Summary
Den
Abstract
Föreningen öga Drosophila melanogaster består av cirka 750 ommatidia (enhet ögon). Varje ommatidium består av omkring 20 celler, inklusive lins-utsöndrande kon celler, pigment, ett borst cell och åtta fotoreceptorer (PRS) R1-R8 2. PRS har specialiserat microvillar strukturerna, rhabdomeres, som innehåller ljuskänsliga pigment, de Rhodopsins (hö axel). De rhabdomeres av sex PRS (R1-R6) bildar en trapets och innehåller RH1 3 4. De rhabdomeres av R7 och R8 är placerade i tandem i mitten av trapetsoiden och dela samma väg för ljus. R7 och R8 PRS uttrycker stokastiskt olika kombinationer av RHS i två subtyper 5: I "P" subtyp är Rh3 i p R7s tillsammans med RH5 i p R8s, medan i "y" subtyp är RH4 i y R7s samband med RH6 i y R8s 6 7 8.
Tidig specifikation av PRS och utveckling ommatidia börjar i larver ögat antenn imaginal skiva ett monolager av epitelceller. En våg av differentiering sveper över skivan 9 och initierar montering av odifferentierade celler i ommatidia 10-11. Den grundare cell "R8 anges först och rekryterar R1-6 och sedan R7 12-14. Därefter, under pupal utveckling leder PR differentiering till omfattande morfologiska förändringar 15, inklusive rhabdomere bildning, synaptogenes och så småningom rh uttryck.
I detta protokoll beskriver vi metoder för näthinnan dissektioner och immunohistokemi på tre perioder för näthinnan utveckling som kan tillämpas för att lösa ett antal frågor om retinal bildning och utvecklingsbanor. Här använder vi dessa metoder för att visualisera den stegvisa PR-differentiering vid encelliga nivå i hela mount larver, midpupal och vuxna näthinnor (
Protocol
1. Inledning
I den här videon beskriver vi metoder för näthinnan dissektioner och immunohistokemi vid tre definierade utvecklings perioder: den tredje instar larver, den midpupal och vuxna stadiet. Även om vår protokoll fungerar även för andra pupal stadier (för information om tidigare skeden, se 16), valde vi midpupal scenen, eftersom det är optimalt för avbildning alla PRS i ett fokalplan och deras kärnor är lätta att identifiera, vilket underlättar visualisering av transkriptionsfaktor expression patterns. Dissektion av sena pupal näthinnor är mycket lik den dissektion av vuxna näthinnor.
Först visar vi hur man samlar larver och puppor i de önskade stegen. Sedan förklarar vi hur man får optimala dissektioner av larver 17-18, midpupal och vuxna näthinnor. Andra visar vi hur man visualisera PR utveckling på dessa stadier med immunohistokemi och konfokalmikroskopi.
Den utvecklande tid av insekter är temperaturberoende. För att underlätta reproducerbar iscensättning av larver och puppor, rekommenderar vi att höja alla flyga lager vid 25 ° C under en 12 tim/12 tim ljus / mörker-cykel.
Tredje stadiets larver: Om 96 timmar efter äggläggning (vid 25 ° C), slutet av tredje stadiets larver stopp utfodring och vandra på väggarna maten flaskan, där de så småningom förpuppas. Använd en mjuk borste eller en pincett för att försiktigt ta bort en vandrande tredje stadiet larv från väggen av maten flaskan.
50% puppor (midpupae) observeras omkring 48 timmar efter förpuppning. För exakta tidpunkten, kan du ringa just bildade vita puppor med en markör på maten flaskan. Alternativt flytta alla vita puppor till en ny flaska för att få en flaska med enhetlig iscensättning (för stadieindelning av puppor med morfologiska kriterier, se 19). Efter 48 timmar, försiktigt remove den midpupae från injektionsflaskan med hjälp av en pincett.
Adult flugor: Bedöva unga vuxna flugor (2-5 dagar efter eclosion) på ett CO 2 dyna. Ta bort huvudet med en pincett och lagra dem i en glasskål väl med kall 1x PBS.
3. Dissektion Procedur (ca. 1-2 timmar per experiment)
Efter uppsamling av provet, placera dem i en droppe kall PBS på en Sylgard dissektion maträtt. Dissekera ca 10-15 näthinnor per genotyp.
Konsultera Säkerhetsdatablad samt din institutions miljö, hälsa och säkerhet Kontor för korrekt hantering av reagens och utrustning (se tabellerna i slutet av detta protokoll).
1. Larver Eye imaginal skivor
- Lokalisera främre änden av larven, som innehåller munnen krokar. Använd en tång för att trycka den mellersta delen av larven försiktigt mot basen av Sylgard skålen. Använd anothER pincett för att ta munnen krokarna och dra sakta och försiktigt bort från kroppen. Kasta den huvudsakliga delen av kroppen och använda mouthparts att hålla den främre delen för att avlägsna ovidkommande vävnad från imaginal skivor som sitter kvar i hjärnan.
- Överför hjärnan med imaginal skivor genom att ta tag munnen krokar med en pincett till 1x PBS i en tre-och glasskål. Utför fixering (steg 4,1.).
- Efter fixering, ta bort spottkörtlar, fettvävnad och dra hjärnan bort från ögat-antenn imaginal skiva. För att förbättra tillgängligheten till "svåra" antikroppar kan peripodial membranet, som ligger på ytan av epitelet, tas bort genom att hålla ner antenn delen av skivan och skalar membranet undan med en dissekera stift. Därefter utför immunohistokemi (steg 5,1.).
2. 50% pupation / Midpupal näthinnor
- Håll bakre änden av pupal fallet med en tång.Ta försiktigt bort den främre ytan av pupal fall genom att ta tag i nagelbanden med en annan peang och dra långsamt bort från puparium. Skala bort kvarvarande nagelband att exponera huvudet.
- Använd pincett "tips för att tränga igenom den underliggande, mjuk säck i dorsala främre regionen. Detta ger tillgång till huvudet. Försiktigt separera huvudet från bröstkorgen genom att långsamt suga upp huvudet med en P20 pipett. Spruta ut huvudet från pipettspetsen i färskt kallt 1x PBS och ta bort överflödig vävnad, greppa huvudet nagelband och ta bort snabel. Gå vidare till fixering (steg 4,1.).
- Pierce synnerven loben med en dissekera stift till stadig vävnaden. Sätt i den andra dissekera stiftet mellan lamina och näthinnan att separera näthinnan från lamina / optiska lob. Utför immunohistokemi (steg 5,1.).
3. Adult ögon
- Tag i mitten av den bakre kapseln huvudet med en pincett och avlägsna mundelar (snabel), fett TissUE och tracheae.
- Ta tag i dorsala huvudet nagelbanden med en tång och använda den andra för att separera ögonen från hjärnvävnad genom att försiktigt dra i sidled. I de flesta fall kommer laminatet, en tunn och transparent hölje av hjärnans neuropil, vara kopplad till näthinnan. Det är lättare att avlägsna skivan efter fixering.
- Ta nagelband vid ögat marginalen, men lämna en liten bit kvar för att underlätta överföring av näthinnor till olika lösningar. Utför fixering (steg 4,1.).
- Ta bort skivan genom att ta tag det på en sida med en pincett och dra försiktigt i sidled med de andra pincett utan att skada näthinnan. Avlägsna kvarvarande nagelband, eftersom det kan vika på näthinnan under montering. Dessa två steg är avgörande för att visualisera fotoreceptorer, som annars skulle skymmas av lamina och förblir av nagelband under avbildningsprocessen. Gå vidare till immunohistokemi (steg 5,1.).
4. Fixering och Washing (ca 1 h)
- Förvara de dissekerade näthinnor i 1 x PBS i en tre-väl glasskål placerades på is medan nyligen förbereder fixativ (späd 40 mikroliter 37% formaldehydlösning med 360 pl 1 x PBS, virvel och lagra på is). Vi rekommenderar att gå vidare med fixering protokollet och för att undvika långa lagringstider på is (> 15 min).
- Ersätt 1x PBS med 200 pl 3,7% formaldehydlösning. Se till vävnaden är nedsänkt i fixativ. Detta är kritiskt, eftersom det annars inte kan fastställas korrekt. Om det behövs, ta bort luftbubblor och tracheae med pincett.
- Inkubera på skakare under 15 min vid rumstemperatur.
- Byt fixativ med 1x PBS och skölj två gånger med 1 x PBS. Fortsätt tvättning i PBS under 30 minuter (på skakanordning, vid rumstemperatur).
- Ersätt PBS med PBST. Skölj två gånger med PBST.
- Fortsätt med att ta bort peripodial membranet från larver öga skivor (3.1.3.) Och lamellerna från midpupal / vuxen näthinnor <strong> (3.2.3., 3.3.4.).
5. Immunohistokemi
- Blockering: Ersätt PBS med 200 pl 5% normalt serum i PBST och inkubera näthinnor under 20 min på skakanordning vid rumstemperatur.
- Ersätt blockerande lösning med primär antikropp lösning. Täta tre väl skålen med parafilm och inkubera över natten på skakanordning vid rumstemperatur.
- Byt lösning med PBST och skölj 3 gånger. Fortsätt tvättning med PBST för minst 1 timme på skakanordning vid rumstemperatur.
- Transfer i sekundär antikroppslösning och inkubera i en parafilm-försluten glas väl skålen på skakanordning över natten vid rumstemperatur.
- Byt antikropplösning med PBST och skölj tre gånger. Fortsätt tvättning med PBST för minst en timme på skakanordning vid rumstemperatur. Proverna kan förvaras i PBST under flera dagar, men det är viktigt att tillsätta färsk PBST minst en gång per dag för att förhindra dem från uttorkning.
6. Mounting
- För montering larver och midpupal näthinnor, använd P20 för att överföra näthinnor till centrum av en ren glasskiva. Ta bort överflödigt PBST. Använd en tång för att anpassa näthinnor för att underlätta avbildning.
- Tillsätt 10 | il monteringsmedium ovanpå näthinnor. Täck dem försiktigt med en 24x40-1 täckglas och tätning med genomskinligt nagellack.
- För montering av vuxna näthinnor, förbereda "broar" 20: Lägg två 5 ^ droppar av 50% glycerol i båda ändarna av ett glas sida och täcka dem med 22x22-1 täckglas (0,13 till 0,17 mm tjock).
- Ta bort PBST med P20 pipett, se till att näthinnor inte torkar ut. Tillsätt 20 | il monteringsmedium till brunnen. Använd monteringsmedium att överföra näthinnor med P20 till "bron" glasskiva.
- Använd en pincett för att orientera (linser ska möta glasskivan) och justera näthinnor för att underlätta bildbehandling. Om det behövs, ta bort luftbubblor med P20.
- Långsamtplats 24x40-1 täckglas (0,13 till 0,17 mm tjock) från en sida på toppen och kanterna tätning med genomskinligt nagellack eller tejp. Förvara proverna vid 4 ° C i ett objektglas sparare box (håll i mörker).
7. Representativa resultat
Som ett exempel för tillämpningen av detta protokoll visar vi representativa resultat för att visualisera fotoreceptor differentiering på tre utvecklingsstadier i videon. En larver ögat antenn skiva och en midpupal näthinna färgades med antikroppar etiketten olika fotoreceptor typer under utveckling (Figur 1A, B) och en vuxen näthinna var färgas med två rhodopsin antikroppar att visualisera två fotoreceptor subtyper (figur 1C).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
1. Felsökning
Enligt vår erfarenhet dissektioner kräver praktik (upp till flera veckor) och underlättas genom att uppnå en bekväm handställning 21 genom att vila armbågarna och underarmar på bordet och med fingrarna i kontakt med dissektion maträtt. På så sätt bara tummen, pekfingret och långfingret utför subtila rörelser.
Ta bort skivan utan att skada fotoreceptorerna är förmodligen den mest utmanande steget. Öva med rödögd vildtyp flyger först innan dissekera vit-eyed mutanter, eftersom skivan är mycket lättare att se mot det röda ögat pigmentering. Använd även belysning bakifrån och en mörk bakgrund under dissekering skålen för att uppnå optimal kontrast.
Men den röda ögon pigmentet fluorescerande och kan orsaka hög bakgrund under avbildningsprocessen. Detta kan försvaga signalerna från de sekundära antikropparna. En bra strategi är att keEP tvätta vuxna näthinnor för 4-5 dagar och att ersätta tvättlösningen med färsk PBST minst en gång per dag. Pigmentet kommer att tvättas ut, var noga med att tvätta försöksgrupp och kontrollgrupp genotyper för samma tid.
2. Applikationer
Eye-specifik förlust och vinst-of-funktion närmar 22 23 gör Drosophila ögat ett särskilt kraftfullt system för genetiska manipulationer och skärmar. Dessutom nyligen utvecklade beräkningsmetoder för encelliga analys i 3D rekonstruktioner av hela näthinnor tillåter analys av muterade fenotyper med hög upplösning 24. Detta protokoll kan därför tillämpas på en mängd frågor om ögats utveckling och de underliggande reglerande mekanismerna 16,25-28.
Figur 1. Retinal hela m.ounts vid tre olika utvecklingsstadier. A) larver öga imaginal skiva färgas med antikroppar mot Seven-up (grön) och Runt (magenta). B) Midpupal näthinnan. Två antikroppar användes för att visualisera alla fotoreceptorer R1-R8 (Elav, blå) och R7 fotoreceptorer (Prospero, cyan). C) Vuxen näthinnan. Stokastiska och ömsesidigt uteslutande expression av ljuskänsliga pigment RH5 (cyan) och RH6 (röd) i två subtyper av R8 fotoreceptorer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av en Ehrman gemenskap till HY. H., en Jane Coffin Childs Minnesfond för medicinsk forskning postdoktorsstipendium till RJJ, NIH Grant F32EY016309 till DV, en New York University Dean avhandling Fellowship till DJ, NIH GrantR01 EY13010 till CD och en DFG gemenskap till JR (RI 2208/1- 1). Vi tackar Nina Vogt och Pamela Boodram för kommentarer på manuskriptet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent | |||
| Phosphate-buffered saline (PBS1x, pH 7.4) | Sigma | Prepare 10x stock solution 20. Dilute with distilled water to obtain 1x PBS and store at room temperature. Cool on ice before dissections. | |
| Triton-X 100 | Sigma | 9002-93-1 | Caution: Irritant! Wear gloves. Prepare 50 ml 1xPBS with 0.3% Triton X-100 (PBST). Store at room temperature. |
| 37% formaldehyde solution | Fisher Scientific | F75P1GAL | Caution: Toxic, probable human carcinogen! Wear gloves. Before the fixation step, freshly prepare 3.7% solution in a chemical fume hood by diluting with PBS, store on ice. |
| 5% normal horse serum | Jackson Immuno Research | 008-000-001 | Prepare 5% v/v dilution in PBST. Store at four degrees. |
| Primary and secondary antibodies (e.g. Donkey anti-sheep Alexa Fluor 488, Donkey-anti rabbit Alexa Fluor 555, Donkey anti-mouse Alexa Fluor 647) | Invitrogen Molecular Probes | A11015 A31572 A31571 |
Dilute secondary antibodies 1:800 in PBST and store at four degrees. |
| Alexa Fluor 488 Phalloidin | A12379 | Dilute 1:100 in secondary antibody solution. | |
| Slowfade Gold Antifade reagent | Invitrogen Molecular Probes | S36936 | Mounting medium. Store at -20 degrees. |
| Glycerol | Fisher Scientific | G31-1 | For mounting. Prepare 10 ml of 50% dilution with distilled water, store at room temp. |
| CO2 | For anesthetizing adult flies. | ||
| Equipment | |||
| Two sharp forceps (Dumont #55) | Fine Science Tools | 11255-20 | |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | Prepare Sylgard dissection dish by filling a plastic Petri dish with Sylgard mixture. | |
| Three-well glass dissection dishes | Fisher Scientific | 21-379 | |
| Two minutien dissecting pins (0.1 mm diameter) and two pinholders (12 cm) | Fine Science tools | 26002-10 | Insert one minutien pin in each of the two pinholders and bend one of the pins to form a hook. |
| Microscope cover slips (22x22-1 and 24x40-1) | Fisher Scientific | 12-542A | |
| Microscope slides (25x75x1.0 mm; precleaned) | Fisher Scientific | 12-550-143 | |
| 1.5 ml microcentrifuge tubes | |||
| Clear nail polish or Scotch tape | |||
| Orbital shaker | Bellco | ||
| Slide holder box | Fisher Scientific | ||
| Parafilm | Bemis | PM996 | |
| Thin paintbrush | |||
| P20 and P200 micropipettes and tips | |||
| Dissecting microscope | |||
| Small bucket with ice | For cooling the glass well plates, dissected retinas and solutions. |
References
- Ready, D. F., Hanson, T. E., Benzer, S. Development of the Drosophila retina, a neurocrystalline lattice. Dev. Biol. 53, 217-240 (1976).
- Hardie, R. C. Functional organization of the fly retina. Sensory Physiology. D, O. ttoson 5, Springer-Verlag. 1-79 (1985).
- O'Tousa, J. E. The Drosophila ninaE gene encodes an opsin. Cell. 40, 839-850 (1985).
- Zuker, C. S., Cowman, A. F., Rubin, G. M. Isolation and structure of a rhodopsin gene from D. melanogaster. Cell. 40, 851-858 (1985).
- Rister, J., Desplan, C. The retinal mosaics of opsin expression in invertebrates and vertebrates. Dev. Neurobiol. 71, 1212-1226 (2011).
- Chou, W. H. Identification of a novel Drosophila opsin reveals specific patterning of the R7 and R8 photoreceptor cells. Neuron. 17, 1101-1115 (1996).
- Chou, W. H. Patterning of the R7 and R8 photoreceptor cells of Drosophila: evidence for induced and default cell-fate specification. Development. 126, 607-616 (1999).
- Papatsenko, D., Sheng, G., Desplan, C. A new rhodopsin in R8 photoreceptors of Drosophila: evidence for coordinate expression with Rh3 in R7 cells. Development. 124, 1665-1673 (1997).
- Wolff, T., Ready, D. F. The beginning of pattern formation in the Drosophila compound eye: the morphogenetic furrow and the second mitotic wave. Development. 113, 841-850 (1991).
- Roignant, J. Y., Treisman, J. E. Pattern formation in the Drosophila eye disc. Int. J. Dev. Biol. 53, 795-804 (2009).
- Tsachaki, M., Sprecher, S. G. Genetic and developmental mechanisms underlying the formation of the Drosophila compound eye. Dev. Dyn. 241, 40-56 (2012).
- Tomlinson, A., Ready, D. F. Neuronal differentiation in Drosophila ommatidium. Dev. Biol. 120, 366-376 (1987).
- Zipursky, S. L. Molecular and genetic analysis of Drosophila eye development: sevenless, bride of sevenless and rough. Trends Neurosci. 12, 183-189 (1989).
- Basler, K., Hafen, E. Specification of cell fate in the developing eye of Drosophila. Bioessays. 13, 621-631 (1991).
- Charlton-Perkins, M., Cook, T. A. Building a fly eye: terminal differentiation events of the retina, corneal lens, and pigmented epithelia. Curr. Top Dev. Biol. 93, 129-173 (2010).
- Walther, R. F., Pichaud, F. Immunofluorescent staining and imaging of the pupal and adult Drosophila visual system. Nat. Protoc. 1, 2635-2642 (2006).
- Wolff, T. Histological Techniques for the Drosophila Eye Part I: Larva and Pupa. Drosophila Protocols. Sullivan, W. ea , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. (2000).
- Wolff, T. Dissection techniques for pupal and larval Drosophila eyes. CSH Protoc. 2007, pdb prot4715 (2007).
- Bainbridge, S. P., Bownes, M. Staging the metamorphosis of Drosophila melanogaster. J. Embryol. Exp. Morphol. 66, 57-80 (1981).
- Morante, J., Desplan, C. Dissection and staining of Drosophila optic lobes at different stages of development. Cold Spring Harb Protoc. , 652-656 (2011).
- Williamson, W. R., Hiesinger, P. R. Preparation of Developing and Adult Drosophila Brains and Retinae for Live Imaging. J. Vis. Exp. (37), e1936 (2010).
- Stowers, R. S., Schwarz, T. L. A genetic method for generating Drosophila eyes composed exclusively of mitotic clones of a single genotype. Genetics. 152, 1631-1639 (1999).
- Newsome, T. P., Asling, B., Dickson, B. J. Analysis of Drosophila photoreceptor axon guidance in eye-specific mosaics. Development. 127, 851-860 (2000).
- Sood, P., Johnston, R. J., Kussell, E. Stochastic De-repression of Rhodopsins in Single Photoreceptors of the Fly Retina. PLoS Comput. Biol. 8, e1002357 (2012).
- Johnston, R. J. Interlocked feedforward loops control cell-type-specific Rhodopsin expression in the Drosophila eye. Cell. 145, 956-968 (2011).
- Jukam, D., Desplan, C. Binary regulation of Hippo pathway by Merlin/NF2, Kibra, Lgl, and Melted specifies and maintains postmitotic neuronal fate. Dev. Cell. 21, 874-887 (2011).
- Vasiliauskas, D. Feedback from rhodopsin controls rhodopsin exclusion in Drosophila photoreceptors. Nature. 479, 108-112 (2011).
- Kumar, J. P. Building an ommatidium one cell at a time. Dev. Dyn. 241, 136-149 (2012).
