Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Neuroscience

Вскрытие и иммуногистохимического личинок, куколок и взрослых Published: November 14, 2012 doi: 10.3791/4347
* These authors contributed equally

Summary

Abstract

Соединение глаз дрозофилы состоит из около 750 омматидиев (блок глаз). Каждый ommatidium состоит из около 20 клеток, в том числе объектив-секретирующих клеток конуса, пигментные клетки, клетки щетины и восемь фоторецепторов (ОР) R1-R8 2. ОР имеют специализированные структуры микровиллярные, рабдомерами, которые содержат светочувствительные пигменты, родопсины (РИТ). Рабдомерами шесть ОР (R1-R6) образуют трапецию и содержат Rh1 3 4. Рабдомерами из R7 и R8 расположены в тандеме в центре трапеции и один и тот же путь света. R7 и R8 ОР стохастически выражают различные комбинации РИТ в двух основных подтипов 5: В подтипа 'P', Rh3 в р R7s сочетается с Rh5 в р R8s, в то время как подтип 'у', у Rh4 в R7s связано с В Rh6 у R8s 6 7 8.

Ранние спецификации ОР и развития омматидиев начинается в личиночной глаз усиков имагинальных дисков, монослой эпителиальных клеток. Волна дифференциация проводится над всей поверхностью диска 9 и инициирует собрание недифференцированных клеток в омматидиев 10-11. R8 'основатель ячейки указан первым и принимает на работу R1-6, а затем R7 12-14. Впоследствии, во время развития куколки, PR дифференциация приводит к обширным морфологические изменения 15, в том числе рабдомера образования, синаптогенез и в конечном итоге относительная влажность выражение.

В этом протоколе описываются методы вскрытия сетчатки и иммуногистохимии на трех определенные периоды развития сетчатки, которые могут быть применены для решения различных вопросов, касающихся сетчатки формирования и пути развития. Здесь мы используем эти методы для визуализации ступенчатой ​​дифференциации PR в одной клеточном уровне в целом крепление личиночной, midpupal и взрослых сетчатки (

Protocol

1. Введение

В этом видео мы опишем методы вскрытия сетчатки и иммуногистохимии на трех определенных периодов развития: третьего возраста личиночной, midpupal и взрослой стадии. Хотя наш протокол работает и в других куколки (подробности на ранних стадиях, см. 16), мы выбрали midpupal этапе, так как он является оптимальным для визуализации всех ОР в одной фокальной плоскости и их ядер легко идентифицировать, что облегчает визуализацию транскрипционных факторов шаблоны выражения. Рассечения конце куколки сетчатки очень похож на вскрытии взрослого сетчатки.

Во-первых, мы показали, как собирать личинки и куколки в нужной стадии. Тогда мы объясним, как для получения оптимального вскрытия личинок 17-18, midpupal и взрослых сетчатки. Во-вторых, мы показали, как визуализировать PR развития на этих этапах использование иммуногистохимии и конфокальной микроскопии.

Период развития насекомых зависит от температуры. Для облегчения воспроизводимых постановки личинок и куколок, мы рекомендуем повышения лету все запасы при 25 ° C при 12 часа hr/12 цикле свет / темнота.

Третий возраста личинок: Около 96 часов после откладки яиц (при 25 ° C), в конце третий возраст остановки подачи и бродить по стенам питание флакона, где они в конечном итоге окукливаются. Используйте мягкую щетку или пинцетом аккуратно удалить блуждающих третьего возраста личинка от стены пищевой флаконе.

50% куколок («midpupae) наблюдается около 48 ч после окукливания. Для точного времени, вы можете просто круг сформирован белые куколки с маркером на продовольствие флаконе. Кроме того, переместить все белые куколки в новый флакон для получения флакона равномерно постановка (для постановки куколок с использованием морфологических критериев, см. 19). После 48 часов, тщательно бэрОве midpupae из флакона помощью пинцета.

Взрослые мухи: Anesthetize молодых взрослых мух (2-5 дней после вылупления) на CO 2 площадки. Удалить глав помощью щипцов и хранить их в стеклянных и блюдо с холодным 1x PBS.

3. Препарирование процедуры (около 1-2 часов в эксперименте)

После сбора образца, поместите их в капли холодного PBS на блюдо рассечение Sylgard. Проанализируйте около 10-15 сетчатки в генотипе.

Пожалуйста, ознакомьтесь с данными по безопасности материалов, а также окружающей среды и здоровья вашей организации и безопасности Управления надлежащего обращения с реактивами и оборудованием (см. таблицу в конце этого протокола).

1. Личинок глаз имагинальных дисков

  1. Найдите передний конец личинки, которая содержит рот крючки. Используйте пинцет, чтобы нажать на среднюю часть личинки мягко к основанию блюдо Sylgard. Используйте anothэ щипцы, чтобы захватить устье крючки и тянуть мягко и медленно от тела. Откажитесь от основной частью тела и использовать ротовые держать переднюю часть, чтобы удалить посторонние ткани из имагинальных дисков, которые остаются прикрепленными к мозгу.
  2. Передача мозга с имагинальных дисков, захватывая рот крючки с пинцетом 1x PBS в трех-и стеклянную посуду. Выполните фиксации шага (шаг 4.1.).
  3. После фиксации, удалить слюнные железы, жировую ткань и вытащить мозг от глаз усиков имагинальных дисков. Для повышения доступности «трудных» антител, peripodial мембрана, которая находится на поверхности эпителия, могут быть удалены, удерживая усиков части диска и шелушение мембраны покончить с рассекает PIN-код. Далее выполните иммуногистохимии (шаг 5.1.).

2. 50% Окукливание / Midpupal Сетчатки

  1. Держите заднем конце куколки случае с пинцета.Аккуратно снимите переднюю поверхность куколки случае, захватывая кутикулы с другой щипцы и медленно оторваться от пупария. Очистите от остаточной кутикулу, чтобы выставить голову.
  2. Используйте советы щипцы "пробить основной, мягкий мешок в спинной передней части. Это обеспечивает доступ к голове. Аккуратно отделить голову от грудной клетки медленно сосать до головы с помощью пипетки P20. Выгнать головы от кончика пипетки в свежей холодной 1x PBS и удалить лишнюю ткань, возьмите голову кутикулу и удалите хоботок. Приступить к фиксации шага (шаг 4.1.).
  3. Пирс оптической доле с одной рассекает булавку, чтобы стабилизировать ткани. Вставьте другой рассекает контактных между пластинкой и сетчатки отделить сетчатку от пластинки / оптический доли. Выполните иммуногистохимии (шаг 5.1.).

3. Взрослый Глаза

  1. Возьмите центре задней капсулы голову щипцами и удалить рот частей (хоботок), жиры Tissие и трахеи.
  2. Возьмите спинного кутикулы голову с одним пинцетом и использовать другие отделить глаза от ткани мозга, осторожно потянув в сторону. В большинстве случаев, пластинки, тонкую и прозрачную оболочку головного мозга нейропиля, будет оставаться прикреплены к сетчатке. Это легче удалить пластинки после фиксации.
  3. Удалите кутикулу на глаз маржи, но оставить небольшой кусочек позади, чтобы облегчить передачу сетчатку различных решений. Выполните фиксации (шаг 4.1.).
  4. Снимите пластинки, захватывая его в одну сторону с пинцетом и осторожно потянув бок с другими щипцами без ущерба для сетчатки. Удалите остатки кутикулы, как это могло сбросить на сетчатку во время монтажа. Эти два шага являются критическими для визуализации фоторецепторов, которые иначе были бы скрыты от пластинки и остатки кутикулы во время визуализации процесса. Приступить к иммуногистохимии (шаг 5.1.).

4. Фиксация и WashiNG (около 1 часа)

  1. Хранить разрезанный сетчатки в 1x PBS в трех-и стеклянную посуду помещают на лед в то время как недавно подготовки фиксатора (разбавленной 40 мкл 37% раствора формальдегида с 360 мкл 1x PBS, вихрь и магазин на льду). Мы рекомендуем приступить к фиксации протокол и, чтобы избежать длительных сроков хранения на льду (> 15 мин).
  2. Заменить 1x PBS 200 мкл 3,7% раствора формальдегида. Убедитесь, что ткань погружают в фиксатор. Это очень важно, так как в противном случае может не быть закреплены должным образом. При необходимости удалить пузырьки воздуха и трахеи с помощью пинцета.
  3. Инкубируйте на шейкере в течение 15 мин при комнатной температуре.
  4. Замените фиксатором с 1x PBS и промыть дважды 1x PBS. Продолжите мытье в PBS в течение 30 мин (на шейкере при комнатной температуре).
  5. Заменить PBS с PBST. Промыть два раза PBST.
  6. Далее с удалением peripodial мембраны от личиночной дисков глаз (3.1.3.), А также пластин из midpupal / взрослый сетчатки <STRONG> (3.2.3., 3.3.4.).

5. Иммуногистохимия

  1. Блокировка: Заменить PBS 200 мкл 5% нормальной сыворотки в PBST и инкубировать сетчатки в течение 20 минут на шейкере при комнатной температуре.
  2. Заменить блокирующий раствор с первичным решением антител. Печать на три и блюдо с парафином и инкубировать в течение ночи на шейкере при комнатной температуре.
  3. Заменить решение с PBST и промыть 3 раза. Продолжить промывание PBST в течение как минимум 1 час на шейкере при комнатной температуре.
  4. Трансфер в средней решение антитела и инкубировать в парафильмом уплотнением стекла и блюда на шейкере в течение ночи при комнатной температуре.
  5. Заменить раствор антител с PBST и промыть три раза. Продолжить промывание PBST в течение как минимум одного часа на шейкере при комнатной температуре. Пробы могут храниться в PBST в течение нескольких дней, но это критическое, чтобы добавить свежую PBST по крайней мере, один раз в день, чтобы предотвратить их от высыхания.

6. Mounting

  1. Для монтажа личинок и midpupal сетчатки, используйте P20 для передачи сетчатки в центре чистое предметное стекло. Удалите излишки PBST. Используйте щипцы для выравнивания сетчатки в целях облегчения изображения.
  2. Добавить 10 мкл монтаж среды на верхней части сетчатки. Покройте их осторожно 24x40-1 покровным стеклом и печать с прозрачного лака для ногтей.
  3. Для монтажа взрослой сетчатке, подготовить 'мосты' 20: Добавьте две капли 5 мкл 50% глицерина на обоих концах боковые стекла и покрыть их 22x22-1 покровные стекла (0,13 до 0,17 мм).
  4. Снимите PBST с помощью пипетки P20, убедитесь, что сетчатка не высыхают. Добавить 20 мкл монтажа средних и хорошо. Используйте монтажную среду для передачи сетчатки с P20 на «мост» стекло.
  5. Используйте пинцет, чтобы ориентировать (линзы должны быть обращены к стеклу) и совместите сетчатки в целях облегчения изображения. При необходимости удаления пузырьков воздуха с P20.
  6. МедленноМесто 24x40-1 покровного стекла (0,13 до 0,17 мм) с одной стороны на верхней и уплотнения края прозрачным лаком для ногтей или скотч. Магазин образцов при температуре 4 ° C в микроскоп окно слайд заставки (имейте в темноте).

7. Представитель Результаты

В качестве примера применения этого протокола, мы показываем представитель результатов для визуализации фоторецепторов дифференциации на трех стадиях развития в видео. Личиночные глаза усиков диска и midpupal сетчатки окрашивали антителами, которые обозначения различных типов фоторецепторов в процессе их развития (рис. 1а, б) и взрослых сетчатки окрашивали антителами с двумя Родопсин визуализировать два фоторецептора подтипы (рис. 1С).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

1. Поиск и устранение неисправностей

По нашему опыту, требующие вскрытия практике (до нескольких недель) и способствует достижению удобное положение рук 21, отдыхая локтями и предплечьями на стол и с помощью пальцев контакта с рассечение блюдо. Таким образом, только пальцами, указательным и средним пальцами выполнять тонкие движения.

Удаление пластинки без повреждения фоторецепторов, пожалуй, самый сложный шаг. Практика с красными глазами дикого типа мухи, прежде чем рассекает белоглазый мутантов, как пластинка гораздо легче увидеть на красной пигментации глаз. Кроме того, использование освещения сзади и темным фоном ниже рассечение блюдо для достижения оптимального контраста.

Тем не менее, красный пигмент глаз люминесцентных и может вызвать высокий фон во время визуализации процесса. Это может ослабить сигналы от вторичных антител. Хорошая стратегия заключается в кеер стиральная взрослой сетчатке в течение четырех-пяти дней и заменить моющего раствора со свежим PBST по крайней мере, один раз в день. Пигмент будет вымываться, не забудьте вымыть экспериментальной и контрольной генотипов на тот же срок.

2. Применения

Eye-удельные потери и избыточной функцией приближается к 22 23 сделать глаза дрозофилы особенно мощная система для генетических манипуляций и экранов. Кроме того, недавно разработанных вычислительных методов для одноклеточных анализ в 3D реконструкции всей сетчатки позволяет анализ мутантных фенотипов в высоком разрешении 24. Этот протокол поэтому может быть применен к различным вопросам, касающимся развития глаз и основные механизмы регулирования 16,25-28.

Рисунок 1
Рисунок 1. Сетчатки целые мounts на трех различных стадиях развития. A) личинок глаз имагинальных дисков окрашивали антителами против Seven-Up (зеленый) и Рант (пурпурный). B) Midpupal сетчатки. Два антитела были использованы для визуализации всех фоторецепторов R1-R8 (ELAV, синий) и R7 фоторецепторов (Просперо, голубой). C) Взрослый сетчатки. Стохастические и взаимоисключающих выражения светочувствительных пигментов Rh5 (голубой) и Rh6 (красный) в двух подтипов фоторецепторов R8.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Нет конфликта интересов объявлены.

Acknowledgments

Эта работа была поддержана общение Эрман к HY. Х., Джейн Гроб Дети Мемориальный фонд медицинских исследований докторской стипендии для RJJ, NIH Грант F32EY016309 Д. В., Диссертация стипендий Нью-Йоркского университета Дина DJ, NIH GrantR01 EY13010 на компакт-диски и DFG стипендии для JR (RI 2208/1- 1). Мы благодарим Нины Фогт и Памела Boodram замечания по рукописи.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagent
Phosphate-buffered saline (PBS1x, pH 7.4) Sigma Prepare 10x stock solution 20. Dilute with distilled water to obtain 1x PBS and store at room temperature. Cool on ice before dissections.
Triton-X 100 Sigma 9002-93-1 Caution: Irritant! Wear gloves. Prepare 50 ml 1xPBS with 0.3% Triton X-100 (PBST). Store at room temperature.
37% formaldehyde solution Fisher Scientific F75P1GAL Caution: Toxic, probable human carcinogen! Wear gloves. Before the fixation step, freshly prepare 3.7% solution in a chemical fume hood by diluting with PBS, store on ice.
5% normal horse serum Jackson Immuno Research 008-000-001 Prepare 5% v/v dilution in PBST. Store at four degrees.
Primary and secondary antibodies (e.g. Donkey anti-sheep Alexa Fluor 488, Donkey-anti rabbit Alexa Fluor 555, Donkey anti-mouse Alexa Fluor 647) Invitrogen Molecular Probes A11015
A31572
A31571
Dilute secondary antibodies 1:800 in PBST and store at four degrees.
Alexa Fluor 488 Phalloidin A12379 Dilute 1:100 in secondary antibody solution.
Slowfade Gold Antifade reagent Invitrogen Molecular Probes S36936 Mounting medium. Store at -20 degrees.
Glycerol Fisher Scientific G31-1 For mounting. Prepare 10 ml of 50% dilution with distilled water, store at room temp.
CO2 For anesthetizing adult flies.
Equipment
Two sharp forceps (Dumont #55) Fine Science Tools 11255-20
Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit Dow Corning Prepare Sylgard dissection dish by filling a plastic Petri dish with Sylgard mixture.
Three-well glass dissection dishes Fisher Scientific 21-379
Two minutien dissecting pins (0.1 mm diameter) and two pinholders (12 cm) Fine Science tools 26002-10 Insert one minutien pin in each of the two pinholders and bend one of the pins to form a hook.
Microscope cover slips (22x22-1 and 24x40-1) Fisher Scientific 12-542A
Microscope slides (25x75x1.0 mm; precleaned) Fisher Scientific 12-550-143
1.5 ml microcentrifuge tubes
Clear nail polish or Scotch tape
Orbital shaker Bellco
Slide holder box Fisher Scientific
Parafilm Bemis PM996
Thin paintbrush
P20 and P200 micropipettes and tips
Dissecting microscope
Small bucket with ice For cooling the glass well plates, dissected retinas and solutions.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ready, D. F., Hanson, T. E., Benzer, S. Development of the Drosophila retina, a neurocrystalline lattice. Dev. Biol. 53, 217-240 (1976).
  2. Hardie, R. C. Functional organization of the fly retina. Sensory Physiology. D, O. ttoson 5, Springer-Verlag. 1-79 (1985).
  3. O'Tousa, J. E. The Drosophila ninaE gene encodes an opsin. Cell. 40, 839-850 (1985).
  4. Zuker, C. S., Cowman, A. F., Rubin, G. M. Isolation and structure of a rhodopsin gene from D. melanogaster. Cell. 40, 851-858 (1985).
  5. Rister, J., Desplan, C. The retinal mosaics of opsin expression in invertebrates and vertebrates. Dev. Neurobiol. 71, 1212-1226 (2011).
  6. Chou, W. H. Identification of a novel Drosophila opsin reveals specific patterning of the R7 and R8 photoreceptor cells. Neuron. 17, 1101-1115 (1996).
  7. Chou, W. H. Patterning of the R7 and R8 photoreceptor cells of Drosophila: evidence for induced and default cell-fate specification. Development. 126, 607-616 (1999).
  8. Papatsenko, D., Sheng, G., Desplan, C. A new rhodopsin in R8 photoreceptors of Drosophila: evidence for coordinate expression with Rh3 in R7 cells. Development. 124, 1665-1673 (1997).
  9. Wolff, T., Ready, D. F. The beginning of pattern formation in the Drosophila compound eye: the morphogenetic furrow and the second mitotic wave. Development. 113, 841-850 (1991).
  10. Roignant, J. Y., Treisman, J. E. Pattern formation in the Drosophila eye disc. Int. J. Dev. Biol. 53, 795-804 (2009).
  11. Tsachaki, M., Sprecher, S. G. Genetic and developmental mechanisms underlying the formation of the Drosophila compound eye. Dev. Dyn. 241, 40-56 (2012).
  12. Tomlinson, A., Ready, D. F. Neuronal differentiation in Drosophila ommatidium. Dev. Biol. 120, 366-376 (1987).
  13. Zipursky, S. L. Molecular and genetic analysis of Drosophila eye development: sevenless, bride of sevenless and rough. Trends Neurosci. 12, 183-189 (1989).
  14. Basler, K., Hafen, E. Specification of cell fate in the developing eye of Drosophila. Bioessays. 13, 621-631 (1991).
  15. Charlton-Perkins, M., Cook, T. A. Building a fly eye: terminal differentiation events of the retina, corneal lens, and pigmented epithelia. Curr. Top Dev. Biol. 93, 129-173 (2010).
  16. Walther, R. F., Pichaud, F. Immunofluorescent staining and imaging of the pupal and adult Drosophila visual system. Nat. Protoc. 1, 2635-2642 (2006).
  17. Wolff, T. Histological Techniques for the Drosophila Eye Part I: Larva and Pupa. Drosophila Protocols. Sullivan, W. ea , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. (2000).
  18. Wolff, T. Dissection techniques for pupal and larval Drosophila eyes. CSH Protoc. 2007, pdb prot4715 (2007).
  19. Bainbridge, S. P., Bownes, M. Staging the metamorphosis of Drosophila melanogaster. J. Embryol. Exp. Morphol. 66, 57-80 (1981).
  20. Morante, J., Desplan, C. Dissection and staining of Drosophila optic lobes at different stages of development. Cold Spring Harb Protoc. , 652-656 (2011).
  21. Williamson, W. R., Hiesinger, P. R. Preparation of Developing and Adult Drosophila Brains and Retinae for Live Imaging. J. Vis. Exp. (37), e1936 (2010).
  22. Stowers, R. S., Schwarz, T. L. A genetic method for generating Drosophila eyes composed exclusively of mitotic clones of a single genotype. Genetics. 152, 1631-1639 (1999).
  23. Newsome, T. P., Asling, B., Dickson, B. J. Analysis of Drosophila photoreceptor axon guidance in eye-specific mosaics. Development. 127, 851-860 (2000).
  24. Sood, P., Johnston, R. J., Kussell, E. Stochastic De-repression of Rhodopsins in Single Photoreceptors of the Fly Retina. PLoS Comput. Biol. 8, e1002357 (2012).
  25. Johnston, R. J. Interlocked feedforward loops control cell-type-specific Rhodopsin expression in the Drosophila eye. Cell. 145, 956-968 (2011).
  26. Jukam, D., Desplan, C. Binary regulation of Hippo pathway by Merlin/NF2, Kibra, Lgl, and Melted specifies and maintains postmitotic neuronal fate. Dev. Cell. 21, 874-887 (2011).
  27. Vasiliauskas, D. Feedback from rhodopsin controls rhodopsin exclusion in Drosophila photoreceptors. Nature. 479, 108-112 (2011).
  28. Kumar, J. P. Building an ommatidium one cell at a time. Dev. Dyn. 241, 136-149 (2012).

Tags

Neuroscience выпуск 69 анатомии физиологии иммунологии биологии развития, Сетчатки фоторецептор имагинальных дисков личинка куколка конфокальной микроскопии иммуногистохимии
Вскрытие и иммуногистохимического личинок, куколок и взрослых<em&gt; Drosophila</em&gt; Сетчатки
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Hsiao, H. Y., Johnston Jr., R. J.,More

Hsiao, H. Y., Johnston Jr., R. J., Jukam, D., Vasiliauskas, D., Desplan, C., Rister, J. Dissection and Immunohistochemistry of Larval, Pupal and Adult Drosophila Retinas. J. Vis. Exp. (69), e4347, doi:10.3791/4347 (2012).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter