Summary
Den
Abstract
Den sammensatte øye Drosophila melanogaster består av ca 750 ommatidia (enhet øyne). Hver ommatidium består av ca 20 celler, inkludert objektiv-sekresjon membran celler, pigment celler, en bust celle og åtte fotoreseptorene (PRS) R1-R8 to. PRS har spesialisert microvillar strukturer, de rhabdomeres, som inneholder lysfølsomme pigmenter, de Rhodopsins (RHS). De rhabdomeres av seks PRS (R1-R6) danner et trapes og inneholder RH1 3 4. De rhabdomeres av R7 og R8 er plassert i tandem i sentrum av trapezoid og dele den samme banen av lys. R7 og R8 PRs stokastisk uttrykker ulike kombinasjoner av RHS i to undergrupper 5: I "p" undertype, er RH3 i p R7s kombinert med RH5 i p R8s, mens i "y" undertype, er RH4 i y R7s forbundet med RH6 i y R8s 6 7 8.
Tidlig spesifikasjon av PRs og utvikling av ommatidia begynner i larve øye-antennal imaginal plate, en monolayer av epitelceller. En bølge av differensiering feier over disk 9 og initierer montering av udifferensierte celler til ommatidia 10-11. The 'grunnlegger celle' R8 er spesifisert først og rekrutterer R1-6 og deretter R7 12-14. Deretter, i løpet pupal utvikling, fører PR differensiering til omfattende morfologiske endringer 15, inkludert rhabdomere formasjon, synaptogenesis og til slutt rh uttrykk.
I denne protokollen beskriver vi metoder for netthinnens disseksjoner og immunhistokjemi på tre definerte perioder med netthinnen utvikling, som kan brukes til å løse en rekke spørsmål om retinal formasjon og utviklingsmessige veier. Her bruker vi disse metodene for å visualisere en trinnvis PR differensiering på enkelt-celle-nivå i hele mount larve, midpupal og voksen netthinne (
Protocol
1. Innledning
I denne videoen beskriver vi metoder for netthinnens disseksjoner og immunhistokjemi på tre definerte utviklingsmål perioder: den tredje instar larver, den midpupal og det voksne stadiet. Selv om vår protokoll fungerer også for andre pupal stadier (for detaljer om tidligere stadier, se 16), valgte vi midpupal scenen, som det er optimalt for bildebehandling alle PRs i ett fokusplan og deres kjerner er lett identifiserbar, noe som letter visualisering av transkripsjon faktor uttrykk mønstre. Disseksjon av sen pupal netthinne er svært lik den disseksjon av voksne netthinne.
Først viser vi hvordan du samler larver og puppe på de ønskede etapper. Deretter forklarer vi hvordan du kan få optimale disseksjoner av 17-18 larve, midpupal og voksne netthinne. Sekund, viser vi deg hvordan å visualisere PR utvikling på disse stadiene ved hjelp immunhistokjemi og konfokalmikroskopi.
Utviklingsperioden av insekter er temperaturavhengig. Å legge til rette reproduserbar iscenesettelse av larver og puppe, anbefaler vi oppdra alle fly aksjer ved 25 ° C under en 12 hr/12 hr lys / mørke syklus.
Tredje instar larver: Om 96 hr etter egglegging (ved 25 ° C), sen tredje instar larver Stopp foring og vandre på veggene av maten hetteglasset, hvor de til slutt forpuppes. Bruk en myk børste eller en pinsett til å fjerne en vandrende tredje instar larve fra veggen av mat hetteglasset.
50% puppe ('midpupae') er observert ca 48 timer etter forpupping. For nøyaktig timing, kan du sirkle just-formet hvit puppe med en markør på mat hetteglasset. Alternativt flytte alle hvite puppe til et nytt hetteglass for å få en ampulle med uniform staging (for iscenesettelse av puppe med morfologiske kriterier, se 19). Etter 48 timer, nøye remove midpupae fra hetteglasset ved hjelp av en pinsett.
Voksen fluer: anesthetize unge voksne fluer (2-5 dager etter eclosion) på en CO 2 pad. Fjern hodene med en pinsett og lagre dem i et glass godt parabolen med kaldt 1x PBS.
3. Disseksjon Prosedyre (ca 1-2 timer per Experiment)
Etter å samle prøven, plassere dem i en dråpe kaldt PBS på en Sylgard disseksjon parabolen. Dissekere ca 10-15 netthinne per genotype.
Vennligst se HMS-datablad, samt institusjonens Environmental Health and Safety Office for riktig håndtering av reagenser og utstyr (se tabeller på slutten av denne protokollen).
1. Larve Eye imaginal plater
- Lokaliser fremre enden av larven, som inneholder munnen kroker. Bruk en pinsett for å trykke den midtre delen av larven forsiktig mot bunnen av Sylgard parabolen. Bruk anotheh pinsett for å ta munnen kroker og trekk forsiktig og langsomt bort fra kroppen. Forkast den viktigste delen av kroppen og bruke munndeler å holde den fremre delen for å fjerne overflødig vev fra imaginal plater som forblir festet til hjernen.
- Overføre hjernen med imaginal plater ved å ta tak munnen kroker med en pinsett til 1x PBS i en tre-brønnen glass parabolen. Utfør fiksering trinnet (trinn 4.1.).
- Etter fiksering, fjerne spyttkjertlene, fettvev og trekk hjernen bort fra øye-antennal imaginal plate. Å forbedre tilgjengeligheten av "vanskelige" antistoffer kan peripodial membran, som er lokalisert på overflaten av epitel, fjernes ved å holde nede antennal del av skiven og peeling membranen bort med en dissekerende pin. Deretter utfører immunhistokjemi (trinn 5.1.).
2. 50% forpupping / Midpupal netthinne
- Hold bakre enden av pupal tilfelle med en pinsett.Fjern forsiktig den fremre overflaten av pupal saken ved å gripe skjellaget med en annen pinsett og trekk unna puparium. Skrelle bort rester cuticle å eksponere hodet.
- Bruk pinsett 'tips for å pierce den underliggende, myk sekk i rygg anterior regionen. Dette gir tilgang til hodet. Forsiktig skille hodet fra brystkassen ved sakte suger opp hodet med en P20 pipette. Utvise hodet fra pipettespiss i frisk kald 1x PBS og fjerne overflødig vev, ta tak i hodet skjellaget og fjerne snabel. Fortsett til fiksering trinnet (trinn 4.1.).
- Pierce den optiske lapp med en dissekere pin for å stabilisere vev. Sett den andre dissekere pin mellom lamina og netthinnen å skille netthinnen fra lamina / optisk lapp. Utfør immunhistokjemi (trinn 5.1.).
3. Voksen Eyes
- Hent midten av bakre hodet kapsel med en pinsett og fjerne munnpartiet (snabel), fett Tissue og tracheae.
- Grab dorsal hodet cuticle med en pinsett og bruke den andre til å skille øynene fra hjernevev ved å dra forsiktig sidelengs. I de fleste tilfeller vil lamina, en tynn og gjennomsiktig kappe av hjernen neuropil, er festet til netthinnen. Det er lettere å fjerne lamina etter fiksering.
- Fjern cuticle på øyet margin, men la et lite stykke bak for å lette overføringen av netthinne til ulike løsninger. Utfør fiksering (trinn 4.1.).
- Fjern lamina ved å gripe den på den ene siden med en pinsett og forsiktig trekke sidelengs med de andre pinsett uten å forringe netthinnen. Fjerne rester cuticle, som det kunne kaste på netthinnen under montering. Disse to trinnene er avgjørende for å visualisere fotoreseptorene, som ellers ville være skjult av lamina og restene av cuticle under avbildingsprosessen. Fortsett til immunhistokjemi (trinn 5.1.).
4. Fiksering og Washing (omlag 1 time)
- Oppbevar dissekert netthinne i 1x PBS i en tre-vel glassform anbragt på is mens ferskt forbereder fiksativ (fortynne 40 mikroliter 37% formaldehyd-løsning med 360 pl 1x PBS, vortex og lagre på is). Vi anbefaler å fortsette med fiksering protokollen og for å unngå lange lagringstider på is (> 15 min).
- Erstatt 1x PBS med 200 ul 3,7% formaldehyd-løsning. Kontroller at vevet er nedsenket i fiksativ. Dette er kritisk, da det ellers kan ikke bli løst riktig. Om nødvendig, fjern luftbobler og tracheae med pinsett.
- Inkuber på rister i 15 minutter ved romtemperatur.
- Erstatt fiksativ med 1x PBS og skyll to ganger med 1x PBS. Fortsett å vaske i PBS i 30 minutter (på shaker, ved romtemperatur).
- Erstatt PBS med PBST. Skyll to ganger med PBST.
- Fortsett med å fjerne peripodial membran fra larve øye plater (3.1.3.) Og lameller fra midpupal / voksen netthinne <strong> (3.2.3., 3.3.4.).
5. Immunhistokjemi
- Blokkering: Erstatt PBS med 200 pl av 5% normalt serum i PBST og inkuber netthinne i 20 min på risteapparat ved romtemperatur.
- Erstatt blokkering løsning med primær antistoff løsning. Forsegl tre-vel tallerken med parafilm og inkuber over natten på risteapparat ved romtemperatur.
- Erstatt løsning med PBST og skyll 3 ganger. Fortsett å vaske med PBST i minimum 1 time på risteapparat ved romtemperatur.
- Overføring i sekundært antistoff løsning og inkuberes i en parafilm-forseglet glass godt parabolen på shaker natten ved romtemperatur.
- Erstatt antistoff løsning med PBST og skyll tre ganger. Fortsett å vaske med PBST i minimum en time på risteapparat ved romtemperatur. Prøvene kan oppbevares i PBST i flere dager, men det er viktig å legge til frisk PBST minst en gang per dag for å hindre dem fra å tørke ut.
6. Mounting
- For montering larver og midpupal netthinne, bruker P20 å overføre netthinne til sentrum av et rent glass lysbilde. Fjern overflødig PBST. Bruk en pinsett til å justere netthinne for å lette bildebehandling.
- Tilsett 10 pl monteringsmedium oppå netthinne. Dekke dem forsiktig med en 24x40-1 dekkglass og tett med klar neglelakk.
- For montering voksne netthinne, forberede "broer" 20: Legg to 5 pl dråper av 50% glycerol i begge ender av et glass side og dekk dem med 22x22-1 dekkglass (0,13 til 0,17 mm tykk).
- Fjerne PBST med en P20 pipette, sørg for at netthinne ikke tørker ut. Tilsett 20 pl av monteringsmedium til brønnen. Bruk montering medium til å overføre netthinne med P20 til "bro" glass lysbilde.
- Bruk en pinsett til å orientere (linser bør møte glass-slide) og juster netthinne for å lette bildebehandling. Om nødvendig, fjern luftbobler med P20.
- Saktested 24x40-1 dekkglass (0,13 til 0,17 mm tykk) fra den ene siden på toppen og sel kantene med klar neglelakk eller Scotch tape. Oppbevar prøvene ved 4 ° C i et mikroskop lysbilde saver boks (holde i mørket).
7. Representant Resultater
Som et eksempel for anvendelse av denne protokollen, viser vi representative resultater for å visualisere fotoreseptoren differensiering på de tre utviklingsstadier i videoen. En larve øye-antennal plate og en midpupal netthinnen var farget med antistoffer som plateselskapet forskjellige fotoreseptoren typer under deres utvikling (figur 1A, B) og en voksen netthinnen ble farget med to rhodopsin antistoffer å visualisere to fotoreseptoren undertyper (figur 1C).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
1. Feilsøking
I vår erfaring, disseksjoner krever praksis (opptil flere uker) og er tilrettelagt av å oppnå en komfortabel håndstilling 21 ved hvile albuene og underarmene på bordet, og med fingrene å ta kontakt med disseksjon parabolen. På den måten, bare tommelen, indeksen og midtre fingrene utføre subtile bevegelser.
Fjerne lamina uten å skade fotoreseptorene er trolig den mest utfordrende trinnet. Praksis med rød-eyed wildtype flyr først før dissekere hvit-eyed mutanter, som lamina er mye lettere å se mot røde øyne pigmentering. Også bruke belysning bakfra og en mørk bakgrunn under disseksjon parabolen å oppnå optimal kontrast.
Imidlertid er den røde øyne pigment fluoriserende og kan forårsake høy bakgrunn under avbildingsprosessen. Dette kan svekke signalene fra de sekundære antistoffer. En god strategi er å keep vaske den voksne netthinne for fire til fem dager og for å erstatte vaskevannet med fersk PBST minst en gang per dag. Pigment vil bli vasket ut, sørg for å vaske eksperimentelle og kontroll genotyper for samme varighet.
2. Søknader
Eye-spesifikk tap og gevinst-av-funksjon nærmer 22 23 gjør Drosophila øyet et spesielt kraftig system for genetiske manipulasjoner og skjermer. Videre nyutviklede beregningsmetoder for encellede analyser i 3D rekonstruksjoner av hele netthinne tillate analyse av muterte fenotyper med høy oppløsning 24. Denne protokollen kan derfor brukes til en rekke spørsmål om øye utvikling og de underliggende reguleringsmekanismer 16,25-28.
Figur 1. Retinal hele mounts på tre ulike utviklingsstadier. A) larve øye imaginal plate farget med antistoffer mot Seven-up (grønn) og Runt (magenta). B) Midpupal netthinnen. To antistoffer ble brukt til å visualisere alle fotoreseptorene R1-R8 (Elav, blå) og R7 fotoreseptorene (Prospero, cyan). C) Voksen netthinnen. Stokastiske og gjensidig utelukkende uttrykk for lysfølsomme pigmenter RH5 (cyan) og RH6 (rød) i to undergrupper av R8 fotoreseptorene.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklært.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av en Ehrman fellesskap å HY. H., en Jane Coffin Childs minnefond for Medical Research postdoktorstipend til RJJ, NIH Grant F32EY016309 til DV, en New York University Dean Dissertation Fellowship til DJ, GrantR01 EY13010 NIH til CD og en DFG fellesskap å JR (RI 2208/1- 1). Vi takker Nina Vogt og Pamela Boodram for kommentarer til manuskriptet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent | |||
| Phosphate-buffered saline (PBS1x, pH 7.4) | Sigma | Prepare 10x stock solution 20. Dilute with distilled water to obtain 1x PBS and store at room temperature. Cool on ice before dissections. | |
| Triton-X 100 | Sigma | 9002-93-1 | Caution: Irritant! Wear gloves. Prepare 50 ml 1xPBS with 0.3% Triton X-100 (PBST). Store at room temperature. |
| 37% formaldehyde solution | Fisher Scientific | F75P1GAL | Caution: Toxic, probable human carcinogen! Wear gloves. Before the fixation step, freshly prepare 3.7% solution in a chemical fume hood by diluting with PBS, store on ice. |
| 5% normal horse serum | Jackson Immuno Research | 008-000-001 | Prepare 5% v/v dilution in PBST. Store at four degrees. |
| Primary and secondary antibodies (e.g. Donkey anti-sheep Alexa Fluor 488, Donkey-anti rabbit Alexa Fluor 555, Donkey anti-mouse Alexa Fluor 647) | Invitrogen Molecular Probes | A11015 A31572 A31571 |
Dilute secondary antibodies 1:800 in PBST and store at four degrees. |
| Alexa Fluor 488 Phalloidin | A12379 | Dilute 1:100 in secondary antibody solution. | |
| Slowfade Gold Antifade reagent | Invitrogen Molecular Probes | S36936 | Mounting medium. Store at -20 degrees. |
| Glycerol | Fisher Scientific | G31-1 | For mounting. Prepare 10 ml of 50% dilution with distilled water, store at room temp. |
| CO2 | For anesthetizing adult flies. | ||
| Equipment | |||
| Two sharp forceps (Dumont #55) | Fine Science Tools | 11255-20 | |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | Prepare Sylgard dissection dish by filling a plastic Petri dish with Sylgard mixture. | |
| Three-well glass dissection dishes | Fisher Scientific | 21-379 | |
| Two minutien dissecting pins (0.1 mm diameter) and two pinholders (12 cm) | Fine Science tools | 26002-10 | Insert one minutien pin in each of the two pinholders and bend one of the pins to form a hook. |
| Microscope cover slips (22x22-1 and 24x40-1) | Fisher Scientific | 12-542A | |
| Microscope slides (25x75x1.0 mm; precleaned) | Fisher Scientific | 12-550-143 | |
| 1.5 ml microcentrifuge tubes | |||
| Clear nail polish or Scotch tape | |||
| Orbital shaker | Bellco | ||
| Slide holder box | Fisher Scientific | ||
| Parafilm | Bemis | PM996 | |
| Thin paintbrush | |||
| P20 and P200 micropipettes and tips | |||
| Dissecting microscope | |||
| Small bucket with ice | For cooling the glass well plates, dissected retinas and solutions. |
References
- Ready, D. F., Hanson, T. E., Benzer, S. Development of the Drosophila retina, a neurocrystalline lattice. Dev. Biol. 53, 217-240 (1976).
- Hardie, R. C. Functional organization of the fly retina. Sensory Physiology. D, O. ttoson 5, Springer-Verlag. 1-79 (1985).
- O'Tousa, J. E. The Drosophila ninaE gene encodes an opsin. Cell. 40, 839-850 (1985).
- Zuker, C. S., Cowman, A. F., Rubin, G. M. Isolation and structure of a rhodopsin gene from D. melanogaster. Cell. 40, 851-858 (1985).
- Rister, J., Desplan, C. The retinal mosaics of opsin expression in invertebrates and vertebrates. Dev. Neurobiol. 71, 1212-1226 (2011).
- Chou, W. H. Identification of a novel Drosophila opsin reveals specific patterning of the R7 and R8 photoreceptor cells. Neuron. 17, 1101-1115 (1996).
- Chou, W. H. Patterning of the R7 and R8 photoreceptor cells of Drosophila: evidence for induced and default cell-fate specification. Development. 126, 607-616 (1999).
- Papatsenko, D., Sheng, G., Desplan, C. A new rhodopsin in R8 photoreceptors of Drosophila: evidence for coordinate expression with Rh3 in R7 cells. Development. 124, 1665-1673 (1997).
- Wolff, T., Ready, D. F. The beginning of pattern formation in the Drosophila compound eye: the morphogenetic furrow and the second mitotic wave. Development. 113, 841-850 (1991).
- Roignant, J. Y., Treisman, J. E. Pattern formation in the Drosophila eye disc. Int. J. Dev. Biol. 53, 795-804 (2009).
- Tsachaki, M., Sprecher, S. G. Genetic and developmental mechanisms underlying the formation of the Drosophila compound eye. Dev. Dyn. 241, 40-56 (2012).
- Tomlinson, A., Ready, D. F. Neuronal differentiation in Drosophila ommatidium. Dev. Biol. 120, 366-376 (1987).
- Zipursky, S. L. Molecular and genetic analysis of Drosophila eye development: sevenless, bride of sevenless and rough. Trends Neurosci. 12, 183-189 (1989).
- Basler, K., Hafen, E. Specification of cell fate in the developing eye of Drosophila. Bioessays. 13, 621-631 (1991).
- Charlton-Perkins, M., Cook, T. A. Building a fly eye: terminal differentiation events of the retina, corneal lens, and pigmented epithelia. Curr. Top Dev. Biol. 93, 129-173 (2010).
- Walther, R. F., Pichaud, F. Immunofluorescent staining and imaging of the pupal and adult Drosophila visual system. Nat. Protoc. 1, 2635-2642 (2006).
- Wolff, T. Histological Techniques for the Drosophila Eye Part I: Larva and Pupa. Drosophila Protocols. Sullivan, W. ea , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. (2000).
- Wolff, T. Dissection techniques for pupal and larval Drosophila eyes. CSH Protoc. 2007, pdb prot4715 (2007).
- Bainbridge, S. P., Bownes, M. Staging the metamorphosis of Drosophila melanogaster. J. Embryol. Exp. Morphol. 66, 57-80 (1981).
- Morante, J., Desplan, C. Dissection and staining of Drosophila optic lobes at different stages of development. Cold Spring Harb Protoc. , 652-656 (2011).
- Williamson, W. R., Hiesinger, P. R. Preparation of Developing and Adult Drosophila Brains and Retinae for Live Imaging. J. Vis. Exp. (37), e1936 (2010).
- Stowers, R. S., Schwarz, T. L. A genetic method for generating Drosophila eyes composed exclusively of mitotic clones of a single genotype. Genetics. 152, 1631-1639 (1999).
- Newsome, T. P., Asling, B., Dickson, B. J. Analysis of Drosophila photoreceptor axon guidance in eye-specific mosaics. Development. 127, 851-860 (2000).
- Sood, P., Johnston, R. J., Kussell, E. Stochastic De-repression of Rhodopsins in Single Photoreceptors of the Fly Retina. PLoS Comput. Biol. 8, e1002357 (2012).
- Johnston, R. J. Interlocked feedforward loops control cell-type-specific Rhodopsin expression in the Drosophila eye. Cell. 145, 956-968 (2011).
- Jukam, D., Desplan, C. Binary regulation of Hippo pathway by Merlin/NF2, Kibra, Lgl, and Melted specifies and maintains postmitotic neuronal fate. Dev. Cell. 21, 874-887 (2011).
- Vasiliauskas, D. Feedback from rhodopsin controls rhodopsin exclusion in Drosophila photoreceptors. Nature. 479, 108-112 (2011).
- Kumar, J. P. Building an ommatidium one cell at a time. Dev. Dyn. 241, 136-149 (2012).
