Summary
Den heterologa biosyntesen av erytromycin A genom
Abstract
Den heterologa produktionen av komplexa naturliga produkter är en strategi för att hantera nuvarande begränsningar och framtida möjligheter. Det är särskilt användbart för sådana föreningar som har terapeutiskt värde, men kan inte vara tillräckligt producerats eller skulle dra nytta av en förbättrad form av produktionen. De experimentella inblandade förfaranden kan delas in i tre delar: 1) genetisk överföring, 2) heterolog beredning, och 3) produktanalys. Varje experimentell komponent är under ständig optimering för att möta de utmaningar och förutse de möjligheter som är förknippade med denna nya strategi.
Heterolog biosyntes börjar med identifiering av en genetisk sekvens som ansvarar för en värdefull naturprodukt. Överföra denna sekvens till en heterolog värd kompliceras av den biosyntetiska reaktionsvägen komplexitet ansvarig för produktbildning. Den antibiotiska erytromycin A är ett bra exempel. Tjugo gener (totalt> 50 kb) krävs för eventuell biosyntes. Dessutom tre av dessa gener kodar megasynthases, multi-domän enzymer vardera ~ 300 kDa i storlek. Detta genetiska material skall utformas och överföras till E. E. coli för rekonstituerad biosyntes. Användningen av PCR-isolering, konstruktion operon, flera cystronic plasmider, och elektro-transformation kommer att beskrivas i överföra erytromycin A genetiska kluster till E. coli.
När överföras, E. E. coli-cell måste stödja eventuella biosyntes. Denna process är också en utmaning med tanke på de stora skillnaderna mellan E. coli och mest originella värdar som ansvarar för komplexa natur produktbildning. Cellen måste tillhandahålla nödvändiga underlag för att stödja biosyntes och koordinerat uttryck den överförda genetiska kluster för att producera aktiva enzymer. I fallet med erytromycin A, E. coli-cell måste vara konstruerad för att ge de två prekursorerna (propionyl-CoA och (2S)-metylmalonyl-CoA) som krävs för biosyntes. Dessutom har gensekvenser modifieringar plasmidkopieantalet, chaperonin samexpression, post-translationell enzymatisk modifiering och processtemperaturen också krävs för att slutligt erytromycin A formation.
Slutligen måste framgångsrik produktion bedömas. För erytromycin fall kommer vi att presentera två metoder. Den första är vätskekromatografi-masspektrometri (LC-MS) för att bekräfta och kvantifiera produktionen. Bioaktiviteten av erytromycin A kommer också att bekräftas genom användning av en bioanalys, i vilken den antibiotiska aktiviteten testas mot Bacillus subtilis. De bedömningsgrunder analyser upprättar erytromycin A biosyntes från E. coli och lagt grunden för framtida tekniska insatser för att förbättra eller diversifiera produktionen och för produktion av nya komplexa naturliga föreningar med detta tillvägagångssätt.
Introduction
Erytromycin A är en polyketid antibiotikum som produceras av grampositiva jordbakterien Saccharopolyspora erythraea, och nuvarande produktion har stegvis förbättrats ~ 10 g / L genom årtionden av traditionella mutagenes och protokoll screening och på senare tid genom processoptimeringsåtgärder system 1-6. Mutagenes och screening strategier är vanliga i antibiotika naturlig produkt utveckling som ett resultat av svårigheter odling och / eller genetiskt manipulera infödda produktions värdar och på grund av den lättillgänglig antibiotisk verkan eller förbättrade fenotyper tillväxt till stöd val. I fallet med erytromycin A, S erythraea begränsas av en långsam tillväxt profil och avsaknaden av mer direkta genetiska manipulation tekniker (i förhållande till organismer som E. coli), således hämmar snabba förbättringar i produktion och biosyntesen av nya derivat. Efter att ha erkänt produktions frågor och olåst diversificatipå möjligheter med föreningar som erytromycin A började forskarsamhället att fullfölja idén om heterologa biosyntes (figur 1) 7. Dessa ansträngningar sammanföll med tillgängliga sekvensinformationen för erytromycin A genklustret 8-11. Det bör understrykas att antalet sekvenserade komplexa naturliga kluster produktgen kraftigt har expanderat 12-16, vilket ger impulser till fortsatta ansträngningar i heterologa biosyntesen att komma kodad medicinsk potential. För att göra detta krävs heterolog beredning att den nya värden möta behoven i de enskilda biosyntesvägen. E. E. coli ger teknisk bekvämlighet, ett brett spänner uppsättning av molekylärbiologisk teknik, och metabola och process strategier tekniska för produktutveckling. Men jämfört med infödda produktions värdar, E. E. coli uppvisar inte samma nivå av komplexa naturprodukten produktion. Det var därför okänt om E. E. coli kan tjäna som en livskraftig heterolog alternativ för komplexa naturprodukt biosyntes. Emellertid antogs det att E. E. coli skulle vara en idealisk värdorganism om heterologa biosyntesen skulle kunna fullföljas.
Med detta mål i sikte, började inledande insatser för att producera polyketid aglykon 6-deoxyerythronolide B (6dEB) genom E. coli. Men infödda E. E. coli ämnesomsättning kunde inte ge märkbara nivåer av propionyl-CoA och (2S)-metylmalonyl-CoA-prekursorer för att stödja 6dEB biosyntes heller kunde den nya värden posttranslationellt modifiera deoxyerythronolide B-syntas (DEBS) enzymer. Att rätta till dessa problem, har en metabolisk väg som består av inhemska och heterologa enzymer inbyggda i E. E. coli så att exogent matas propionat omvandlas intracellulärt till propionyl-CoA och sedan (2S)-metylmalonyl-CoA, under konstruktion för att slutföra denna väg, har en SFP-gen placeras i the kromosomen hos E. coli BL21 (DE3) för att producera en ny stam benämnd BAP1. SFP enzymet är en phosphopantetheinyl transferas kan fästa 4'-phosphopantetheine kofaktor till Debs enzymerna 17,18. De tre Debs generna (varje ~ 10 kb) placerades sedan på två separat valbara expressionsvektorer innehållande inducerbara T7-promotorer. Efter en viktig justering av post-induktion temperatur (till 22 ° C), var Debs generna uttrycks koordinerat inom BAP1 i ett aktivt tillstånd som kan generera 6dEB 19.
Strävan efter fullständig erytromycin A biosyntes sedan började använda en analog genkluster från Micromonospora megalomicea eller en hybrid väg som består av gener från S. erythraea, S. fradiae, och S. venezuelae som producerade intermediärer erytromycin C och 6-deoxierytromycin D respektive 20-22. Nyligen har vår grupp förlängdes dessa insatser genom att producera erythromycin A (mest kliniskt relevant form av erytromycin) genom E. coli. I motsats till tidigare arbete, uttryckt vår strategi koordinerat den 20 ursprungliga S. erythraea gener som behövs för polyketide biosyntes, deoxysugar biosyntes och fastsättning, extra sömnad, och själv-resistens (Figur 2). Sammanlagt 26 (infödda och heterologa) gener konstruerade så att E. coli för att producera erytromycin A vid 4 mg / L 23,24. Detta resultat etablerat komplett produktion av en komplex polyketid naturprodukt med E. coli och fungerar som en grund för att utnyttja denna nya produktion alternativet eller utöva nya.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
I texten nedan är specifik för erytromycin A antibiotikum, men stegen är avsedda att vara allmänt tillämpbar på andra naturliga produkter som kandidater för heterolog biosyntes.
1. Erytromycin en genetisk Cluster Transfer
- Design PCR-primers för att amplifiera alla gener associerade med erytromycin A kluster inom S. erythraea kromosom. Detta steg är specifik för de naturliga produktkandidater vars genetiska sekvenser har bestämts. Alternativt, kan de erforderliga generna syntetiseras (genom flera kommersiella leverantörsalternativen) med fördelen att de nyligen syntetiserade generna skulle utformas för optimal kodonanvändning i nya E. coli-värd. Om DNA-syntes bedrivs, är en aktuell utmaning genererar megasynthase gener som kan överstiga 10 kb i längd. Tekniskt kan syntes åstadkommas, men det är utmanande och kostsam. Det förväntas att kontinuerlig improvemmedelsingredienser i gensyntes teknik kommer att behandla aktuella nackdelar och ytterligare validera denna metod för att ge heterologt genetiskt material.
- Utför PCR med användning nyberedd S. erythraea genomiskt DNA som templat. Det kromosomala DNA kan framställas från kulturer av S. erythraea eller frysta lager av bakterien (figur 3) 25. PCR-reaktioner kan dra nytta av tillsats av DMSO (4 pl i 50 pl reaktioner) att ta hänsyn till högt G+ C-halt i målet S. erythraea gener. Varje amplifierad gen bör sekvenseras för att bekräfta att hela genen har hämtats och att inga mutationer har introducerats under PCR-processen.
- Genom restriktionsklippning och ligering sätter varje isolerade gener i expressionsvektorer utformade för E. coli (figur 3). Detta initieras genom att utforma restriktionssäten inom PCR-primers för att medge spjälkning och ligering till lämplig expression vektorer (exempel har inkluderats i figur 3). Vi har använt både pET21 och pET28 vektorer. Det pET28 vektorn tillåter införandet av en 5 "ledarsekvens som hjälp genuttryck i erytromycin Ett fall. Bekräfta individuell genuttryck genom RT-PCR, SDS-PAGE-analys (med användning av lösliga proteinfraktioner), eller lämpliga fenotypiska analyser (Figur 4).
- Konstruera operon baserade på gener framgångsrikt uttrycks från enskilda expressionsplasmider (Figur 3). Vi har traditionellt använt kombinationer av kompatibla-sammanhängande restriktionsenzymer (t.ex. Xbal och Spe I) 24 till följd konvertera gener till operon, men måste restriktionsställena valts för operon konstruktion inte bosatta inom (eller måste tas bort från) den isolerade gensekvenser (en fråga som kan undvikas om gensyntes används). Detta steg konsoliderar 20 erytromycin A gener före E. E. coli Transformation. För närvarande har vi använt denna metod för att omfatta upp till 20 kb av främmande DNA i en standard-PET vektor (två gener ~ 10 kB vardera). Dessutom har vi använt denna metod för att generera operon innehåller nio gener. Det är okänt exakt hur mycket DNA eller hur många gener kan integreras i pET-typ plasmider, men måtten ovannämnda tillhandahålla en referens för komplicerade system såsom erytromycin biosyntesvägen. Slutligen, standard ligering in vitro steg och efterföljande framgångarna omvandling blir allt svårare eftersom operon och plasmid ökar storleken. Ligation temperatur (12-22 ° C) och tid (3-24 timmar) är varierad och elektro-omvandling används för att underlätta arbetet med att producera slutliga plasmidkonstruktioner.
- Förvandla de nydesignade biosyntetiska plasmider till E. coli-stam med användning BAP1 elektro-omvandling (figur 5). Förfarandet kan prövas med plasmider infördes antingen sekventiellt eller i samtidigmbination. När du omformar storlek kan eller flera plasmider, har vi använt traditionellt elektro-omvandling (i motsats till kemisk omvandling). När transformerade, tallrik cellerna på fast LB-medium innehållande tetracyklin (5 mg / l), karbenicillin (100 mg / l), kanamycin (50 mg / l), streptomycin (50 mg / l), och apramycin (50 mg / l ) för att välja för plasmiden underhåll. Det är mycket ovanligt att använda sex olika val antibiotika efter omvandling av ett E. coli-cell, men detta beror helt enkelt på totala antalet plasmider som behövs för att tillåta slutlig erytromycin A biosyntes. Medan det är möjligt kommer metoden att begränsa den faktiska produktionskapaciteten i föreningen när odling har börjat (se nedan).
2. E. E. coli Biosyntetiska Rekonstituering
- Stam BAP1 har utformats för att ge de nödvändiga substrat för biosyntes och till post-translationellt modifiera deoxyerythronolide B-megasynthase. Enskilda gener i erythromycin en väg har testats för genuttryck och konsolideras som operoner i expressionsplasmider. Detta avsnitt är tillägnad odlingsbetingelser för att testa för en samlad aktivitet av hela erytromycin en väg.
- Ta 3 separata kolonier av den nyligen transformerade BAP1 och ympa 1,5 ml kulturer LB innehållande de erforderliga plasmid urval antibiotika (vid samma koncentrationer som angivits ovan för att selektera för transformanter på fast medium), isopropyl β-D-1-tiogalaktopyranosid (IPTG; 100 pM ) och arabinos (2 mg / ml) för att inducera genuttryck, och 20 mM natriumpropionat att stödja intracellulär bildning biosyntetisk prekursor. När produktionen har bekräftats, kan större kulturer utföras i ett försök att skala och maximera produktens titrar.
- Odla cellerna vid 22 ° C och 250 rpm under 24-48 timmar. I detta fall säkerställer antibiotikaselektion att de nödvändiga plasmiderna bibehålls i de tidiga stadierna av cellulär kultur. Emellertid plasmidenS kan lätt förloras som val antibiotika nivåer förändras under loppet av odling perioden. Detta kan leda till plasmidinstabilitet (dvs förlust av en eller flera plasmider under odling), som sedan skulle begränsa produktionen kapacitet. Problemet förvärras när inkompatibla plasmider används för att introducera en komplett heterolog genkluster. Så är fallet för erytromycin En förening (Figur 5) och skulle behöva åtgärdas för att verkligen överproducera föreningen från E. coli. För att demonstrera första produktion är sådana konstruktionsfel tolereras för den skull snabbt fastställa genomförbarheten av den heterologa strategi.
- Klargöra kulturerna genom centrifugering vid 10.000 rpm i en Eppendorf mikrofug. Avlägsna supernatanten och lagra vid 4 ° C för analys.
- I fallet erytromycin A, brist på förening produktionen upp genom införandet av GroES / EL chaperonin (med pGro7speciellt för att hantera bristen på aktivitet hos enzymerna efter uttryck) och införandet av ytterligare genkopior (för dessa gener misstänks svagt uttryck / aktivitet). Liknande strategier kan behövas med andra heterologa naturliga insatser produktframtagning.
3. Produkt Analys
- För att bekräfta och kvantifiera erytromycin A bildning injicera odlingssupernatanten på en LC-MS-system (figur 6). Kommersiellt tillgänglig erytromycin A användes för att bekräfta produktionen och som en standard under kvantifiering. För fall utan kommersiellt tillgängliga standarder, skulle LC-MS-analys kräver ytterligare kemisk karakterisering medelst NMR och högupplösande masspektrometri.
- Jämför produktionen mellan de 3 kolonierna / kulturer från BAP1 omvandlingen. Välj den högsta producenten och förbereda en glycerol lager från kolonin källan. Detta steg kan göras parallellt med produktionen kulturer protokollenheten2 genom att använda en liten del av kulturerna för framställning glycerolstamlösningar. Förvara glycerolförråd i en -80 ° C frysanordning.
- Med hjälp av bekräftade högsta producerande celler lager, börjar en separat produktion kultur och extrahera den slutliga supernatanten med 2x volym etylacetat. Använd ett vakuum avdunstningssystemet att torka extraktet och återsuspendera i 100 ^ metanol. Överför extraktet till ett sterilt filter skiva (~ 1/4 tum diameter) och låt skivan torka. Separat kultur B. subtillis i LB vätska natten. Tillsätt 20 | il av B. subtilis kultur till 20 ml flytande LB-agar vid 45 ° C. Platta ägarn och låt stelna. Placera filtret skivan på plattan och inkubera vid 37 ° C (figur 7). Alternativt, kan extraktet sättas till vätskeformiga kulturer i en 96-brunnars platta för att kvantifiera aktiviteten med en plattläsare (Figur 7).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Det önskade resultatet av denna metod är framställningen av en fullt bioaktiv naturlig produkt från E. E. coli heterologa värden. Detta är bäst representeras av LC-MS resultat som används för att bekräfta och kvantifiera produktionen (Figur 6) och det antibakteriella bioanalys används för att bekräfta sista aktivitet (Figur 7). I det övergripande system av heterologa biosyntesen definierar detta resultat framgång. När åstadkommit, forskningsinsatser vänder sedan till optimering (både de cellulära och process skalor) och molekylär teknik. De slutliga målen är ekonomiska produktionsprocesser för den ursprungliga föreningen och kontroll över heterologa systemet så att rationella modifieringar av processen kan fås att producera varianter av den ursprungliga föreningen med potential för en ökad eller breddad verksamhet spektrum.
Underlåtenhet att ge den önskade föreningen utlöser sedan många beredskapsplaner to bedöma vilken del av tillvägagångssätt förbjuder lyckad biosyntes. Många av dessa felsökning mekanismer inbyggda i det förfarande som beskrivs ovan. I vår erfarenhet, är det viktigt, vid ett minimum, för att bekräfta lyckad genuttryck (SDS-PAGE-analys av lösliga biosyntetiska enzymer) av den nyligen införda genklustret före försöker bedöma biosyntes av den bildade naturliga produkten. Post uttryck, som anges ovan, har användningen av chaperones proteinveckning, förbättrad antal genkopior och processtemperatur varit effektiva medel för att tillåta eventuell biosyntes.
Figur 1. En övergripande bild av heterologa naturprodukt biosyntetiska systemet med erytromycin En förening. De experimentella steg som krävs inkluderar 1) konstruktion och överföring av erytromycin genklustret frOM S. erythraea till E. E. coli, 2) beredning av biosyntes i E. coli, och 3) produkt analys av erytromycin A.
Figur 2. A. erytromycin genklustret som organiseras i den infödda S. erythraea kromosom. B. erytromycin A biosyntes. Inom E. E. coli är SFP enzym som krävs för posttranslationell modifiering av DEBS1, 2, och 3 polyketid enzymer syntas (vardera> 300 kDa), vilket betecknas med den anslutande armen förbunden med varje AVS domän. De debs enzymerna bildar en α 2 β 2 γ 2 komplex uppdelad i modul enheter som katalyserar de på varandra följande kondensationer av en starter propionyl-CoA-enhet och sex (2 S)-metylmalonyl-CoA extender-enheter för att bilda polyketid 6-deoxyerythronolide B (6dEB). KS-ketosynthase, AT-acyltransferas, AVS-acylbärarprotein, KR-ketoreduktas (med den inaktiva KR konstaterade i modul 3), DH-dehydratas, ER-enoyl reduktas, TE-tioesteras. En PrpE (propionyl-CoA-syntetas) och PCC (propionyl-CoA karboxylas, som består av två proteinsubenheter) krävs för att omvandla exogent propionat till utgångs substraten propionyl-CoA och (2 S)-metylmalonyl-CoA. Generna för SFP och PrpE tidigare konstruerad i BAP1 E. coli-kromosomen 19. Omvandling av 6dEB molekylen till erytromycin sker genom deoxysugar biosyntes och fastsättning, extra sömnad, och själv-motstånd enzymer. Klicka här för att se större bild .
Figur 3. A. Isolering av enskilda gener som krävs för erytromycin A biosyntes (exklusive de tre Debs gener). Individuell plasmid design inklusive PCR oligonukleotidprimrar används för att isolera eryCI, primer restriktionsställen har angivits i fetstil och kompletterande sekvens har betonats. Dessutom ingår en restriktionsanalys av de resulterande pET21 och pET28 vektorer innehållande enskilda gener och operon. B. i.. Konsolidering av biosyntetiska gener som behövs för polyketide skräddarsy som operoner för introduktion till E. . coli. ii restriktionsställen och andra element uttryck arbetar med operon konstruktion och design, X / S representerar den kompatibla-sammanhängande ligering av Xbal-och Spe I ställen vilket resulterar i en ny sekvens okänd med antingen restrictipå enzym. Klicka här för att se figur 3 .
Figur 4. A. SDS-PAGE-analys av de individuella gener presenteras i figur 3. Asteriskerna markerar de gener som uttrycks med 5 'ledarsekvenser följd av pET28 expressionsvektorn. B. Fenotypisk bedömning av Erme (erytromycin A motstånd). Erytromycin A inom det fasta mediet användes för att testa E. coli-stammar som härbärgerar plasmider med eller utan ermE erytromycin A resistensgenen. Celltillväxt räddas med med ermE uttryck.
Figur 5. A. Schematisk av hela erytromycin en väg infördes till E. coli, inklusive en plasmid för GroEL / ES chaperonin (pGro7) och en plasmid innehållande en extra kopia av eryK. B. Transformation jämförelse mellan kemiska och elektro metoder med användning av både kombinationen (i) och sekventiell (ii) införande av plasmider. C. Plasmiden stabilitet transformerad stam. Klicka här för att se större bild .
Figur 6. En standard LC-MS spår av erytromycin A framställts från E. coli.
Figur 7. A. Fastfas bioanalys av filter skivor som innehåller i.. Utdrag ur en oinducerade BAP1 E. coli negativ kontroll, ii kommersiellt tillgänglig erytromycin A (positiv kontroll),.. och iii erytromycin A extraherad från en inducerad BAP1 E. E. coli systemet. Skivorna placerades på en matta av B. subtilis bakterier och resultatet hämningszoner indikerar antibiotisk aktivitet. B. Analys visats i vätskefas med 96-brunnsplatta prover tidsförlopp. Klicka här för att se större bild .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kritiska steg i heterologa biosyntesen påträffas vid de tre processrättsliga punkter i processen: 1) genetisk överföring, 2) biosyntetiska rekonstituering, och 3) produktanalys. Ett problem i något skede kommer att spåra ur det yttersta målet att inrätta heterologt biosyntes. Kanske den mest utmanande aspekten av processen är att etablera rekonstituerade biosyntes, eftersom detta är absolut nödvändig för att möjliggöra framgångsrik analys. Dock är beredning beroende noggrann design och överföring av det genetiska materialet som ansvarar för eventuell biosyntes. Likaså etablerad, kan känsliga analysmetoder (som LC-MS) upptäcka små titer nivåer som annars kan tolkas som brist på produktionen. Det är kulmen på dessa situationer som gör heterolog biosyntes utmanande.
Med avseende på erytromycin A exempel bekräftades gensekvenser isolerade genom PCR individuellt testas för EXPression innan konsolidera generna för samordnad uttryck och naturlig produkt bildas. Under första försök till produktanalys har intermediärföreningar först identifierades endast när en chaperonin (GroEL / ES) samuttrycktes med erforderlig genklustret. Slutprodukten var bara produceras när en extra kopia av genen som ansvarar för det sista steget i biosyntesen (eryK) ingick. Båda dessa åtgärder dragit nytta av känsliga LC-MS analysmetod används för att initialt utvärdera produktionen.
Nu när produktionen har bekräftats, E. E. coli cellulära bakgrunden erbjuder många tekniska möjligheter. Den första är att optimera produktionen av det nativa erytromycin En förening. Detta skulle ge en alternativ produktion väg med potentiella besparingar i processen tid och kostnad. Vidare, en väg erytromycin kan manipuleras för att diversifiera produktbildning. Nya analoger erbjuderpotential nytt antibiotikum (eller annan terapeutisk) aktivitet. Samma möjligheter finns för allmänna tillämpningar av heterolog biosyntes och ge den primära motivation för strategi, ytterligare av de utmaningar som uppstått med många ursprungliga producerande organismer. Kontinuerliga tillämpningar och förbättringar av det tillvägagångssätt som beskrivs i den här artikeln kommer att öka frekvensen av framtida heterologa biosyntetiska framgång.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Författarna tackar NIH (AI074224 och GM085323) och NSF (0.712.019 och 0.924.699) för finansiering för att stödja projekt avsedda för heterologa biosyntesen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PCR machine | Eppendorf | Mastercycler personal | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Fisher | BP231 | |
| Electroporator | BioRad | Micropulser | |
| IPTG | Fisher | BP1620 | |
| Sodium propionate | Sigma | P1880 | |
| L-arabinose | Sigma | A3256 | |
| Refrigerated Shaker | Thermo Scientific | MaxQ 4000 | |
| Microfuge | Eppendorf | Centrifuge 5415D | |
| pGro7 | Takara | Chaperone Plasmid Set (3340) | |
| pET21, pET28, pCDF-Duet-1 | EMD Chemicals | 69742-3, 69864, 71340 | |
| LC-MS | Applied Biosystems | 3200 Q-Trap | |
| Ethyl acetate | Sigma | 270989 | |
| Methanol | Sigma | 322415 | |
| Vacuum centrifuge | Eppendorf | Concentrator 5301 | |
| Rotary Evaporator | Buchi | R-200 |
References
- Adrio, J. L., Demain, A. L. Genetic improvement of processes yielding microbial products. FEMS Microbiol. Rev. 30, 187-214 (2006).
- Brunker, P., Minas, W., Kallio, P. T., Bailey, J. E. Genetic engineering of an industrial strain of Saccharopolyspora erythraea for stable expression of the Vitreoscilla haemoglobin gene (vhb). Microbiology. 144 (Pt. 9), 2441-2448 (1998).
- Chen, Y., et al. Genetic modulation of the overexpression of tailoring genes eryK and eryG leading to the improvement of erythromycin A purity and production in Saccharopolyspora erythraea fermentation. Appl. Environ. Microbiol. 74, 1820-1828 (2008).
- McGuire, J. M., Bunch, R. L., Anderson, R. C., Boaz, H. E., Flynn, E. H., Powell, H. M., Smith, J. W. "Ilotycin," a new antibiotic. Antibiot & Chemother. 2, 281-284 (1952).
- Minas, W., Brunker, P., Kallio, P. T., Bailey, J. E. Improved erythromycin production in a genetically engineered industrial strain of Saccharopolyspora erythraea. Biotechnol. Prog. 14, 561-566 (1998).
- Zou, X., Hang, H. F., Chu, J., Zhuang, Y. P., Zhang, S. L. Oxygen uptake rate optimization with nitrogen regulation for erythromycin production and scale-up from 50 L to 372 m3 scale. Bioresour. Technol. 100, 1406-1412 (2009).
- Zhang, H., Boghigian, B. A., Armando, J., Pfeifer, B. A. Methods and options for the heterologous production of complex natural products. Nat. Prod. Rep. 28, 125-151 (2011).
- Cortes, J., Haydock, S. F., Roberts, G. A., Bevitt, D. J., Leadlay, P. F. An unusually large multifunctional polypeptide in the erythromycin-producing polyketide synthase of Saccharopolyspora erythraea. Nature. 348, 176-178 (1990).
- Donadio, S., Staver, M. J., McAlpine, J. B., Swanson, S. J., Katz, L. Modular organization of genes required for complex polyketide biosynthesis. Science. 252, 675-679 (1991).
- Salah-Bey, K., et al. Targeted gene inactivation for the elucidation of deoxysugar biosynthesis in the erythromycin producer Saccharopolyspora erythraea. Mol. Gen. Genet. 257, 542-553 (1998).
- Summers, R. G., et al. Sequencing and mutagenesis of genes from the erythromycin biosynthetic gene cluster of Saccharopolyspora erythraea that are involved in L-mycarose and D-desosamine production. Microbiology. 143, 3251-3262 (1997).
- Corre, C., Challis, G. L. New natural product biosynthetic chemistry discovered by genome mining. Nat. Prod. Rep. 26, 977-986 (2009).
- McAlpine, J. B. Advances in the understanding and use of the genomic base of microbial secondary metabolite biosynthesis for the discovery of new natural products. J. Nat. Prod. 72, 566-572 (2009).
- Nett, M., Ikeda, H., Moore, B. S. Genomic basis for natural product biosynthetic diversity in the actinomycetes. Nat. Prod. Rep. 26, 1362-1384 (2009).
- Oliynyk, M., et al. Complete genome sequence of the erythromycin-producing bacterium Saccharopolyspora erythraea NRRL23338. Nat. Biotechnol. 25, 447-453 (2007).
- Wilkinson, B., Micklefield, J. Mining and engineering natural-product biosynthetic pathways. Nat. Chem. Biol. 3, 379-386 (2007).
- Gokhale, R. S., Tsuji, S. Y., Cane, D. E., Khosla, C. Dissecting and exploiting intermodular communication in polyketide synthases. Science. 284, 482-485 (1999).
- Quadri, L. E., et al. Characterization of Sfp, a Bacillus subtilis phosphopantetheinyl transferase for peptidyl carrier protein domains in peptide synthetases. Biochemistry. 37, 1585-1595 (1998).
- Pfeifer, B. A., Admiraal, S. J., Gramajo, H., Cane, D. E., Khosla, C. Biosynthesis of complex polyketides in a metabolically engineered strain of E. coli. Science. 291, 1790-1792 (2001).
- Lee, H. Y., Khosla, C. Bioassay-guided evolution of glycosylated macrolide antibiotics in Escherichia coli. PLoS Biol. 5, e45 (2007).
- Peiru, S., Menzella, H. G., Rodriguez, E., Carney, J., Gramajo, H. Production of the potent antibacterial polyketide erythromycin C in Escherichia coli. Appl Environ Microbiol. 71, 2539-2547 (2005).
- Peiru, S., Rodriguez, E., Menzella, H. G., Carney, J. R., Gramajo, H. Metabolically engineered Escherichia coli for efficient production of glycosylated natural products. Microbial Biotechnology. 1, 476-486 (2008).
- Zhang, H., Skalina, K., Jiang, M., Pfeifer, B. A. Improved E. coli erythromycin a production through the application of metabolic and bioprocess engineering. Biotechnol. Prog. 28, 292-296 (2012).
- Zhang, H., Wang, Y., Wu, J., Skalina, K., Pfeifer, B. A. Complete biosynthesis of erythromycin A and designed analogs using E. coli as a heterologous host. Chem. Biol. 17, 1232-1240 (2010).
- Kieser, T., Bibb, M. J., Buttner, M. J., Chater, K. F., Hopwood, D. A. Practical Streptomyces Genetics. , The John Innes Foundation. Norwich, UK. (2000).
