit d'intérêt déclaré.
Acknowledgments
Les auteurs remercient le NIH (AI074224 et GM085323) et la NSF (0.712.019 0.924.699 et) de financement pour soutenir des projets dédiés à la biosynthèse hétérologue.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PCR machine | Eppendorf | Mastercycler personal | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Fisher | BP231 | |
| Electroporator | BioRad | Micropulser | |
| IPTG | Fisher | BP1620 | |
| Sodium propionate | Sigma | P1880 | |
| L-arabinose | Sigma | A3256 | |
| Refrigerated Shaker | Thermo Scientific | MaxQ 4000 | |
| Microfuge | Eppendorf | Centrifuge 5415D | |
| pGro7 | Takara | Chaperone Plasmid Set (3340) | |
| pET21, pET28, pCDF-Duet-1 | EMD Chemicals | 69742-3, 69864, 71340 | |
| LC-MS | Applied Biosystems | 3200 Q-Trap | |
| Ethyl acetate | Sigma | 270989 | |
| Methanol | Sigma | 322415 | |
| Vacuum centrifuge | Eppendorf | Concentrator 5301 | |
| Rotary Evaporator | Buchi | R-200 |
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