Summary
De
Abstract
De verbinding oog van Drosophila melanogaster bestaat uit ongeveer 750 ommatidia (unit ogen). Elke ommatidium bestaat uit ongeveer 20 cellen, waaronder lens-afscheidende cellen cone, pigment cellen, een cel borstelharen en acht fotoreceptoren (PRs) R1-R8 2. De PR's hebben zich gespecialiseerd microvillar structuren, de rhabdomeres, die lichtgevoelige pigmenten, de Rhodopsins (RHS) bevatten. De rhabdomeres van zes PR's (R1-R6) vormen een trapezium en bevatten RH1 3 4. De rhabdomeres van R7 en R8 zijn gepositioneerd in tandem in het midden van het trapezium en dezelfde lichtweg. R7 en R8 PR's stochastisch uiten verschillende combinaties van Rhs in twee subtypen 5: In subtype van de 'p', Th3 in p R7s gaat gepaard met RH5 in p R8s, terwijl in subtype van de 'y', RH4 in y R7s wordt geassocieerd met Th6 in R8s y 6 7 8.
Vroege specificatie van PR en ontwikkeling van ommatidia begint in het larvale oog antennelid imaginaire disc, een monolaag van epitheelcellen. Een golf van differentiatie veegt over de schijf 9 en initieert de assemblage van ongedifferentieerde cellen in ommatidia 10-11. De 'oprichter cel' R8 wordt eerst opgegeven en werft R1-6 en vervolgens R7 12-14. Vervolgens, tijdens pupal ontwikkeling, PR differentiatie leidt tot uitgebreide morfologische veranderingen 15, inclusief rhabdomere vorming, synaptogenese en uiteindelijk rh expressie.
In dit protocol wordt beschreven werkwijzen voor retinale secties en immunohistochemie op drie bepaalde perioden retina ontwikkeling die kan worden toegepast op een verscheidenheid van vragen over retinale vorming en ontwikkelingstrajecten pakken. Hier gebruiken we de volgende methoden om de stapsgewijze PR differentiatie te visualiseren op de single-cell niveau in hele berg larvale, midpupal en volwassen netvlies (
Protocol
1. Introductie
In deze video, beschrijven we methoden voor het netvlies dissecties en immunohistochemie op drie gedefinieerde ontwikkeling periodes: de derde instar larven, de midpupal en het volwassen stadium. Hoewel ons protocol werkt ook voor andere popstadium fasen (voor details over eerdere stadia, zie 16), hebben we gekozen voor de midpupal podium, want het is optimaal voor beeldvorming alle PR's in een brandvlak en hun kernen zijn gemakkelijk te identificeren, die vergemakkelijkt de visualisatie van transcriptiefactor expressiepatronen. De ontleding van late poppenwieg netvlies is zeer vergelijkbaar met de ontleding van volwassen netvlies.
Ten eerste, we laten zien hoe larven en poppen op de gewenste stappen te verzamelen. Vervolgens leggen we uit hoe u optimaal dissecties van larvale 17-18, midpupal en volwassen netvlies te krijgen. Ten tweede moeten we laten zien hoe je PR ontwikkeling te visualiseren in deze fasen met behulp van immunohistochemie en confocale microscopie.
De ontwikkelingsperiode van insecten is temperatuurafhankelijk. Om reproduceerbare enscenering van larven en poppen te vergemakkelijken, raden wij u het verhogen van alle vlieg voorraden bij 25 ° C onder een 12 uur/12 uur licht / donker-cyclus.
Derde-instar larven: Ongeveer 96 uur na leg (bij 25 ° C), late derde instar larven stop voeden en wandel op de muren van het voedsel flacon, waar ze uiteindelijk verpoppen. Gebruik een zachte borstel of een tang om voorzichtig te verwijderen een zwervende derde instar larve van de wand van het voedsel flacon.
50% poppen ('midpupae') in acht worden genomen ongeveer 48 uur na verpopping. Voor exacte timing, je kunt gewoon-gevormde witte poppen cirkel met een marker op het voedsel flacon. Als alternatief, verplaatst u alle witte poppen aan een nieuwe flacon met een flacon van uniforme enscenering (voor stadiëring van poppen met behulp van morfologische criteria, zie 19) te verkrijgen. Na 48 uur, zorgvuldig remove de midpupae uit de flacon met behulp van een pincet.
Volwassen vliegen: Anesthetize jonge volwassen vliegen (2-5 dagen na verpopping) op een CO 2 pad. Verwijder koppen met behulp van een pincet en bewaar ze in een glas goed schotel met koud 1x PBS.
3. Dissection Procedure (ongeveer 1-2 uur per Experiment)
Na het verzamelen van het monster, leg ze in een daling van koude PBS op een Sylgard dissectie schotel. Ontleden ongeveer 10-15 netvlies per genotype.
Raadpleeg het Material Safety Data Sheets en uw instelling Environmental Health and Safety Bureau voor correcte afhandeling van de reagentia en apparatuur (zie tabellen aan het einde van dit protocol).
1. Larvale Eye Imaginal Discs
- Zoek het voorste uiteinde van de larve, die de mond haken bevat. Gebruik een tang om het midden van de larve druk voorzichtig tegen de basis van de schotel Sylgard. Gebruik another een tang om de mond haken grijpen en voorzichtig en langzaam weg te trekken van het lichaam. Gooi het grootste deel van het lichaam en gebruik de monddelen het voorste deel houden om vreemde weefsel uit de denkbeeldige schijven die gehecht blijven aan de hersenen.
- Overdracht hersenen met imaginaire schijven door grijpen de mond haken met een tang om 1x PBS in een drie-well glazen schaaltje. Voer fixatie stap (stap 4.1.).
- Na fixatie, verwijder speekselklieren, vetweefsel en weg te trekken van de hersenen van de eye-antennaal imaginaire schijf. Om de toegankelijkheid van afwijkende antilichamen verbeteren kan de peripodial membraan, dat zich op het oppervlak van het epitheel verwijderd door de knop antennelid van de schijf en peeling het membraan weg met een dissectie pin. Voer daarna immunohistochemie (stap 5.1.).
2. 50% verpoppen / Midpupal netvliezen
- Houd achterste uiteinde van het popstadium geval met een forceps.Verwijder voorzichtig het voorste oppervlak van het popstadium geval door grijpen de cuticula met een andere tang en langzaam weg te trekken van de puparium. Afpellen resterende nagelriem naar het hoofd bloot te leggen.
- Gebruik de tang 'tips te doorboren de onderliggende, zachte zak in de dorsale anterieure regio. Dit biedt toegang tot het hoofd. Voorzichtig scheiden het hoofd van de thorax door langzaam zuigen het hoofd met een P20 pipet. Verdrijf het hoofd van pipetpunt in de frisse koude 1x PBS en verwijder overtollig weefsel; pak de kop nagelriem en verwijdert proboscis. Ga verder naar de fixatie stap (stap 4.1.).
- Pierce de optische lob met een ontleden pin ter stabilisatie van de weefsels. Steek de andere ontleden pin tussen de lamina en het netvlies aan het netvlies te scheiden van de lamina / optische kwab. Voer immunohistochemie (stap 5.1.).
3. Volwassen Eyes
- Pak het midden van de achterste kop capsule met een tang en verwijder monddelen (proboscis), vet tissue en trachea.
- Pak de dorsale hoofd cuticula met een pincet en gebruik de andere voor de ogen van hersenweefsel te scheiden door zachtjes te trekken zijwaarts. In de meeste gevallen zal de lamina, een dun en doorzichtig omhulsel van hersenen neuropil, aangesloten blijven op de retina. Het is gemakkelijker om de lamina verwijderen na fixatie.
- Verwijder cuticula in het oog marge, maar laat een klein stukje van de overdracht van netvlies verschillende oplossingen mogelijk. Voer fixatie (stap 4.1.).
- Verwijder de lamina door vastpakken aan een zijde met een forceps en zachtjes te trekken zijdelings met de andere forceps zonder dat de retina. Resten cuticula, ze kunnen vouwen op het netvlies tijdens montage. Deze twee stappen zijn cruciaal voor het visualiseren van fotoreceptoren, die anders zouden worden gestoord door de lamina en blijft van cuticula tijdens het beeldvormingsproces. Ga verder naar de immunohistochemie (stap 5.1.).
4. Fixatie en Washing (Ongeveer 1 uur)
- Sla de retina ontleed in 1x PBS in een drie-well glasschotel op ijs geplaatst terwijl vers voorbereidende fixeermiddel (verdund 40 microliter 37% formaldehyde-oplossing met 360 pl 1x PBS, vortex en bewaar op ijs). Wij raden u aan door te gaan met de fixatie protocol en om een lange opslag te voorkomen op ijs (> 15 min).
- Vervangen 1x PBS met 200 ul 3,7% formaldehyde oplossing. Zorg ervoor dat het weefsel wordt ondergedompeld in fixeermiddel. Dit is essentieel, omdat het anders niet goed vastgesteld. Indien nodig, verwijder luchtbellen en trachea met de tang.
- Incubeer op shaker gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur.
- Vervang fixatief met 1x PBS en spoel tweemaal met 1x PBS. Verder wassen in PBS gedurende 30 minuten (op shaker bij kamertemperatuur).
- Vervang PBS met PBST. Spoel tweemaal met PBST.
- Ga verder met het verwijderen van de peripodial membraan van larvale oog schijven (3.1.3.) En de laminas van midpupal / volwassene netvliezen <strong> (3.2.3., 3.3.4.).
5. Immunohistochemie
- Blocking: Vervang PBS met 200 ul 5% normaal serum in PBST en incubeer gedurende 20 minuten netvlies op shaker bij kamertemperatuur.
- Vervangen blokkeeroplossing met primair antilichaam oplossing. Dicht de drie putjes schaal met parafilm en incubeer overnacht op shaker bij kamertemperatuur.
- Vervangen oplossing met PBST en 3 keer spoelen. Verder wassen met PBST minimaal 1 uur op shaker bij kamertemperatuur.
- Transfer in secundair antilichaam-oplossing en incubeer in een parafilm-afgesloten glazen goed schotel op shaker overnacht bij kamertemperatuur.
- Vervangen antilichaamoplossing met PBST en driemaal spoelen. Verder wassen met PBST gedurende ten minste een uur op shaker bij kamertemperatuur. De monsters kunnen worden bewaard in PBST enkele dagen, maar het is essentieel om nieuwe PBST toe ten minste eenmaal per dag te uitdrogen.
6. MMonteren
- Voor montage larven en midpupal netvlies, gebruikt om de P20 netvlies dragen aan het centrum van een schoon glasplaatje. Verwijder overtollig PBST. Gebruik een tang om het netvlies af te stemmen om de beeldvorming te vergemakkelijken.
- Voeg 10 ul fixeermiddel bovenop het netvlies. Voorzichtig bedek ze met een 24x40-1 dekglas en afdichting met duidelijke nagellak.
- Voor de montage van volwassen netvlies, voor te bereiden 'bruggen' 20: Voeg twee 5 pl druppels van 50% glycerol aan beide uiteinden van een glas kant en bedek ze met 22x22-1 dekglaasjes (0,13 tot 0,17 mm dik).
- Verwijder de PBST met een P20 pipet, zorg ervoor dat het netvlies niet uitdrogen. Voeg 20 ul fixeermiddel naar de bron. Gebruik fixeermiddel om de netvliezen P20 dragen aan de 'brug' glasplaatje.
- Gebruik een tang om oriënteren (lenzen moet het glaasje kijkt) en lijn netvlies om beeldvorming te vergemakkelijken. Indien nodig, verwijder de luchtbellen met de P20.
- Langzaamplaats 24x40-1 dekglas (0,13 tot 0,17 mm dik) van de ene kant aan de bovenkant en seal randen met duidelijke nagellak of plakband. Store monsters bij 4 ° C in een microscoopglaasje saver box (bewaren in het donker).
7. Representatieve resultaten
Als voorbeeld van de toepassing van dit protocol tonen wij representatieve resultaten te visualiseren fotoreceptor differentiatie in de drie ontwikkelingsstadia in de video. Een larvale oog antennelid schijf en een midpupal retina werden gekleurd met antilichamen die verschillende types fotoreceptor label tijdens hun ontwikkeling (Figuur 1A, B) en een volwassen retina werd gekleurd met twee antilichamen rhodopsine twee fotoreceptor subtypes (Figuur 1C) visualiseren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
1. Problemen oplossen
In onze ervaring, dissecties oefening nodig (tot enkele weken) en worden gefaciliteerd door het bereiken van een comfortabele houding van de handen 21 door te rusten van de ellebogen en onderarmen op de tafel en met de vingers contact maken met de dissectie schotel. Op die manier, alleen de duimen, wijs-en middelvinger uit te voeren subtiele bewegingen.
Verwijderen van de lamina zonder de fotoreceptoren is waarschijnlijk de meest uitdagende stap. Oefen met rode ogen wildtype vliegt voordat het ontleden van wit-ogige mutanten, zoals de lamina is veel gemakkelijker om te zien tegen de rode ogen pigmentatie. Gebruik ook verlichting van achteren en een donkere achtergrond onder de dissectie schotel optimaal contrast te bereiken.
Echter, de rode ogen pigment is fluorescerend en kan hoge achtergrond veroorzaken tijdens het beeldvormingsproces. Dit kan verzwakken de signalen van de secundaire antilichamen. Een goede strategie is om keep wassen volwassen netvlies vier tot vijf dagen en de wasoplossing met vers PBST vervangen ten minste eenmaal per dag. Het pigment wordt uitgewassen, zorg ervoor dat de experimentele en controle genotypen wassen voor dezelfde duur.
2. Toepassingen
Eye-specifieke verlies-en gain-of-function nadert 22 23 maken Drosophila oog een bijzonder krachtig systeem voor genetische manipulaties en schermen. Bovendien recent ontwikkelde numerieke methoden voor de single-cell analyse in 3D reconstructies van de gehele netvlies kan de analyse van de mutant fenotype met hoge resolutie 24. Dit protocol kan worden toegepast op een verscheidenheid van vragen over oogontwikkeling en de onderliggende regulerende mechanismen 16,25-28.
Figuur 1. Retinale hele mounts op drie verschillende ontwikkelingsstadia. A) Larvale oog imaginaire schijf gekleurd met antilichamen tegen Seven-up (groen) en Runt (magenta). B) Midpupal retina. Twee antilichamen werden gebruikt om alle fotoreceptoren R1-R8 (Elav, blauw) en R7 fotoreceptoren (Prospero, cyaan) te visualiseren. C) Volwassen netvlies. Stochastische en elkaar uitsluitende uiting van lichtgevoelige pigmenten RH5 (cyaan) en Th6 (rood) in twee subtypes van R8 fotoreceptoren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door een Ehrman gemeenschap te HY. H., een Jane Coffin Childs Memorial Fund voor Medisch Onderzoek postdoctoraal fellowship aan RJJ, NIH Grant F32EY016309 naar DV, een New York University Dean's Proefschrift Fellowship om DJ, NIH GrantR01 EY13010 op CD en een DFG fellowship aan JR (RI 2208/1- 1). Wij danken Nina Vogt en Pamela Boodram voor commentaar op het manuscript.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent | |||
| Phosphate-buffered saline (PBS1x, pH 7.4) | Sigma | Prepare 10x stock solution 20. Dilute with distilled water to obtain 1x PBS and store at room temperature. Cool on ice before dissections. | |
| Triton-X 100 | Sigma | 9002-93-1 | Caution: Irritant! Wear gloves. Prepare 50 ml 1xPBS with 0.3% Triton X-100 (PBST). Store at room temperature. |
| 37% formaldehyde solution | Fisher Scientific | F75P1GAL | Caution: Toxic, probable human carcinogen! Wear gloves. Before the fixation step, freshly prepare 3.7% solution in a chemical fume hood by diluting with PBS, store on ice. |
| 5% normal horse serum | Jackson Immuno Research | 008-000-001 | Prepare 5% v/v dilution in PBST. Store at four degrees. |
| Primary and secondary antibodies (e.g. Donkey anti-sheep Alexa Fluor 488, Donkey-anti rabbit Alexa Fluor 555, Donkey anti-mouse Alexa Fluor 647) | Invitrogen Molecular Probes | A11015 A31572 A31571 |
Dilute secondary antibodies 1:800 in PBST and store at four degrees. |
| Alexa Fluor 488 Phalloidin | A12379 | Dilute 1:100 in secondary antibody solution. | |
| Slowfade Gold Antifade reagent | Invitrogen Molecular Probes | S36936 | Mounting medium. Store at -20 degrees. |
| Glycerol | Fisher Scientific | G31-1 | For mounting. Prepare 10 ml of 50% dilution with distilled water, store at room temp. |
| CO2 | For anesthetizing adult flies. | ||
| Equipment | |||
| Two sharp forceps (Dumont #55) | Fine Science Tools | 11255-20 | |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | Prepare Sylgard dissection dish by filling a plastic Petri dish with Sylgard mixture. | |
| Three-well glass dissection dishes | Fisher Scientific | 21-379 | |
| Two minutien dissecting pins (0.1 mm diameter) and two pinholders (12 cm) | Fine Science tools | 26002-10 | Insert one minutien pin in each of the two pinholders and bend one of the pins to form a hook. |
| Microscope cover slips (22x22-1 and 24x40-1) | Fisher Scientific | 12-542A | |
| Microscope slides (25x75x1.0 mm; precleaned) | Fisher Scientific | 12-550-143 | |
| 1.5 ml microcentrifuge tubes | |||
| Clear nail polish or Scotch tape | |||
| Orbital shaker | Bellco | ||
| Slide holder box | Fisher Scientific | ||
| Parafilm | Bemis | PM996 | |
| Thin paintbrush | |||
| P20 and P200 micropipettes and tips | |||
| Dissecting microscope | |||
| Small bucket with ice | For cooling the glass well plates, dissected retinas and solutions. |
References
- Ready, D. F., Hanson, T. E., Benzer, S. Development of the Drosophila retina, a neurocrystalline lattice. Dev. Biol. 53, 217-240 (1976).
- Hardie, R. C. Functional organization of the fly retina. Sensory Physiology. D, O. ttoson 5, Springer-Verlag. 1-79 (1985).
- O'Tousa, J. E. The Drosophila ninaE gene encodes an opsin. Cell. 40, 839-850 (1985).
- Zuker, C. S., Cowman, A. F., Rubin, G. M. Isolation and structure of a rhodopsin gene from D. melanogaster. Cell. 40, 851-858 (1985).
- Rister, J., Desplan, C. The retinal mosaics of opsin expression in invertebrates and vertebrates. Dev. Neurobiol. 71, 1212-1226 (2011).
- Chou, W. H. Identification of a novel Drosophila opsin reveals specific patterning of the R7 and R8 photoreceptor cells. Neuron. 17, 1101-1115 (1996).
- Chou, W. H. Patterning of the R7 and R8 photoreceptor cells of Drosophila: evidence for induced and default cell-fate specification. Development. 126, 607-616 (1999).
- Papatsenko, D., Sheng, G., Desplan, C. A new rhodopsin in R8 photoreceptors of Drosophila: evidence for coordinate expression with Rh3 in R7 cells. Development. 124, 1665-1673 (1997).
- Wolff, T., Ready, D. F. The beginning of pattern formation in the Drosophila compound eye: the morphogenetic furrow and the second mitotic wave. Development. 113, 841-850 (1991).
- Roignant, J. Y., Treisman, J. E. Pattern formation in the Drosophila eye disc. Int. J. Dev. Biol. 53, 795-804 (2009).
- Tsachaki, M., Sprecher, S. G. Genetic and developmental mechanisms underlying the formation of the Drosophila compound eye. Dev. Dyn. 241, 40-56 (2012).
- Tomlinson, A., Ready, D. F. Neuronal differentiation in Drosophila ommatidium. Dev. Biol. 120, 366-376 (1987).
- Zipursky, S. L. Molecular and genetic analysis of Drosophila eye development: sevenless, bride of sevenless and rough. Trends Neurosci. 12, 183-189 (1989).
- Basler, K., Hafen, E. Specification of cell fate in the developing eye of Drosophila. Bioessays. 13, 621-631 (1991).
- Charlton-Perkins, M., Cook, T. A. Building a fly eye: terminal differentiation events of the retina, corneal lens, and pigmented epithelia. Curr. Top Dev. Biol. 93, 129-173 (2010).
- Walther, R. F., Pichaud, F. Immunofluorescent staining and imaging of the pupal and adult Drosophila visual system. Nat. Protoc. 1, 2635-2642 (2006).
- Wolff, T. Histological Techniques for the Drosophila Eye Part I: Larva and Pupa. Drosophila Protocols. Sullivan, W. ea , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. (2000).
- Wolff, T. Dissection techniques for pupal and larval Drosophila eyes. CSH Protoc. 2007, pdb prot4715 (2007).
- Bainbridge, S. P., Bownes, M. Staging the metamorphosis of Drosophila melanogaster. J. Embryol. Exp. Morphol. 66, 57-80 (1981).
- Morante, J., Desplan, C. Dissection and staining of Drosophila optic lobes at different stages of development. Cold Spring Harb Protoc. , 652-656 (2011).
- Williamson, W. R., Hiesinger, P. R. Preparation of Developing and Adult Drosophila Brains and Retinae for Live Imaging. J. Vis. Exp. (37), e1936 (2010).
- Stowers, R. S., Schwarz, T. L. A genetic method for generating Drosophila eyes composed exclusively of mitotic clones of a single genotype. Genetics. 152, 1631-1639 (1999).
- Newsome, T. P., Asling, B., Dickson, B. J. Analysis of Drosophila photoreceptor axon guidance in eye-specific mosaics. Development. 127, 851-860 (2000).
- Sood, P., Johnston, R. J., Kussell, E. Stochastic De-repression of Rhodopsins in Single Photoreceptors of the Fly Retina. PLoS Comput. Biol. 8, e1002357 (2012).
- Johnston, R. J. Interlocked feedforward loops control cell-type-specific Rhodopsin expression in the Drosophila eye. Cell. 145, 956-968 (2011).
- Jukam, D., Desplan, C. Binary regulation of Hippo pathway by Merlin/NF2, Kibra, Lgl, and Melted specifies and maintains postmitotic neuronal fate. Dev. Cell. 21, 874-887 (2011).
- Vasiliauskas, D. Feedback from rhodopsin controls rhodopsin exclusion in Drosophila photoreceptors. Nature. 479, 108-112 (2011).
- Kumar, J. P. Building an ommatidium one cell at a time. Dev. Dyn. 241, 136-149 (2012).
