Summary
Den
Abstract
Forbindelsen øje Drosophila melanogaster består af omkring 750 ommatidia (enhed øjne). Hver ommatidium er sammensat af omkring 20 celler, herunder linse-udskillende tapcellerne, pigment celler, en stritter celle og otte fotoreceptorer (PRS) R1-R8 2. PRS har specialiserede microvillar strukturer, rhabdomeres, der indeholder lysfølsomme pigmenter, de Rhodopsins (RHS). De rhabdomeres af seks PRS (R1-R6) danner en trapez og indeholder RH1 3 4. De rhabdomeres af R7 og R8 er anbragt efter hinanden i midten af trapez og har samme vej lys. R7 og R8 PRs stokastisk udtrykker forskellige kombinationer af RHS i to undertyper 5: I 'p' subtype, er RH3 i p R7s koblet med RH5 i p R8s, mens der i 'y' subtype, er RH4 i y R7s forbundet med RH6 i y R8s 6 7 8.
Tidlig specifikation af PRs og udvikling af ommatidia begynder i larvens eye-antennal imaginal disc, et monolag af epitelceller. En bølge af differentiering fejer hen over skiven 9 og initierer samling af udifferentierede celler i ommatidia 10-11. Den 'grundlægger celle' R8 er angivet først og rekrutterer R1-6 og derefter R7 12-14. Efterfølgende under pupal udvikling, fører PR differentiering til omfattende morfologiske ændringer 15, herunder rhabdomere formation, synaptogenesen og til sidst rh ekspression.
I denne protokol, beskriver vi metoder til retinale dissektioner og immunhistokemi på tre afgrænsede perioder nethinden udvikling, som kan anvendes til at løse en bred vifte af spørgsmål vedrørende retinal formation og udviklingsmæssige veje. Her bruger vi disse metoder til at visualisere den trinvise PR differentiering på enkelt-celle niveau i hele mount larve, midpupal og voksen nethinder (
Protocol
1. Indledning
I denne video beskriver vi metoder til retinale dissektioner og immunhistokemi på tre definerede udviklingsmæssige perioder: den tredje stadiums larver, den midpupal og den voksne scene. Selvom vores protokol virker også på andre pupal faser (for detaljer om tidligere stadier, 16 se), valgte vi midpupal fase, da det er optimalt for billeddannelse alle PRs i ét brændplanet og deres kerner er let identificerbare, hvilket letter visualisering af transcriptionsfaktor ekspressionsmønstre. Dissektion af sene pupal nethinder er meget lig dissektion af voksne nethinder.
Først viser vi, hvordan at indsamle larver og pupper på de ønskede faser. Derefter vil vi forklare hvordan man kan opnå optimale dissektioner af larvernes 17-18, midpupal og voksne nethinder. For det andet, vi viser, hvordan visualisere PR udvikling på disse faser ved brug af immunhistokemi og konfokal mikroskopi.
Den udviklingsmæssige periode af insekter er temperaturafhængig. For at lette reproducerbar iscenesættelse af larver og pupper, anbefaler vi at hæve alle flyve lagrene ved 25 ° C under en 12 hr/12 timers lys / mørke-cyklus.
Third-stadiums larver: Om 96 timer efter æglægning (ved 25 ° C), sidste del af tredje stadiums larver stoppe fodring og vandre på væggene af den mad hætteglasset, hvor de til sidst forpupper sig. Brug en blød børste eller en pincet til forsigtigt at fjerne en omvandrende tredje stadiums larve fra væggen af fødevarer hætteglasset.
50% pupper (»midpupae«) er observeret omkring 48 timer efter pupation. For nøjagtig timing, kan du cirkel netop dannede hvide pupper med en markør på fødevarer hætteglasset. Alternativt kan flytte alle hvide pupper til et nyt hætteglas for at opnå et hætteglas med ensartet iscenesættelse (for iscenesættelse af pupper hjælp morfologiske kriterier, 19 se). Efter 48 timer omhyggeligt remove den midpupae fra hætteglasset med en pincet.
Voksne fluer: bedøver unge voksne fluer (2-5 dage efter eclosion) på en CO 2-pad. Fjern hoveder med en pincet og gemme dem i et glas godt skål indeholdende kold 1x PBS.
3. Dissektion Procedure (ca. 1-2 timer pr Experiment)
Efter opsamling af prøven, læg dem i en dråbe kold PBS på en Sylgard dissektion skål. Dissekere omkring 10-15 nethinder pr genotype.
Se venligst de sikkerhedsdatabladene samt din institutions Environmental Health and Safety Office for korrekt håndtering af reagenser og udstyr (se tabel i slutningen af denne protokol).
1. Larve Eye imaginal diske
- Find den forreste ende af larven, som indeholder munden kroge. Anvende en pincet til at trykke den midterste del af larve let mod bunden af Sylgard skålen. Brug anothis pincet til at gribe munden kroge og træk forsigtigt og langsomt væk fra kroppen. Skille hovedparten af legemet og brug munddele til at holde den forreste del for at fjerne uvedkommende væv fra de imaginære diske, der forbliver fastgjort til hjernen.
- Overfør hjerne med imaginal diske ved at snuppe munden kroge med en pincet til 1x PBS i en tre-godt glas fad. Udfør fikseringstrinet (trin 4.1.).
- Efter fiksering fjernes spytkirtler, fedtvæv og træk hjernen væk fra øjet-antennal imaginal disc. At forbedre tilgængeligheden af "vanskelige" antistoffer kan peripodial membran, som er placeret på overfladen af epithelet, fjernes ved at holde antennal del af skiven og afskalning membranen væk med et dissekerende stift. Dernæst udføres immunhistokemi (trin 5,1.).
2. 50% forpupningen / Midpupal nethinder
- Hold bageste ende af pupal tilfældet med en pincet.Fjern forsigtigt den forreste overflade af den pupal sag ved at snuppe neglebånd med en anden pincet og langsomt trække sig væk fra puparium. Skræl væk resterende neglebånd at blotlægge hovedet.
- Brug pincet 'tip til at gennembore den underliggende, bløde sæk i det dorsale anteriore region. Dette giver adgang til hovedet. Forsigtigt adskille hovedet fra thorax ved langsomt at suge op i hovedet med en P20 pipette. Pres hovedet fra pipettespidsen til frisk kold 1x PBS og fjerne overskydende væv, grab hoved neglebånd og fjerne snabel. Fortsæt til fiksering (trin 4,1.).
- Pierce optikken lap med en dissekere pin til støt vævet. Indsæt den anden dissekere stiften mellem den tynde plade og retina at adskille nethinden fra den tynde plade / optiske lap. Udfør immunhistokemi (trin 5.1.).
3. Voksen Eyes
- Tag midten af den bageste hoved kapsel med en pincet og fjerne munden dele (snabel), fedt Tissue og tracheae.
- Grib den dorsale hoved neglebånd med en pincet og bruge den anden til at adskille øjnene fra hjernevæv ved forsigtigt at trække sidelæns. I de fleste tilfælde vil den tynde plade, et tyndt og transparent kappe af hjernen neuropil, være tilsluttet til nethinden. Det er lettere at fjerne laget efter fiksering.
- Fjern neglebånd på øjet margin, men lad et lille stykke bagved for at lette overførslen af nethinder til forskellige løsninger. Udfør fiksering (trin 4.1.).
- Fjern pladen ved at gribe det på den ene side med en pincet og forsigtigt at trække sidelæns med de andre pincet uden at forringe nethinden. Fjerne resterende kutikula, som det kunne folde på nethinden under montering. Disse to trin er kritiske til visualisering af fotoreceptorer, som ellers ville være skjult af den tynde plade og rester af kutikula under billeddannelsesprocessen. Fortsæt til immunhistokemi (trin 5,1.).
4. Fiksering og Washing (ca. 1 time)
- Gemme de dissekerede nethinder i 1 x PBS i en tre-brønds glas skål anbragt på is, mens frisk fremstilling af fikseringsmiddel (fortyndes 40 mikroliter 37% formaldehydopløsning med 360 ul 1 x PBS, og prøverne opbevares på is). Vi anbefaler at fortsætte med fiksering protokollen og at undgå lange opbevaringstider på is (> 15 min).
- Erstat 1x PBS med 200 pi 3,7% formaldehydopløsning. Sørg for, at vævet er nedsænket i fiksativ. Det er kritisk, da det ellers kan ikke fastsættes korrekt. Hvis det er nødvendigt, fjerne luftbobler og tracheae med pincetten.
- Inkuber på rysteapparat i 15 minutter ved stuetemperatur.
- Erstat fiksativ med 1x PBS og skylles to gange med 1 x PBS. Fortsat vask i PBS i 30 minutter (på rysteapparat ved stuetemperatur).
- Erstat PBS med PBST. Skylles to gange med PBST.
- Fortsæt med at fjerne peripodial membran fra larve øjet diske (3.1.3.) Og lamellerne fra midpupal / voksen nethinder <strong> (3.2.3., 3.3.4.).
5. Immunhistokemi
- Blokering: Erstat PBS med 200 gl 5% normalt serum i PBST og inkuberes nethinder i 20 minutter på rysteapparat ved stuetemperatur.
- Erstat blokeringsopløsning med primær antistofopløsning. Tætne tre-og fad med parafilm og inkuberes natten over på rysteapparat ved stuetemperatur.
- Erstat opløsning med PBST og skylles 3 gange. Fortsat vask med PBST i mindst 1 time på rysteapparat ved stuetemperatur.
- Overførsel i sekundær antistofopløsning og inkuber i en parafilm-forseglet glas og skålen på rysteapparat natten over ved stuetemperatur.
- Erstat antistofopløsning med PBST og skylles tre gange. Fortsat vask med PBST i mindst en time på rysteapparat ved stuetemperatur. Prøverne kan holdes i PBST i flere dage, men det er vigtigt at tilføre frisk PBST mindst en gang om dagen for at forhindre dem i at tørre ud.
6. Mounting
- Til montering larver og midpupal nethinder, skal du bruge P20 til at overføre nethinder til midten af et rent objektglas. Fjern overskydende PBST. Anvende en pincet til at tilpasse nethinder for at lette billeddannelse.
- Der tilsættes 10 pi monteringsmedium oven på nethinde. Dæk dem forsigtigt med en 24x40-1 dækglas og tætning med klar neglelak.
- For montering voksne nethinder, forberede 'broer' 20: Tilsæt to 5 ul dråber med 50% glycerol i begge ender af et glas side og dække dem med 22x22-1 dækglas (0,13 til 0,17 mm tyk).
- Fjern PBST med en P20 pipette, sørg for, at nethinder ikke tørrer ud. Der tilsættes 20 ul monteringsmedium til brønden. Brug monteringsmedium at overføre nethinder med P20 til »bro« objektglas.
- Anvende en pincet til at orientere (linser skal vende objektglas) og juster nethinder for at lette billeddannelse. Hvis det er nødvendigt, fjerne luftbobler med P20.
- Langsomtplace 24x40-1 dækglas (0,13 til 0,17 mm tyk) fra den ene side på toppen og segl kanter med klar neglelak eller Scotch tape. Store prøver ved 4 ° C i et mikroskopobjektglas saver box (hold i mørke).
7. Repræsentative resultater
Som et eksempel på anvendelsen af denne protokol, viser vi repræsentative resultater for visualisering fotoreceptor differentiering på de tre udviklingsstadier i videoen. En larve eye-antennal skive og en midpupal retina blev farvet med antistoffer mærket forskellige fotoreceptor typer under deres udvikling (figur 1A, B) og voksen retina blev farvet med to rhodopsin antistoffer til at visualisere to fotoreceptor undertyper (figur 1C).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
1. Fejlfinding
Det er vores erfaring, kræver dissektioner praksis (op til flere uger), og lettes ved at opnå en komfortabel hånd position 21 ved at hvile albuerne og underarmene på bordet og med fingrene komme i kontakt med dissektion skålen. På den måde er det kun tommelfingre, indeks og midterste fingre udføre subtile bevægelser.
Fjernelse af hinden uden at beskadige fotoreceptorerne er sandsynligvis den mest udfordrende trin. Praksis med rød-eyed vildtype flyver først, før dissekere hvid-eyed mutanter, da den tynde plade er meget lettere at se mod den røde øjne pigmentering. Også bruge belysning bagfra og en mørk baggrund under dissektion skålen for at opnå optimal kontrast.
Men den røde øjne pigment er fluorescerende og kan forårsage højt baggrunden under billeddannende proces. Dette kan svække de signaler fra de sekundære antistoffer. En god strategi er at keep vaske voksne nethinder for fire til fem dage og erstatte vaskeopløsningen med frisk PBST mindst en gang om dagen. Pigmentet vil blive vasket ud, være sikker på at vaske eksperimentelle og kontrol genotyper for samme tidsrum.
2. Ansøgninger
Eye-specifikke tab og gevinst-of-funktionen nærmer 22 23 gør Drosophila øje et særdeles kraftfuldt system for genetiske manipulationer og skærme. Desuden nyligt udviklede beregningsmæssige metoder til enkelt-celle analyse i 3D rekonstruktioner af hele nethinder tillader analyse af mutant fænotyper i høj opløsning 24. Denne protokol kan derfor anvendes til en lang række spørgsmål om øjet udvikling og de underliggende reguleringsmekanismer 16,25-28.
Figur 1. Retinal hele mounts ved tre forskellige udviklingsstadier. A) Larvernes øje imaginal skive farvet med antistoffer mod Seven-up (grøn) og Runt (magenta). B) Midpupal retina. To antistoffer blev anvendt til at visualisere alle fotoreceptorer R1-R8 (Elav, blå) og R7 fotoreceptorer (Prospero, cyan). C) Voksen retina. Stokastiske og gensidigt udelukkende udtryk for lysfølsomme pigmenter RH5 (cyan) og RH6 (rød) i to undertyper af R8 fotoreceptorer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklæret.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af en Ehrman stipendium til HY. H., et Jane Coffin Childs Memorial Fund for Medical Research postdoc stipendium til RJJ, NIH Grant F32EY016309 til DV, en New York University Dean afhandling Fellowship til DJ, NIH GrantR01 EY13010 til CD og en DFG fællesskab til JR (RI 2208/1- 1). Vi takker Nina Vogt og Pamela Boodram om kommentarer til manuskriptet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent | |||
| Phosphate-buffered saline (PBS1x, pH 7.4) | Sigma | Prepare 10x stock solution 20. Dilute with distilled water to obtain 1x PBS and store at room temperature. Cool on ice before dissections. | |
| Triton-X 100 | Sigma | 9002-93-1 | Caution: Irritant! Wear gloves. Prepare 50 ml 1xPBS with 0.3% Triton X-100 (PBST). Store at room temperature. |
| 37% formaldehyde solution | Fisher Scientific | F75P1GAL | Caution: Toxic, probable human carcinogen! Wear gloves. Before the fixation step, freshly prepare 3.7% solution in a chemical fume hood by diluting with PBS, store on ice. |
| 5% normal horse serum | Jackson Immuno Research | 008-000-001 | Prepare 5% v/v dilution in PBST. Store at four degrees. |
| Primary and secondary antibodies (e.g. Donkey anti-sheep Alexa Fluor 488, Donkey-anti rabbit Alexa Fluor 555, Donkey anti-mouse Alexa Fluor 647) | Invitrogen Molecular Probes | A11015 A31572 A31571 |
Dilute secondary antibodies 1:800 in PBST and store at four degrees. |
| Alexa Fluor 488 Phalloidin | A12379 | Dilute 1:100 in secondary antibody solution. | |
| Slowfade Gold Antifade reagent | Invitrogen Molecular Probes | S36936 | Mounting medium. Store at -20 degrees. |
| Glycerol | Fisher Scientific | G31-1 | For mounting. Prepare 10 ml of 50% dilution with distilled water, store at room temp. |
| CO2 | For anesthetizing adult flies. | ||
| Equipment | |||
| Two sharp forceps (Dumont #55) | Fine Science Tools | 11255-20 | |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | Prepare Sylgard dissection dish by filling a plastic Petri dish with Sylgard mixture. | |
| Three-well glass dissection dishes | Fisher Scientific | 21-379 | |
| Two minutien dissecting pins (0.1 mm diameter) and two pinholders (12 cm) | Fine Science tools | 26002-10 | Insert one minutien pin in each of the two pinholders and bend one of the pins to form a hook. |
| Microscope cover slips (22x22-1 and 24x40-1) | Fisher Scientific | 12-542A | |
| Microscope slides (25x75x1.0 mm; precleaned) | Fisher Scientific | 12-550-143 | |
| 1.5 ml microcentrifuge tubes | |||
| Clear nail polish or Scotch tape | |||
| Orbital shaker | Bellco | ||
| Slide holder box | Fisher Scientific | ||
| Parafilm | Bemis | PM996 | |
| Thin paintbrush | |||
| P20 and P200 micropipettes and tips | |||
| Dissecting microscope | |||
| Small bucket with ice | For cooling the glass well plates, dissected retinas and solutions. |
References
- Ready, D. F., Hanson, T. E., Benzer, S. Development of the Drosophila retina, a neurocrystalline lattice. Dev. Biol. 53, 217-240 (1976).
- Hardie, R. C. Functional organization of the fly retina. Sensory Physiology. D, O. ttoson 5, Springer-Verlag. 1-79 (1985).
- O'Tousa, J. E. The Drosophila ninaE gene encodes an opsin. Cell. 40, 839-850 (1985).
- Zuker, C. S., Cowman, A. F., Rubin, G. M. Isolation and structure of a rhodopsin gene from D. melanogaster. Cell. 40, 851-858 (1985).
- Rister, J., Desplan, C. The retinal mosaics of opsin expression in invertebrates and vertebrates. Dev. Neurobiol. 71, 1212-1226 (2011).
- Chou, W. H. Identification of a novel Drosophila opsin reveals specific patterning of the R7 and R8 photoreceptor cells. Neuron. 17, 1101-1115 (1996).
- Chou, W. H. Patterning of the R7 and R8 photoreceptor cells of Drosophila: evidence for induced and default cell-fate specification. Development. 126, 607-616 (1999).
- Papatsenko, D., Sheng, G., Desplan, C. A new rhodopsin in R8 photoreceptors of Drosophila: evidence for coordinate expression with Rh3 in R7 cells. Development. 124, 1665-1673 (1997).
- Wolff, T., Ready, D. F. The beginning of pattern formation in the Drosophila compound eye: the morphogenetic furrow and the second mitotic wave. Development. 113, 841-850 (1991).
- Roignant, J. Y., Treisman, J. E. Pattern formation in the Drosophila eye disc. Int. J. Dev. Biol. 53, 795-804 (2009).
- Tsachaki, M., Sprecher, S. G. Genetic and developmental mechanisms underlying the formation of the Drosophila compound eye. Dev. Dyn. 241, 40-56 (2012).
- Tomlinson, A., Ready, D. F. Neuronal differentiation in Drosophila ommatidium. Dev. Biol. 120, 366-376 (1987).
- Zipursky, S. L. Molecular and genetic analysis of Drosophila eye development: sevenless, bride of sevenless and rough. Trends Neurosci. 12, 183-189 (1989).
- Basler, K., Hafen, E. Specification of cell fate in the developing eye of Drosophila. Bioessays. 13, 621-631 (1991).
- Charlton-Perkins, M., Cook, T. A. Building a fly eye: terminal differentiation events of the retina, corneal lens, and pigmented epithelia. Curr. Top Dev. Biol. 93, 129-173 (2010).
- Walther, R. F., Pichaud, F. Immunofluorescent staining and imaging of the pupal and adult Drosophila visual system. Nat. Protoc. 1, 2635-2642 (2006).
- Wolff, T. Histological Techniques for the Drosophila Eye Part I: Larva and Pupa. Drosophila Protocols. Sullivan, W. ea , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. (2000).
- Wolff, T. Dissection techniques for pupal and larval Drosophila eyes. CSH Protoc. 2007, pdb prot4715 (2007).
- Bainbridge, S. P., Bownes, M. Staging the metamorphosis of Drosophila melanogaster. J. Embryol. Exp. Morphol. 66, 57-80 (1981).
- Morante, J., Desplan, C. Dissection and staining of Drosophila optic lobes at different stages of development. Cold Spring Harb Protoc. , 652-656 (2011).
- Williamson, W. R., Hiesinger, P. R. Preparation of Developing and Adult Drosophila Brains and Retinae for Live Imaging. J. Vis. Exp. (37), e1936 (2010).
- Stowers, R. S., Schwarz, T. L. A genetic method for generating Drosophila eyes composed exclusively of mitotic clones of a single genotype. Genetics. 152, 1631-1639 (1999).
- Newsome, T. P., Asling, B., Dickson, B. J. Analysis of Drosophila photoreceptor axon guidance in eye-specific mosaics. Development. 127, 851-860 (2000).
- Sood, P., Johnston, R. J., Kussell, E. Stochastic De-repression of Rhodopsins in Single Photoreceptors of the Fly Retina. PLoS Comput. Biol. 8, e1002357 (2012).
- Johnston, R. J. Interlocked feedforward loops control cell-type-specific Rhodopsin expression in the Drosophila eye. Cell. 145, 956-968 (2011).
- Jukam, D., Desplan, C. Binary regulation of Hippo pathway by Merlin/NF2, Kibra, Lgl, and Melted specifies and maintains postmitotic neuronal fate. Dev. Cell. 21, 874-887 (2011).
- Vasiliauskas, D. Feedback from rhodopsin controls rhodopsin exclusion in Drosophila photoreceptors. Nature. 479, 108-112 (2011).
- Kumar, J. P. Building an ommatidium one cell at a time. Dev. Dyn. 241, 136-149 (2012).
