Summary
La
Abstract
El ojo compuesto de Drosophila melanogaster se compone de alrededor de 750 omatidios (ojos unitarios). Cada ommatidium se compone de alrededor de 20 células, incluyendo las células secretoras de cono-lente, células de pigmento, una célula de cerdas y ocho fotorreceptores (RP) R1-R8 2. Los BPs tienen estructuras especializadas microvillar, los rhabdomeres, que contienen pigmentos sensibles a la luz, la rodopsina (RHS). Los rhabdomeres de seis rupias (R1-R6) forman un trapecio y contienen Rh1 3 4. Los rhabdomeres de R7 y R8 están situados en tándem en el centro del trapezoide y comparte el mismo camino de la luz. R7 y R8 RP estocásticamente expresan diferentes combinaciones de RHS en dos subtipos principales 5: En el subtipo 'p', p RH3 en R7s se acopla con Th5 en p R8s, mientras que en el subtipo 'y', Th4 en R7s y se asocia con RH6 en y r8s 6 7 8.
Especificación temprana de RP y desarrollo de omatidios comienza en el ojo larval-antenal disco imaginal, una monocapa de células epiteliales. Una ola de diferenciación barre a través del disco 9 e inicia el ensamblaje de células indiferenciadas en ommatidia 10-11. El R8 'célula fundador se especifica primero y recluta R1-6 y R7 12-14. Posteriormente, durante el desarrollo pupal, PR diferenciación conduce a amplios cambios morfológicos 15, incluyendo la formación de rhabdomere, sinaptogénesis y la expresión final rh.
En este protocolo, se describen métodos para disecciones de retina y de inmunohistoquímica en tres períodos definidos de desarrollo de la retina, que se pueden aplicar para abordar una variedad de cuestiones relativas a la formación de la retina y las vías de desarrollo. Aquí, nosotros usamos estos métodos para visualizar la gradual diferenciación PR a nivel de una sola célula en su totalidad larval monte, midpupal retinas y adultos (
Protocol
1. Introducción
En este vídeo, se describen métodos para disecciones de retina y de inmunohistoquímica en tres períodos definidos de desarrollo: larvas del tercer instar, midpupal y la etapa adulta. Aunque nuestro protocolo también funciona para otros pupa (para más detalles sobre las etapas anteriores, véase 16), se optó por el escenario midpupal, ya que es óptima para todos los RP imágenes en un plano focal y sus núcleos son fácilmente identificables, lo que facilita la visualización de transcripción patrones de expresión del factor. La disección de los finales de retinas pupal es muy similar a la disección de retinas adultos.
En primer lugar, se demuestra cómo recoger larvas y pupas en las etapas deseadas. A continuación, le explicamos cómo obtener disecciones óptimos de las larvas 17-18, midpupal retinas y adultos. En segundo lugar, demostramos cómo visualizar PR desarrollo en estas etapas utilizando microscopía inmunohistoquímica y confocal.
El período de desarrollo de los insectos es dependiente de la temperatura. Para facilitar la puesta en escena reproducible de larvas y pupas, se recomienda levantar todas las poblaciones de la mosca a 25 ° C bajo un 12 h/12 h luz / oscuridad ciclo.
Larvas de tercer estadio: Sobre 96 horas después de la puesta de huevos (a 25 ° C), a finales de la alimentación de larvas de tercer estadio de parada y pasear en las paredes del vial de alimentos, donde eventualmente se convierten en crisálidas. Use un cepillo suave o un fórceps para extraer con cuidado un errante larva de tercer estadio de la pared del vial de alimentos.
50% de las pupas ('midpupae') se observó aproximadamente 48 horas después de la pupación. Por el momento exacto, puedes encerrar pupas recién formadas blanco con un marcador en el frasco de comida. Alternativamente, se mueven todos pupas blanco a un nuevo vial para obtener un vial de estadificación uniforme (para la estadificación de pupas utilizando criterios morfológicos, ver 19). Después de 48 horas, con atención realove la midpupae del vial utilizando un fórceps.
Las moscas adultas: anestesiar a las moscas adultas jóvenes (2-5 días después de la eclosión) en una plataforma de CO 2. Retire cabezales con un fórceps y almacenarlos en un vaso bien frío plato que contiene 1x PBS.
3. Procedimiento de Disección (aproximadamente 1-2 horas por prueba)
Después de recoger la muestra, los coloca en una gota de PBS frío en un plato de disección Sylgard. Disecciona unos 10-15 retinas por genotipo.
Por favor, consulte las hojas de seguridad, así como la salud ambiental de su institución y de la Oficina de Seguridad para la correcta manipulación de los reactivos y equipos (ver cuadros al final de este protocolo).
1. Los discos imaginales de larvas del ojo
- Localizar el extremo anterior de la larva, que contiene los ganchos de la boca. Utilice una pinza para presionar la parte media de la larva suavemente contra la base del plato Sylgard. Utilice Another fórceps para agarrar los ganchos de la boca y tirar suavemente y lentamente del cuerpo. Desechar la parte principal del cuerpo y el uso de las partes de la boca para mantener la parte anterior con el fin de eliminar el tejido extraño procedente de los discos imaginales que permanecen unidos al cerebro.
- Traslado cerebro con los discos imaginales por el acaparamiento de los ganchos de la boca con una pinza en 1X PBS en una placa de vidrio de tres pozos. Realice el paso fijación (paso 4.1.).
- Después de la fijación, eliminar las glándulas salivales, el tejido adiposo y tire del cerebro lejos del disco imaginal ojo-antenal. Para mejorar la accesibilidad de "difíciles" anticuerpos, la membrana peripodial, que se encuentra en la superficie del epitelio, se puede eliminar manteniendo presionada la parte antenal del disco y el pelado de la membrana de distancia con un pasador de disección. A continuación, lleve a cabo la inmunohistoquímica (paso 5.1.).
2. 50% pupación / Midpupal Retinas
- Mantenga el extremo posterior de la envoltura pupal con un fórceps.Retire con cuidado la superficie anterior de la envoltura pupal por el acaparamiento de la cutícula con otras pinzas y tire lentamente lejos de la pupa. Despegue la cutícula residual para exponer la cabeza.
- Utilice las pinzas de puntas "para perforar el saco subyacente, blando en la región dorsal anterior. Esto proporciona el acceso a la cabeza. Suavemente separar la cabeza del tórax por lentamente absorbiendo la cabeza con una pipeta P20. Expulsar a la cabeza de la punta de la pipeta en PBS frío fresco 1x y eliminar el exceso de tejido y consigue la cutícula y quite trompa. Continúe con el paso de fijación (paso 4.1.).
- Pierce el lóbulo óptico con un pin de disección para estabilizar el tejido. Insertar el pasador de otro disección entre la lámina y la retina se separe la retina de la lámina / lóbulo óptico. Lleve a cabo la inmunohistoquímica (paso 5.1.).
3. Ojos adultos
- Coge el centro de la cápsula posterior de la cabeza con unas pinzas y quitar partes de la boca (probóscide), TISS grasaue y tráqueas.
- Agarra la cabeza cutícula dorsal con un fórceps y utilizar la otra para separar los ojos de tejido cerebral tirando suavemente hacia los lados. En la mayoría de los casos, la lámina, una funda delgada y transparente de neurópilo cerebro, permanecerá unido a la retina. Es más fácil retirar la lámina después de la fijación.
- Eliminar cutícula en el margen ojo, pero dejando un pequeño trozo detrás para facilitar la transferencia de retinas a diferentes soluciones. Realizar fijación (paso 4.1.).
- Retirar la lámina por agarrarlo en un lado con un fórceps y tirando suavemente hacia los lados con los fórceps otros sin perjudicar la retina. Eliminar cutícula residual, ya que podría doblar sobre la retina durante el montaje. Estos dos pasos son fundamentales para la visualización de los fotorreceptores, que de otro modo quedar ocultas por la lámina y restos de cutícula durante el proceso de formación de imágenes. Proceda a la inmunohistoquímica (paso 5.1.).
4. La fijación y Washing (aprox. 1 hora)
- La tienda de las retinas disecadas en 1x PBS en un recipiente de vidrio de tres pozos se colocaron en hielo mientras recién preparar el fijador (diluir 40 microlitros de solución de formaldehído al 37% con 360 l de PBS 1x, mezclar y almacenar en hielo). Se recomienda proceder con el protocolo de fijación y para evitar largos tiempos de almacenamiento en hielo (> 15 min).
- Reemplazar 1x PBS con 200 l de solución de formaldehído al 3,7%. Asegúrese de que el tejido se sumerge en fijador. Esto es crítico, ya que de otra manera no se fija correctamente. Si es necesario, eliminar las burbujas de aire y las tráqueas con los fórceps.
- Incubar en un agitador durante 15 minutos a temperatura ambiente.
- Reemplazar fijador con 1x PBS y enjuague dos veces con 1x PBS. Continuar el lavado en PBS durante 30 min (en un agitador, a temperatura ambiente).
- Reemplace PBS con PBST. Aclarar dos veces con PBST.
- Proceder a la eliminación de la membrana de los discos peripodial ojos larvales (3.1.3.) Y las laminas de midpupal / adulto retinas <strong> (3.2.3., 3.3.4.).
5. La inmunohistoquímica
- Bloqueo: Reemplazar PBS con 200 l de 5% de suero normal en PBST y las retinas de incubar durante 20 min en un agitador a temperatura ambiente.
- Sustituir solución de bloqueo con solución de anticuerpo primario. Sellar el plato de tres pozos con parafilm y se incuba durante la noche en un agitador a temperatura ambiente.
- Reemplazar la solución con PBST y enjuague 3 veces. Continuar el lavado con PBST durante un mínimo de 1 hora en un agitador a temperatura ambiente.
- Transferencia en solución de anticuerpo secundario e incubar en un plato de cristal Parafilm-sellado bien en un agitador durante la noche a temperatura ambiente.
- Sustituir solución de anticuerpo con PBST y enjuagar tres veces. Continuar el lavado con PBST durante un mínimo de una hora en un agitador a temperatura ambiente. Las muestras se pueden mantener en PBST durante varios días, pero es crítico para añadir PBST fresco al menos una vez al día para evitar que se seque.
6. Montaje
- Para el montaje de retinas de larvas y midpupal, utilizar el P20 para transferir retinas al centro de un portaobjetos de vidrio limpio. Retire el exceso de PBST. Use una pinza para alinear retinas con el fin de facilitar formación de imágenes.
- Añadir 10 l de medio de montaje en la parte superior de las retinas. Cubra ligeramente con una hoja de 24X40-1 tapa y selle con esmalte transparente.
- Para el montaje retinas adultas, preparar 'puentes' 20: Agregue dos gotas de 5 l de glicerol al 50% en ambos extremos de un lado del cristal y cubrir con cubreobjetos de 22x22-1 (0,13 a 0,17 mm de espesor).
- Retire la PBST con una pipeta P20, asegúrese de que la retina no se sequen. Añadir 20 l de medio de montaje para el pozo. El uso medio de montaje para transferir retinas con la P20 a la diapositiva "puente" de vidrio.
- Use una pinza para orientar (lentes deben mirar hacia la lámina de vidrio) y alinear retinas con el fin de facilitar la formación de imágenes. Si es necesario, elimine las burbujas de aire con el P20.
- Despaciolugar 24X40-1 hoja de cubierta (0,13 a 0,17 mm de espesor) de un lado en la parte superior y los bordes de sellado con esmalte transparente o cinta adhesiva. Almacene las muestras a 4 ° C en una diapositiva de microscopio caja de ahorro (mantener en la oscuridad).
7. Los resultados representativos
Como ejemplo de la aplicación de este protocolo, se muestran resultados representativos para la visualización de la diferenciación de los fotorreceptores en las tres etapas de desarrollo en el vídeo. Un ojo larval-antenal disco y una retina midpupal se tiñeron con anticuerpos que etiquetan los diferentes tipos de fotorreceptores durante su desarrollo (Figura 1A, B) y una retina adulta se tiñeron con dos anticuerpos rodopsina de visualizar dos subtipos fotorreceptoras (Figura 1C).
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Discussion
1. Solución de problemas
En nuestra experiencia, las disecciones requieren práctica (hasta varias semanas) y son facilitados por lograr una posición cómoda de la mano 21 descansando los codos y los antebrazos sobre la mesa y con los dedos en contacto con la placa de disección. De esta forma los dedos, los pulgares sólo el, índice y medio realizar movimientos sutiles.
Extracción de la lámina sin dañar los fotorreceptores es probablemente el paso más difícil. La práctica con los ojos rojos de tipo salvaje vuela primero antes de la disección de ojos blancos mutantes, como la lámina es mucho más fácil de ver contra la pigmentación del ojo rojo. Además, el uso de iluminación por detrás y un fondo oscuro por debajo de la placa de disección para conseguir un contraste óptimo.
Sin embargo, el pigmento rojo del ojo es fluorescente y puede causar ruido de fondo alto durante el proceso de formación de imágenes. Esto puede debilitar las señales de los anticuerpos secundarios. Una buena estrategia es keep lavado de las retinas adultas de cuatro a cinco días, y para reemplazar la solución de lavado con PBST fresco al menos una vez por día. El pigmento se lava, asegúrese de lavarse los genotipos experimentales y de control de la misma duración.
2. Aplicaciones
Eye-específico de pérdida y ganancia de función se aproxima a 22 23 que el ojo de Drosophila un sistema particularmente potente para las manipulaciones genéticas y pantallas. Por otra parte, recientemente desarrollado métodos computacionales para el análisis de una sola célula en las reconstrucciones en 3D de toda la retina permiten el análisis de fenotipos mutantes en alta resolución 24. Este protocolo por lo tanto se puede aplicar a una variedad de preguntas sobre el desarrollo del ojo y los mecanismos subyacentes reguladoras 16,25-28.
Figura 1. M conjunto de retinaim portes en tres diferentes etapas de desarrollo. Un disco) ojo larval imaginal teñidas con anticuerpos contra Seven-up (verde) y Runt (magenta). B) Midpupal retina. Dos anticuerpos fueron utilizados para visualizar todos los fotorreceptores R1-R8 (Elav, azul) y R7 fotorreceptores (Próspero, cyan). C) Adulto retina. Expresión estocástica y mutuamente excluyentes de pigmentos fotosensibles RH5 (cian) y RH6 (rojo) en dos subtipos de fotorreceptores R8.
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Disclosures
No hay conflictos de interés declarado.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por una beca de Ehrman a HY. H., Jane Coffin Childs Memorial Fund para la beca de investigación postdoctoral médica a JJR, NIH subvención F32EY016309 a DV, una Beca Universidad de Nueva York Dean Disertación para DJ, NIH EY13010 GrantR01 para CD y una beca de la DFG a JR (RI 2208/1- 1). Damos las gracias a Nina Vogt y Boodram Pamela para comentarios sobre el manuscrito.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent | |||
| Phosphate-buffered saline (PBS1x, pH 7.4) | Sigma | Prepare 10x stock solution 20. Dilute with distilled water to obtain 1x PBS and store at room temperature. Cool on ice before dissections. | |
| Triton-X 100 | Sigma | 9002-93-1 | Caution: Irritant! Wear gloves. Prepare 50 ml 1xPBS with 0.3% Triton X-100 (PBST). Store at room temperature. |
| 37% formaldehyde solution | Fisher Scientific | F75P1GAL | Caution: Toxic, probable human carcinogen! Wear gloves. Before the fixation step, freshly prepare 3.7% solution in a chemical fume hood by diluting with PBS, store on ice. |
| 5% normal horse serum | Jackson Immuno Research | 008-000-001 | Prepare 5% v/v dilution in PBST. Store at four degrees. |
| Primary and secondary antibodies (e.g. Donkey anti-sheep Alexa Fluor 488, Donkey-anti rabbit Alexa Fluor 555, Donkey anti-mouse Alexa Fluor 647) | Invitrogen Molecular Probes | A11015 A31572 A31571 |
Dilute secondary antibodies 1:800 in PBST and store at four degrees. |
| Alexa Fluor 488 Phalloidin | A12379 | Dilute 1:100 in secondary antibody solution. | |
| Slowfade Gold Antifade reagent | Invitrogen Molecular Probes | S36936 | Mounting medium. Store at -20 degrees. |
| Glycerol | Fisher Scientific | G31-1 | For mounting. Prepare 10 ml of 50% dilution with distilled water, store at room temp. |
| CO2 | For anesthetizing adult flies. | ||
| Equipment | |||
| Two sharp forceps (Dumont #55) | Fine Science Tools | 11255-20 | |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | Prepare Sylgard dissection dish by filling a plastic Petri dish with Sylgard mixture. | |
| Three-well glass dissection dishes | Fisher Scientific | 21-379 | |
| Two minutien dissecting pins (0.1 mm diameter) and two pinholders (12 cm) | Fine Science tools | 26002-10 | Insert one minutien pin in each of the two pinholders and bend one of the pins to form a hook. |
| Microscope cover slips (22x22-1 and 24x40-1) | Fisher Scientific | 12-542A | |
| Microscope slides (25x75x1.0 mm; precleaned) | Fisher Scientific | 12-550-143 | |
| 1.5 ml microcentrifuge tubes | |||
| Clear nail polish or Scotch tape | |||
| Orbital shaker | Bellco | ||
| Slide holder box | Fisher Scientific | ||
| Parafilm | Bemis | PM996 | |
| Thin paintbrush | |||
| P20 and P200 micropipettes and tips | |||
| Dissecting microscope | |||
| Small bucket with ice | For cooling the glass well plates, dissected retinas and solutions. |
References
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