Summary
“
Abstract
果蝇的复眼由约750小眼（单位只眼）。每个小眼组成的约20个细胞，包括镜头的分泌视锥细胞，色素细胞，刷毛细胞和8感光体（的PR）R 1-R 8 2。永久居民有专门的微绒毛的结构，rhabdomeres，其中含有光敏感的的颜料，Rhodopsins（右轴）。 6的PR（R1-R6）的rhabdomeres形成一个梯形和包含Rh1对3 4。 R7和R8的rhabdomeres串联在梯形的中心被定位在共享相同的路径的光。 R7和R8永久居民的随机表达不同的组合RHS在两个主要的亚型5的'p'亚型，RH3 在 p R7S加上RH5 在 p R8S，而在'Y'亚型，与RH4 在 y R7S RH6 在 y，R8S 6 7 8。
PR和发展，就要有规范的早期开始在幼虫眼触角成虫盘，单层的上皮细胞。差异化的浪潮席卷盘9和启动组件的未分化细胞，成小眼10-11。的创始人细胞的R8被指定为第，并招募R1-6和R7 12-14。随后，在蛹的发展，PR分化导致广泛的形态学改变，15日 ，，包括rhabdomere形成，突触形成和最终RH表达。
在这个协议中，我们描述了在三个定义的视网膜发育期，可应用于视网膜的形成和发展途径，以解决各种问题的视网膜解剖和免疫组化的方法。在这里，我们使用这些的方法可视化逐步PR分化，在单细胞水平在整个安装幼虫，midpupal和成人视网膜（
Protocol
1。介绍
在这段视频中，我们将介绍三个定义的发育时期的视网膜解剖和免疫组织化学的方法：三龄幼虫，midpupal和成人阶段。虽然我们的协议也适用于其他蛹的阶段（早期阶段的详细信息，请参阅16），我们选择了midpupal的阶段，因为它是最佳的成像PR在一个焦平面，其核很容易识别，方便的可视化转录因子的表达模式。后期蛹视网膜剥离是非常相似的的成人视网膜剥离的。
首先，我们展示了如何收集幼虫和蛹在需要的阶段。然后，我们将解释如何获得最佳的解剖幼虫17日至18日 ，midpupal和成人视网膜。第二，我们展示了如何理解PR在这些阶段，采用免疫组织化学和激光共聚焦显微镜的发展。
昆虫的发育时期是温度依赖的。为了促进再生分期幼虫和蛹，我们建议提高都飞股票在25°C下一个12 hr/12小时，光/暗周期。
三龄幼虫产卵后约96小时（25°C），晚三龄幼虫停止摄食，漫步在墙壁上的食品瓶，在那里他们最终化蛹。使用软刷或镊子轻轻取出一个流浪的第三龄幼虫从墙上的食品瓶。
50％的蛹（“midpupae）约48小时后观察化蛹。对于确切的时间，你可以圆刚形成的白色蛹与食品瓶上的标记。或者，将所有白色的蛹获得一个新的小瓶一小瓶均匀分期（分期蛹的形态标准，请参阅19）。 48小时后，仔细REM从小瓶奥雅纳的midpupae，使用的钳子。
成虫：在CO 2焊垫的麻醉年轻的成年果蝇（羽化后2-5天）。使用镊子取出头，并将其储存在一个玻璃皿冷1X PBS。
3。解剖过程（大约1-2小时，每次实验）
收集标本后，将它们放置在Sylgard的解剖盘上一个冷PBS下降。每型约10-15视网膜解剖。
请参阅材料安全数据表以及机构的环境，健康和安全办公室的试剂和设备的妥善处理（见表结束时本协议）。
1。幼虫眼成虫盘
- 定位前端的幼虫，其中包含了口钩。使用钳子Sylgard的菜的基础上，轻轻地按中间部分的幼虫。使用另一个呃钳抢口钩，拉轻轻地，慢慢远离身体。丢弃的主体的主要部分的，并使用口器持有的前部，以去除多余的组织，保持连接到大脑从成虫盘。
- 大脑与成虫盘传输1X PBS三以及玻璃盘钳子抓住了嘴钩。执行固定步骤（步骤4.1）。
- 固定后，取出唾液腺，脂肪组织和远离拉大脑，眼触角成虫盘。为了改善可访问性“困难”抗体，peripodial膜，它位于的表面上的上皮细胞，可以除去通过按住触角的盘的一部分和与解剖销剥离膜。接下来，进行免疫组织化学（步骤5.1）。
2。 50％的化蛹/ Midpupal视网膜
- 按住后端蛹的情况下，用钳子。蛹的情况下轻轻地取出前表面通过抓的角质层与其他镊子从puparium，慢慢地拉开了距离。剥离残留表皮，露出头。
- 使用镊子提示刺穿的基础，软袋背前区。这提供了访问的头部。与P20吸管慢慢地吸了头，轻轻分开的头胸部。到冷鲜1X PBS驱逐头移液器吸头，去除多余的组织;抢头角质层，去除长鼻。继续固定步骤（步骤4.1）。
- 皮尔斯视叶一个稳定的组织解剖针。将其他解剖针之间的层和视网膜分离的视网膜层/视叶。进行免疫组化（步骤5.1）。
3。成人眼
- 抓住中心，钳子和删除后头壳口器（喙），脂肪TISSUE和气管。
- 用一个镊子，从脑组织中分离的眼睛，轻轻拉动侧身抢背头角质层。在大多数情况下，薄片，薄且透明的护套的脑的神经纤维，将保持附着到视网膜。这是比较容易除去叶片固定后。
- 去除死皮的眼缘，但背后留下一小片，视网膜转移，以方便不同的解决方案。执行固定（步骤4.1）。
- 将椎板一侧钳子抓住它，和其他镊子轻轻侧身拉不损害视网膜。清除残留的角质层，在安装过程中，因为它可以折叠到视网膜上。这两个步骤是至关重要的，否则将被遮蔽的叶片，保持角质层在成像过程中的光感受器，可视化。继续进行免疫组化（步骤5.1）。
4。固定和天鹰毫微克（约1小时）
- 存储解剖视网膜在1x PBS，放置在冰中，而新鲜制备的固色剂（稀释40微升37％的甲醛溶液，用360μl的1×PBS中，在冰上的涡流和存储）中的3孔的玻璃皿。我们建议继续与固定协议和冰（15分钟），以避免长期储存时间。
- 更换1倍的PBS，用200μl3.7％的甲醛溶液。确保组织被淹没在固色剂。这是非常重要的，因为它可能无法被正确固定。如果有必要，去除气泡和气管的镊子。
- 混和器中研磨15分钟，在室温下孵育。
- 更换固色剂用1×PBS，用1×PBS冲洗两次。继续在PBS中洗涤30分钟（振动筛，在室温下）。
- 更换PBS与PBST。用PBST冲洗两倍。
- 继续与删除的peripodial的保护膜，幼虫眼盘（3.1.3）和纹层从midpupal /成人视网膜<强>（3.2.3，3.3.4）。
5。免疫组化
- 阻断：替换在PBST中并孵育视网膜上摇动器在室温下20分钟的5％正常血清用200μl的PBS。
- 更换阻断溶液与初级抗体溶液。用封口膜密封的三个阱培养皿，并在摇动器在室温下孵育过夜。
- 更换溶液用PBST冲洗3次。继续用PBST洗涤为在室温下至少1小时摇床。
- 转移的二次抗体溶液和石蜡膜密封的玻璃皿上摇动器在室温下过夜孵育。
- 替换的抗体溶液，用PBST冲洗三次。继续用PBST洗涤为在室温下至少1小时摇床。可将样本保持在PBST数天，但它是至关重要的，添加新鲜的PBST，每天至少一次，以防止它们干燥。
6。中号ounting
- 用于安装幼虫和midpupal的视网膜中 ，使用的P20视网膜转移到干净的载玻片上的中心。删除多余的PBST。使用钳子对准视网膜，以促进成像。
- 加入10μl视网膜上安装介质。轻轻地用一个24X40-1的盖玻片和密封与透明指甲油覆盖它们。
- 成人视网膜安装，准备“桥梁”20：添加两个5微升滴50％甘油的玻璃侧的两端，并覆盖22X22-1盖玻片（0.13至0.17毫米厚）。
- 与P20吸管取出PBST;，确保视网膜干不出来。加入20μl的良好的安装介质。使用安装介质转移视网膜的P20的“桥梁”的载玻片上。
- 使用钳子东方（镜头要面对的载玻片上）和调整为了方便成像视网膜。如果有必要，去除气泡的P20。
- 慢慢地地方24X40-1盖玻片（0.13至0.17毫米厚），从一个侧面顶部和密封边与透明指甲油或透明胶带。店内样品在显微镜载片上保护盒在4°C（保持在黑暗中）。
7。代表性的成果
本协议的应用程序作为一个例子，我们显示出有代表性的三个发展阶段，在视频可视化光感受器分化的结果。甲幼虫眼触角的圆盘和一个midpupal的的视网膜染色标记不同的感光器类型的抗体，在他们的发展（ 图1A，B）和两个视紫红质抗体染色成人视网膜感光亚型（ 图1C）可视化。
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Discussion
1。故障排除
根据我们的经验，解剖需要实践（可长达数周），并促进实现舒适的手位21搁在桌子上，肘部和前臂和手指接触的解剖盘。这样一来，只有拇指，食指和中指进行细微的动作。
卸下椎板不损坏感光体的情况下可能是最具挑战性的步骤。红眼野生型的实践与飞白眼突变体解剖，第一层是对红色的眼睛色素沉着更容易看到。此外，使用灯光从下面的解剖盘落后和黑暗的背景，以达到最佳的对比度。
然而，红眼颜料是荧光的，在成像过程中，并可能导致高背景。这可以削弱信号从次级抗体。一个好的策略是科EP洗涤的成人视网膜四到五天，，更换新鲜PBST清洗液和每天至少一次。颜料将被淘汰，一定要洗实验组和对照的基因型相同的时间。
2。应用
眼部专用的损耗和增益的功能接近22 23 果蝇眼睛的遗传操作和屏幕的一个特别强大的系统。此外，最近开发的计算方法为单细胞分析的整个视网膜的三维重建允许在高分辨率24突变体的表型分析。因此，该协议可以被应用到各种问题，关于眼睛的发育和底层的监管机制16,25-28。
图1视网膜全米。ounts在三个不同的发展阶段。 A）幼虫眼盘抗体染色七喜（绿色）和侏儒（洋红色）的。 B）Midpupal视网膜。抗体用于可视化的所有感光器R1-R8（ELAV，蓝）和R7感光器（普洛斯彼罗，青色）。 C）成人视网膜。随机和互斥的感光颜料RH5（青色）和RH6（红色）在两种亚型的R8光感受器中的表达。
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Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
这项工作是由陆国际律师事务所奖学金HY支持。 H.，一个简棺童车纪念医学研究的博士后研究基金RJJ，美国国立卫生研究院资助F32EY016309到DV，纽约州立大学的教务长的论文奖学金DJ，NIH GrantR01 EY13010到CD和一个DFG奖学金JR（RI 2208/1- 1）。我们感谢龚如心Vogt和帕梅拉Boodram的手稿上的评论。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent | |||
| Phosphate-buffered saline (PBS1x, pH 7.4) | Sigma | Prepare 10x stock solution 20. Dilute with distilled water to obtain 1x PBS and store at room temperature. Cool on ice before dissections. | |
| Triton-X 100 | Sigma | 9002-93-1 | Caution: Irritant! Wear gloves. Prepare 50 ml 1xPBS with 0.3% Triton X-100 (PBST). Store at room temperature. |
| 37% formaldehyde solution | Fisher Scientific | F75P1GAL | Caution: Toxic, probable human carcinogen! Wear gloves. Before the fixation step, freshly prepare 3.7% solution in a chemical fume hood by diluting with PBS, store on ice. |
| 5% normal horse serum | Jackson Immuno Research | 008-000-001 | Prepare 5% v/v dilution in PBST. Store at four degrees. |
| Primary and secondary antibodies (e.g. Donkey anti-sheep Alexa Fluor 488, Donkey-anti rabbit Alexa Fluor 555, Donkey anti-mouse Alexa Fluor 647) | Invitrogen Molecular Probes | A11015 A31572 A31571 |
Dilute secondary antibodies 1:800 in PBST and store at four degrees. |
| Alexa Fluor 488 Phalloidin | A12379 | Dilute 1:100 in secondary antibody solution. | |
| Slowfade Gold Antifade reagent | Invitrogen Molecular Probes | S36936 | Mounting medium. Store at -20 degrees. |
| Glycerol | Fisher Scientific | G31-1 | For mounting. Prepare 10 ml of 50% dilution with distilled water, store at room temp. |
| CO2 | For anesthetizing adult flies. | ||
| Equipment | |||
| Two sharp forceps (Dumont #55) | Fine Science Tools | 11255-20 | |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | Prepare Sylgard dissection dish by filling a plastic Petri dish with Sylgard mixture. | |
| Three-well glass dissection dishes | Fisher Scientific | 21-379 | |
| Two minutien dissecting pins (0.1 mm diameter) and two pinholders (12 cm) | Fine Science tools | 26002-10 | Insert one minutien pin in each of the two pinholders and bend one of the pins to form a hook. |
| Microscope cover slips (22x22-1 and 24x40-1) | Fisher Scientific | 12-542A | |
| Microscope slides (25x75x1.0 mm; precleaned) | Fisher Scientific | 12-550-143 | |
| 1.5 ml microcentrifuge tubes | |||
| Clear nail polish or Scotch tape | |||
| Orbital shaker | Bellco | ||
| Slide holder box | Fisher Scientific | ||
| Parafilm | Bemis | PM996 | |
| Thin paintbrush | |||
| P20 and P200 micropipettes and tips | |||
| Dissecting microscope | |||
| Small bucket with ice | For cooling the glass well plates, dissected retinas and solutions. |
References
- Ready, D. F., Hanson, T. E., Benzer, S. Development of the Drosophila retina, a neurocrystalline lattice. Dev. Biol. 53, 217-240 (1976).
- Hardie, R. C. Functional organization of the fly retina. Sensory Physiology. D, O. ttoson 5, Springer-Verlag. 1-79 (1985).
- O'Tousa, J. E. The Drosophila ninaE gene encodes an opsin. Cell. 40, 839-850 (1985).
- Zuker, C. S., Cowman, A. F., Rubin, G. M. Isolation and structure of a rhodopsin gene from D. melanogaster. Cell. 40, 851-858 (1985).
- Rister, J., Desplan, C. The retinal mosaics of opsin expression in invertebrates and vertebrates. Dev. Neurobiol. 71, 1212-1226 (2011).
- Chou, W. H. Identification of a novel Drosophila opsin reveals specific patterning of the R7 and R8 photoreceptor cells. Neuron. 17, 1101-1115 (1996).
- Chou, W. H. Patterning of the R7 and R8 photoreceptor cells of Drosophila: evidence for induced and default cell-fate specification. Development. 126, 607-616 (1999).
- Papatsenko, D., Sheng, G., Desplan, C. A new rhodopsin in R8 photoreceptors of Drosophila: evidence for coordinate expression with Rh3 in R7 cells. Development. 124, 1665-1673 (1997).
- Wolff, T., Ready, D. F. The beginning of pattern formation in the Drosophila compound eye: the morphogenetic furrow and the second mitotic wave. Development. 113, 841-850 (1991).
- Roignant, J. Y., Treisman, J. E. Pattern formation in the Drosophila eye disc. Int. J. Dev. Biol. 53, 795-804 (2009).
- Tsachaki, M., Sprecher, S. G. Genetic and developmental mechanisms underlying the formation of the Drosophila compound eye. Dev. Dyn. 241, 40-56 (2012).
- Tomlinson, A., Ready, D. F. Neuronal differentiation in Drosophila ommatidium. Dev. Biol. 120, 366-376 (1987).
- Zipursky, S. L. Molecular and genetic analysis of Drosophila eye development: sevenless, bride of sevenless and rough. Trends Neurosci. 12, 183-189 (1989).
- Basler, K., Hafen, E. Specification of cell fate in the developing eye of Drosophila. Bioessays. 13, 621-631 (1991).
- Charlton-Perkins, M., Cook, T. A. Building a fly eye: terminal differentiation events of the retina, corneal lens, and pigmented epithelia. Curr. Top Dev. Biol. 93, 129-173 (2010).
- Walther, R. F., Pichaud, F. Immunofluorescent staining and imaging of the pupal and adult Drosophila visual system. Nat. Protoc. 1, 2635-2642 (2006).
- Wolff, T. Histological Techniques for the Drosophila Eye Part I: Larva and Pupa. Drosophila Protocols. Sullivan, W. ea , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. (2000).
- Wolff, T. Dissection techniques for pupal and larval Drosophila eyes. CSH Protoc. 2007, pdb prot4715 (2007).
- Bainbridge, S. P., Bownes, M. Staging the metamorphosis of Drosophila melanogaster. J. Embryol. Exp. Morphol. 66, 57-80 (1981).
- Morante, J., Desplan, C. Dissection and staining of Drosophila optic lobes at different stages of development. Cold Spring Harb Protoc. , 652-656 (2011).
- Williamson, W. R., Hiesinger, P. R. Preparation of Developing and Adult Drosophila Brains and Retinae for Live Imaging. J. Vis. Exp. (37), e1936 (2010).
- Stowers, R. S., Schwarz, T. L. A genetic method for generating Drosophila eyes composed exclusively of mitotic clones of a single genotype. Genetics. 152, 1631-1639 (1999).
- Newsome, T. P., Asling, B., Dickson, B. J. Analysis of Drosophila photoreceptor axon guidance in eye-specific mosaics. Development. 127, 851-860 (2000).
- Sood, P., Johnston, R. J., Kussell, E. Stochastic De-repression of Rhodopsins in Single Photoreceptors of the Fly Retina. PLoS Comput. Biol. 8, e1002357 (2012).
- Johnston, R. J. Interlocked feedforward loops control cell-type-specific Rhodopsin expression in the Drosophila eye. Cell. 145, 956-968 (2011).
- Jukam, D., Desplan, C. Binary regulation of Hippo pathway by Merlin/NF2, Kibra, Lgl, and Melted specifies and maintains postmitotic neuronal fate. Dev. Cell. 21, 874-887 (2011).
- Vasiliauskas, D. Feedback from rhodopsin controls rhodopsin exclusion in Drosophila photoreceptors. Nature. 479, 108-112 (2011).
- Kumar, J. P. Building an ommatidium one cell at a time. Dev. Dyn. 241, 136-149 (2012).
