Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Chemistry

ओलिगोपेप्टाइड की गैस चरण acidities का निर्धारण

Published: June 24, 2013 doi: 10.3791/4348

Summary

सिस्टीन युक्त ओलिगोपेप्टाइड की गैस चरण acidities के निर्धारण में वर्णित है. प्रयोगों एक ट्रिपल quadrupole मास स्पेक्ट्रोमीटर का उपयोग करते हुए प्रदर्शन कर रहे हैं. पेप्टाइड्स के सापेक्ष acidities टक्कर प्रेरित पृथक्करण प्रयोगों का उपयोग करके मापा जाता है, और मात्रात्मक acidities विस्तारित सारे महाराज गतिज विधि का उपयोग निर्धारित कर रहे हैं.

Introduction

अमीनो एसिड के अवशेष का acidities संरचनाओं को प्रभावित करने वाले सबसे महत्वपूर्ण thermochemical गुण, जेट, और प्रोटीन 9,19 की तह खुलासा प्रक्रियाओं में से एक हैं. व्यक्तिगत अमीनो एसिड के अवशेष अक्सर प्रोटीन में उनके स्थान के आधार पर विभिन्न प्रभावी acidities दिखा. विशेष रूप से, सक्रिय स्थलों पर स्थित अवशेषों अक्सर प्रदर्शन काफी acidities परेशान. ऐसा ही एक उदाहरण एंजाइमों 20,21 के thioredoxin सुपर परिवार के सक्रिय साइटों में रहने सिस्टीन अवशेषों है. सक्रिय साइट सिस्टीन प्रोटीन 3-5 सामने आया में उन लोगों की तुलना में असामान्य रूप से अम्लीय है. यह पेचदार रचना असामान्य अम्लता के लिए एक महत्वपूर्ण योगदान हो सकता है कि सुझाव दिया गया है. विशेष रूप से जलीय समाधान 2,6-8 में, समाधान में किए गए पेप्टाइड्स की एसिड आधार गुण पर व्यापक प्रयोगात्मक अध्ययन कर रहे हैं. परिणाम अक्सर विलायक प्रभाव से जटिल थे7. वास्तव में, प्रोटीन में सक्रिय साइटों की सबसे विलायक प्रभाव 9,10 कम कर रहे हैं, जहां आंतरिक क्षेत्र के पास स्थित हैं.

पेप्टाइड्स और प्रोटीन की आंतरिक एसिड आधार गुणों को समझने के क्रम में, यह एक विलायक मुक्त वातावरण में अध्ययन के लिए बाहर ले जाने के लिए महत्वपूर्ण है. यहाँ हम गैस चरण अम्लता के निर्धारण के लिए एक मास स्पेक्ट्रोमेट्री आधारित विधि परिचय. दृष्टिकोण विस्तारित सारे महाराज गतिज पद्धति के रूप में जाना जाता है. इस पद्धति का सफलतापूर्वक, ऐसी गैस चरण अम्लता, प्रोटॉन आत्मीयता, धातु आयन आत्मीयता, इलेक्ट्रॉन आत्मीयता, और आयनीकरण ऊर्जा 11-15 के रूप में विभिन्न thermochemical गुण, के निर्धारण के लिए रासायनिक प्रणालियों की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए लागू कर दिया गया है 22-26. हम oligo सिस्टीन-polyalanine और सिस्टीन-polyglycine पेप्टाइड्स 17,18,27 की एक श्रृंखला की गैस चरण acidities निर्धारित करने के लिए इस पद्धति को लागू किया है. इन अध्ययनों एन टर्मिनल सिस्टीन peptid बताते हैं कितों इसी सी टर्मिनल लोगों की तुलना में काफी अधिक अम्लीय हैं. पूर्व की उच्च acidities संभावना thiolate आयनों जोरदार हेलिक्स स्थूल द्विध्रुवीय के साथ बातचीत के द्वारा स्थिर है जिसमें पेचदार गठनात्मक प्रभाव के कारण हैं. क्योंकि पेप्टाइड्स के अनह्रासी और thermally अस्थायी प्रकृति के, गतिज विधि पेप्टाइड्स 28 की हद तक सही एसिड आधार thermochemical मात्रा में उत्पादन करने के लिए वर्तमान में उपलब्ध सबसे व्यावहारिक दृष्टिकोण है.

सामान्य योजना और गतिज विधि के साथ जुड़े समीकरण चित्र 1 में दिखाया जाता है. एक पेप्टाइड की गैस चरण अम्लता के निर्धारण (मुख्यालय) प्रोटॉन वाली क्लस्टर anions की एक श्रृंखला के गठन के साथ शुरू होता है, [एक • एच • एक मैं] ¯ (या [एक ¯ • एच + • एक मैं ¯] ¯), मास स्पेक्ट्रोमीटर के आयन स्रोत क्षेत्र में जहां एक ¯ और एक मैं ¯ पेप्टाइड का deprotonated रूप हैं औरक्रमशः संदर्भ एसिड,. संदर्भ एसिड जाना जाता गैस चरण acidities साथ कार्बनिक यौगिकों हैं. संदर्भ एसिड (लेकिन पेप्टाइड की है कि जरूरी समान नहीं) एक दूसरे के समान संरचना होनी चाहिए. संदर्भ एसिड के बीच संरचनाओं की समानता उनके बीच deprotonation की entropies की समानता सुनिश्चित करता है. प्रोटॉन वाली क्लस्टर anions इसी मोनोमेरिक anions उपज को टक्कर प्रेरित पृथक्करण (सीआईडी) प्रयोगों का उपयोग करते हुए बड़े पैमाने पर चयनित और collisionally सक्रिय और बाद में अलग कर रहे हैं, एक ¯ और एक मैं ¯, कश्मीर और कश्मीर की दर स्थिरांक मैं, क्रमशः, चित्रा 1a में दिखाया गया है. माध्यमिक fragmentations नगण्य हैं, सीआईडी ​​टुकड़ा आयनों की बहुतायत अनुपात, [एक ¯] / [एक मैं ¯], दर स्थिरांक, कश्मीर / कश्मीर मैं का अनुपात लगभग एक उपाय का प्रतिनिधित्व करता है. कोई रिवर्स activat कर रहे हैं कि इस धारणा के तहतदोनों हदबंदी चैनलों, अनुपात शाखाओं में सीआईडी ​​उत्पाद आयन के लिए आयन बाधाओं, एल.एन. [एक ¯] / [एक मैं ¯], रैखिक गैस चरण पेप्टाइड की अम्लता (Δ एसिड एच) और उन लोगों के लिए सहसंबद्ध किया जाएगा संदर्भ एसिड (Δ एसिड एच i), के रूप में चित्रा 1b में दिखाया गया है. इस समीकरण में, Δ एसिड एच औसत संदर्भ एसिड का औसत गैस चरण अम्लता है, Δ (Δ एस) एन्ट्रापी अवधि (संदर्भ एसिड संरचना की दृष्टि से एक दूसरे के समान हैं अगर लगातार ग्रहण किया जा सकता है) है, आर है सार्वभौमिक गैस स्थिर, और टी eff प्रणाली के प्रभावी तापमान है. प्रभावी तापमान टक्कर ऊर्जा सहित कई प्रयोगात्मक चर पर निर्भर करता है कि एक अनुभवजन्य पैरामीटर है.

गैस चरण अम्लता के मूल्य थर्मामीटरों गतिज भूखंडों के दो सेट के निर्माण से निर्धारित होता है. पहला सेट ओब हैएल.एन. की साजिश रचने के द्वारा tained ([एक ¯] / [एक मैं ¯]) Δ एसिड एच मैं के खिलाफ - Δ एसिड एच औसत, के रूप में चित्रा -4 ए में दिखाया गया है. रेखीय प्रतिगमन वाई की एक्स = 1 / आर टी eff और अवरोध की ढलानों साथ सीधे लाइनों का एक सेट निकलेगा = - [Δ एसिड एच - Δ एसिड एच औसत] / आरटी eff - Δ (Δ एस) / आर. भूखंडों के दूसरे सेट के रूप में चित्रा 4b में दिखाया इसी ढलानों के खिलाफ पहला सेट (एक्स), से उत्पन्न अवरोध (वाई) की साजिश रचने के द्वारा प्राप्त की है. Δ एसिड एच औसत और Δ (Δ एस) / आर का एक अवरोधन - रेखीय प्रतिगमन Δ एसिड एच की एक ढाल के साथ एक नई लाइन का उत्पादन. Δ एसिड एच के मूल्य तो ढलान से प्राप्त होता है और एन्ट्रापी अवधि, Δ (Δ एस) से प्राप्त की हैअवरोधन.

प्रयोगों एक electrospray ionization (ईएसआई) आयन स्रोत को interfaced एक ट्रिपल quadrupole मास स्पेक्ट्रोमीटर का उपयोग करते हुए प्रदर्शन कर रहे हैं. मास स्पेक्ट्रोमीटर का एक योजनाबद्ध आरेख चित्रा 2 में दिखाया गया है. सीआईडी ​​प्रयोगों बड़े पैमाने पर पहली quadrupole यूनिट के साथ प्रोटॉन वाली क्लस्टर anions के चयन और उन्हें चारों ओर 0.5 mTorr के दबाव में आयोजित किया जाता है, जो टक्कर चेंबर में लीक आर्गन परमाणुओं के साथ टकराव से गुजरना करने की अनुमति देकर प्रदर्शन कर रहे हैं. हदबंदी उत्पाद आयनों जन तीसरे quadrupole यूनिट के साथ विश्लेषण कर रहे हैं. सीआईडी ​​स्पेक्ट्रा सभी संभव माध्यमिक टुकड़े को कवर करने के लिए पर्याप्त विस्तृत मी / z सीमा के साथ कई टक्कर ऊर्जा पर दर्ज हैं. सीआईडी ​​उत्पाद आयन तीव्रता स्कैन चयनित उत्पाद आयनों पर केंद्रित है जिसमें चयनित प्रतिक्रिया निगरानी (एसआरएम) मोड में साधन की स्थापना द्वारा मापा जाता है. सीआईडी ​​के प्रयोगों के लिए इसी, चार अलग टक्कर ऊर्जा पर प्रदर्शन कर रहे हैंक्रमश: 1.0, 1.5, 2.0, और 2.5 eV, के केंद्र के बड़े पैमाने पर ऊर्जा (ई सेमी). केंद्र के बड़े पैमाने पर ऊर्जा समीकरण का उपयोग कर की गणना है: सेमी = प्रयोगशाला [एम / (एम + एम)], प्रयोगशाला प्रयोगशाला फ्रेम में टक्कर ऊर्जा है, जहां मीटर आर्गन की बड़े पैमाने पर है, और एम है प्रोटॉन वाली क्लस्टर आयन के जन.

इस अनुच्छेद में, हम मॉडल यौगिक के रूप में oligopeptide आला 3 CysNH 2 (ए 3 सीएच) का उपयोग करें. सी टर्मिनस amidated है और सिस्टीन अवशेषों की thiol समूह (एसएच) अम्लीय साइट हो जाएगा. उपयुक्त संदर्भ एसिड का चयन गैस चरण अम्लता के सफल माप के लिए महत्वपूर्ण है. आदर्श संदर्भ एसिड संरचनात्मक रूप से समान हैं (एक दूसरे से) अच्छी तरह से स्थापित गैस चरण अम्लता मूल्यों के साथ कार्बनिक यौगिकों. संदर्भ एसिड पेप्टाइड्स के करीब अम्लता मूल्यों होनी चाहिए. पेप्टाइड एक 3 सीएच के लिए, छह carboxyli halogenatedग एसिड संदर्भ एसिड के रूप में चुना जाता है. छह संदर्भ एसिड chloroacetic एसिड (MCAH), bromoacetic एसिड (MBAH), difluoroacetic एसिड (DFAH), dichloroacetic एसिड (DCAH), dibromoacetic एसिड (DBAH), और trifluoroacetic (TFAH) हैं. उनमें से दो, DFAH और MBAH, प्रोटोकॉल को वर्णन करने के लिए इस्तेमाल किया जाएगा.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. नमूना समाधान की तैयारी

  1. पहले पेप्टाइड का जायजा समाधान और एक 1:1 अनुपात मात्रा में मेथनॉल और पानी की एक मिश्रित विलायक का उपयोग करते हुए छह संदर्भ एसिड तैयार करते हैं. शेयर समाधान के बारे में 10 -3 एम. के एक एकाग्रता होनी चाहिए
  2. एक 1.5 मिलीलीटर Eppendorf ट्यूब में ठोस पेप्टाइड नमूने के 1 मिलीग्राम, एक 3 सीएच, वजन और मेथनॉल और पानी की मिश्रित विलायक के 1.0 मिलीलीटर जोड़ने, और एक भंवर का उपयोग कर मिश्रण.
  3. Difluoroacetic एसिड (DFAH) के 1 मिलीग्राम वजन और मेथनॉल और पानी की मिश्रित विलायक के 1.0 मिलीलीटर जोड़ने, और एक भंवर का उपयोग कर मिश्रण.
  4. अन्य पांच संदर्भ एसिड chloroacetic एसिड (MCAH), bromoacetic एसिड (MBAH), dichloroacetic एसिड (DCAH), dibromoacetic एसिड (DBAH), और trifluoroacetic एसिड (TFAH) के लिए शेयर समाधान बनाने के लिए एक ही प्रक्रिया का उपयोग करें.
  5. एक 1.5 मिलीलीटर Eppendorf ट्यूब में पेप्टाइड शेयर समाधान के बारे में 50 μl ड्रा, और एक में DFAH के शेयर समाधान के बारे में 50 μl आकर्षितमुझे Eppendorf ट्यूब. के बारे में 10 -4 एम. के अंतिम एकाग्रता प्राप्त करने के लिए मेथनॉल और पानी की मिश्रित विलायक के 900 μl के साथ मिश्रित समाधान पतला यह पतला समाधान मास स्पेक्ट्रोमेट्री मापन के लिए नमूना समाधान के रूप में इस्तेमाल किया जाएगा. संदर्भ एसिड के साथ ही नमूना समाधान के अंतिम एकाग्रता के लिए पेप्टाइड का वास्तविक अनुपात मास स्पेक्ट्रोमीटर में मनाया आयन संकेत abundances के आधार पर समायोजित किया जाएगा.
  6. अन्य पांच संदर्भ एसिड के साथ पेप्टाइड का नमूना समाधान तैयार करने के लिए एक ही प्रक्रिया का उपयोग करें.

2. मास स्पेक्ट्रोमेट्री माप 1: प्रोटॉन वाली क्लस्टर आयन गठन

  1. मास स्पेक्ट्रोमेट्री माप के पहले चरण के लिए एक संदर्भ एसिड के साथ पेप्टाइड का स्थिर प्रोटॉन वाली क्लस्टर आयनों उत्पन्न करने के लिए है.
  2. -4.5 केवी पर ईएसआई सुई वोल्टेज के साथ नकारात्मक आयन एमएस मोड, -35 के बारे में वी पर केशिका वोल्टेज, और सुखाने गैस तापमान में साधन सेट150 पर बनाए रखा डिग्री सेल्सियस Q1 के शिखर चौड़ाई और Q3 शिखर चौड़ाई सेट दोनों calibrated पैमाने (शिखर चौड़ाई चोटियों के संकल्प को समायोजित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि एक उपकरण पैरामीटर है. "Calibrated पैमाने" सेटिंग बेहतर शिखर जुदाई के लिए संकीर्ण चोटियों को प्रदर्शित करने की अनुमति देता है ). केशिका वोल्टेज और सुखाने गैस तापमान मनाया आयन abundances बढ़ाने के लिए समायोजित किया जा सकता है.
  3. एक 1 मिलीलीटर हैमिल्टन सिरिंज में पेप्टाइड DFAH का नमूना समाधान के बारे में 0.5 मिलीलीटर दिखे और तिरछी नज़र टयूबिंग का उपयोग ईएसआई सुई प्रवेश के लिए सिरिंज कनेक्ट. फिर सिरिंज पंप पर सिरिंज जगह. 10 μl / मिनट पर प्रवाह की दर के साथ ईएसआई सुई में नमूना समाधान तर करने के लिए सिरिंज पंप पर मुड़ें.
  4. ईएसआई प्रक्रिया को सक्रिय करने के लिए ईएसआई सुई वोल्टेज चालू करें. डिटेक्टर चालू करें. एक मास के स्पेक्ट्रम प्रदर्शन प्रोफाइल मोड में मनाया जाना चाहिए. प्रदर्शन केन्द्रक मोड में है, तो प्रोफ़ाइल मोड में स्विच. Monitori से प्रोटॉन वाली क्लस्टर आयन गठन देखोएनजी मी / z 428 में चोटी. क्लस्टर आयन का संकेत बहुतायत ठीक ट्यूनिंग के साधन के द्वारा समायोजित किया जा सकता है. एक महत्वपूर्ण पैरामीटर केशिका वोल्टेज है. एक मैन्युअल मी / z 428 में चोटी की बहुतायत को अधिकतम करने के लिए (आमतौर -20 से -50 वी की रेंज में) केशिका वोल्टेज बदल सकते हैं.

3. मास स्पेक्ट्रोमेट्री मापन 2: सीआईडी ​​bracketing प्रयोगों

  1. अगले कदम सीआईडी ​​bracketing के प्रयोग करने के लिए है.
  2. क्लस्टर आयन की बहुतायत वांछित मूल्य (100 एम वी के आसपास) तक पहुँच जाता है, एमएस / एमएस मोड के लिए साधन स्विच. इस मोड में, जन विश्लेषक के रूप में क्लस्टर आयन, टक्कर सेल के रूप में Q2 में काम करता है, और Q3 कार्यों को अलग करने के लिए फिल्टर एक सामूहिक रूप Q1 में कार्य करता है.
  3. टक्कर गैस (आर्गन, इस मामले में) 0.5 mTorr पर दबाव और 17 eV में टक्कर ऊर्जा सेट करें. तीन चोटियों जन स्पेक्ट्रम प्रदर्शन खिड़की में मनाया जाना चाहिए. मी / z 428 में चोटी क्लस्टर आयन, [से मेल खाती हैDFA • एच • एक 3 सीएस] ¯. मी / z 332 और मीटर z / 95 पर दो चोटियों क्रमश: deprotonated पेप्टाइड (ए 3 सीएस ¯) और deprotonated difluoroacetic एसिड (DFA ¯) के अनुरूप हैं. मी / z 298 पर नाबालिग शिखर deprotonated पेप्टाइड से एक माध्यमिक टुकड़ा है. 2 मिनट, चित्रा 3a के लिए एक सीआईडी ​​स्पेक्ट्रम मोल.
  4. इसी तरह सीआईडी ​​प्रयोगों प्रदर्शन और bromoacetic एसिड (MBAH), चित्रा 3b साथ पेप्टाइड का नमूना समाधान के लिए एक सीआईडी ​​स्पेक्ट्रम हासिल.
  5. इसी तरह सीआईडी ​​प्रयोगों प्रदर्शन और अन्य सभी संदर्भ एसिड के साथ पेप्टाइड का नमूना समाधान के लिए सीआईडी ​​स्पेक्ट्रा हासिल. परिणामस्वरूप सीआईडी ​​स्पेक्ट्रा आंकड़े 3a और 3b को गुणात्मक समान हो जाएगा, लेकिन मी / z मूल्यों और रिश्तेदार चोटी ऊंचाइयों अलग हो जाएगा.

4. मास स्पेक्ट्रोमेट्री माप 3: काइनेटिक विधि

  1. अंतिम चरण के एसआरएम स्पेक्ट्रा प्राप्त करने के लिए है.
  2. केन्द्रक को स्पेक्ट्रम प्रदर्शन स्विच और चयनित प्रतिक्रिया निगरानी (एसआरएम) मोड के लिए साधन सेट. पहले quadrupole (क्यू 1) द्वारा पृथक आयन के रूप मी / z 428 रखें, और तीसरे quadrupole (Q3) द्वारा निरीक्षण किया जा रहा चार जनता (जन करने के लिए प्रभारी अनुपात) में भरें. चार जनता मी / z 428 (क्लस्टर आयन), मी / z 332 (पेप्टाइड आयन), मी / z 298 (पेप्टाइड आयन का टुकड़ा), और मीटर z / 95 (DFA ¯ आयन) हैं. 0.5 mTorr में टक्कर गैस के दबाव रखें.
  3. 11.7 eV के लिए टक्कर ऊर्जा सेट और 5 मिनट के लिए स्पेक्ट्रा हासिल.
  4. 17.6 eV के लिए टक्कर ऊर्जा बदलें और 5 मिनट के लिए स्पेक्ट्रा हासिल.
  5. 23.4 eV, और 29.3 eV के लिए टक्कर ऊर्जा परिवर्तन, और 5 मिनट के लिए टक्कर ऊर्जा दोनों पर स्पेक्ट्रा के अधिग्रहण.
  6. अन्य सभी संदर्भ एसिड के साथ पेप्टाइड के लिए इसी तरह के मापन का प्रदर्शन.

5. डेटा विश्लेषण

  1. अल से आयन तीव्रता के मूल्यों की नकलएक एक्सेल वर्कशीट पर एल एस आर एम स्पेक्ट्रा.
  2. सीआईडी ​​उत्पाद आयन शाखाओं अनुपात की गणना करें, एल.एन. ([एक ¯] / [एक मैं ¯]), सभी चार टक्कर ऊर्जा पर सभी छह प्रोटॉन वाली समूहों के लिए मापा. नमूना मान तालिका 1 में दिखाया गया है.
  3. एल.एन. के मूल्यों की साजिश ([एक ¯] / [एक मैं ¯]) Δ एसिड एच मैं के मूल्यों के खिलाफ - Δ एसिड एच औसत. यह चार टक्कर ऊर्जा, चित्रा -4 ए में डेटा को इसी चार भूखंडों दे देंगे.
  4. चार भूखंडों के रेखीय प्रतिगमन द्वारा ढलानों और अवरोध के मूल्यों निकालें. इस मामले में, ढलानों सकारात्मक मान रहे हैं और अवरोध नकारात्मक मान रहे हैं. प्रतीक ढलानों पर "एक्स" और प्रतीक "वाई" अवरोध करने दीजिए. परिणाम तालिका 2 में दिखाया गया है. -1 से वाई के मूल्यों गुणा और (इस जिले को शाफ़्ट अनुमति देता सकारात्मक मूल्यों का प्रतिनिधित्व करने के लिए प्रतीक वाई 'का उपयोग) सकारात्मक मूल्यों खेलते हैं. ध्यान दें, इस रूपांतरण इसी मूल्यों अगले कदम के लिए साजिश बनाने के लिए उपयोग किया जाता है के रूप में लंबे समय के रूप में वैकल्पिक है.
  5. एक्स, चित्रा 4b के मूल्यों के खिलाफ वाई 'के मूल्यों को प्लॉट. साजिश के रेखीय प्रतिगमन 1.706 के एक ढलान और -0.536 की एक अवरोधन पैदावार. Δ एसिड एच औसत - ढाल Δ एसिड एच से मेल खाती है. Δ एसिड एच औसत के मूल्य चयनित संदर्भ एसिड के सेट से निर्धारित होता है जो 330.5 किलो कैलोरी / मोल, हो जाता है. पेप्टाइड की गैस चरण अम्लता का मूल्य तो ढलान से प्राप्त होता है: Δ एसिड एच (ए 3 सीएच) = 332.2 किलो कैलोरी / मोल.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

  1. सीआईडी ​​bracketing प्रयोगों चयनित संदर्भ एसिड की तुलना में पेप्टाइड के रिश्तेदार acidities पर जानकारी प्रदान करते हैं. दो संदर्भ एसिड, DFAH और MBAH साथ पेप्टाइड (ए 3 सीएच) के दो प्रतिनिधि सीआईडी ​​स्पेक्ट्रा, 3 चित्र में दिखाया जाता है. चित्रा 3a में पेप्टाइड आयन के आयन बहुतायत (पीक ऊंचाई) DFA की कि ¯, और चित्रा 3b में, पेप्टाइड आयन के आयन बहुतायत एमबीए ¯ की तुलना में मजबूत है की तुलना में कमजोर है. दो स्पेक्ट्रा पेप्टाइड की गैस चरण अम्लता इन दो संदर्भ एसिड की acidities के बीच सीमा में है कि सुझाव.
  2. पेप्टाइड की गैस चरण अम्लता की मात्रात्मक मूल्य मात्रात्मक सीआईडी ​​प्रयोगों से निर्धारित होता है. छह संदर्भ एसिड के साथ पेप्टाइड का प्रोटॉन वाली समूहों की हदबंदी के लिए थर्मामीटरों गतिज भूखंडों चित्रा 4 में दिखाया गया. थर्मामीटरों गतिज relati के अनुसार भूखंडों के रेखीय प्रतिगमनगैस चरण अम्लता और सीआईडी ​​उत्पाद आयन शाखाओं अनुपात (चित्रा 1 बी) के बीच onship पेप्टाइड 332.2 किलो कैलोरी / मोल है जो एक 3 सीएच, की गैस चरण अम्लता के मूल्य देता है. ढलानों और अवरोध का नमूना मूल्यों टेबल्स 1 और 2 में दिखाया गया है.

चित्रा 1
चित्रा 1. विस्तारित सारे महाराज गतिज पद्धति की समग्र योजना. एक) प्रोटॉन वाली क्लस्टर आयन हदबंदी की योजना. गैस चरण acidities और अनुपात शाखाओं में सीआईडी ​​उत्पाद आयन के बीच ख) थर्मामीटरों गतिज रिश्ता. इस समीकरण में, Δ एसिड एच मैं व्यक्तिगत संदर्भ एसिड की गैस चरण अम्लता मूल्य है, Δ एसिड एच औसत एक हैसंदर्भ एसिड की verage गैस चरण अम्लता, Δ एसिड एच पेप्टाइड के लिए गैस चरण अम्लता है, Δ (Δ एस) एन्ट्रापी शब्द है, आर सार्वभौमिक गैस स्थिर है, और टी eff प्रणाली के प्रभावी तापमान है .

चित्रा 2
चित्रा 2. एक ट्रिपल quadrupole मास स्पेक्ट्रोमीटर. ईएसआई का एक योजनाबद्ध ड्राइंग electrospray आयनीकरण आयन स्रोत है. Q1 और Q3 में क्रमश: पहले और तीसरे quadrupole इकाइयों का प्रतिनिधित्व करते हैं. सीआईडी ​​के प्रयोग का प्रदर्शन करने पर, प्रोटॉन वाली क्लस्टर आयनों जन Q1 के द्वारा चुने जाते हैं, और टकराव सेल में लीक आर्गन (एर) परमाणुओं के साथ टकराने टक्कर सेल में निर्देशित कर रहे हैं, और जिसके परिणामस्वरूप टुकड़ा आयनों Q3 के द्वारा विश्लेषण कर रहे हैं.

चित्रा 3 चित्रा 3. दो संदर्भ एसिड, एक) [DFA • एच • एक 3 सी] ¯ और ख) [एमबीए • एच • एक 3 सी] ¯. स्पेक्ट्रा प्लॉट किए जाते हैं के रूप में रिश्तेदार के साथ पेप्टाइड का प्रोटॉन वाली क्लस्टर आयनों के लिए सीआईडी ​​स्पेक्ट्रा मी / z मूल्य के खिलाफ आयन बहुतायत.

चित्रा 4
4 चित्रा. चार टक्कर ऊर्जा को एकत्र छह संदर्भ एसिड के साथ पेप्टाइड के लिए थर्मामीटरों गतिज भूखंडों एक) वाई की साजिश = एल.एन. ([एक ¯] / [एक मैं ¯]) के खिलाफ एक्स = Δ एसिड एच मैं -. Δ एसिड एच औसत . ख) वाई 'की साजिश = [Δ एसिड एच - Δ एसिड एच </ उन्हें> औसत] / आरटी eff - Δ (Δ एस) / आर एक्स = 1 / आर टी eff के खिलाफ.

तालिका 1. सीआईडी ​​उत्पाद आयन शाखाओं में अनुपात के मूल्यों, एल.एन. ([एक ¯] / [एक मैं ¯]), DFAH और MBAH साथ पेप्टाइड का क्लस्टर आयनों के लिए.

हा मैं 11.7 eV 17.6 eV 23.4 eV 29.3 eV
MCAH 3.68 3.50 3.39 3.45
MBAH 2.83 2.65 2.45 2.24
DFAH -0.442 -0.268 -0.०,९२१ 0.167
DCAH -2.60 -2.41 -2.22 -2.13
DBAH -2.43 -2.44 -2.49 -2.60
TFAH -5.41 -5.02 -4.71 -4.44
तालिका 2. ढलानों के मूल्यों (एक्स) और थर्मामीटरों गतिज भूखंडों के पहले सेट के रेखीय प्रतिगमन से उत्पन्न अवरोध (वाई).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

एक पेप्टाइड की गैस चरण अम्लता के सफल माप काफी हद तक उपयुक्त संदर्भ एसिड के चयन पर निर्भर करता है. आदर्श संदर्भ एसिड अच्छी तरह से स्थापित गैस चरण अम्लता मूल्यों के साथ structurally समान कार्बनिक यौगिकों हैं. संदर्भ एसिड एक दूसरे के समान संरचना होनी चाहिए. इस सेट में संदर्भ एसिड से प्रत्येक के लिए deprotonation की एक समान एन्ट्रापी सुनिश्चित करेगा. संदर्भ एसिड पेप्टाइड्स के उन करे अम्लता मूल्यों होनी चाहिए. Amidated सी टर्मिनी साथ कम सिस्टीन युक्त ओलिगोपेप्टाइड लिए, कार्बोक्जिलिक एसिड उपयुक्त संदर्भ एसिड होते हैं halogenated. सफल सीआईडी ​​प्रयोगों की ओर एक महत्वपूर्ण कदम उच्च बहुतायत के साथ स्थिर प्रोटॉन वाली क्लस्टर आयनों का गठन है. स्थिरता और बहुतायत काफी हद तक संदर्भ एसिड, नमूना समाधान की एकाग्रता, और वाद्य की स्थिति (जैसे सुई वोल्टेज के रूप में, सुखाने के लिए पेप्टाइड का अनुपात समायोजन करके सुधार किया जा सकतागैस तापमान, और केशिका वोल्टेज). एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाई हालत केशिका वोल्टेज (या उपकरणों के कुछ अन्य प्रकार के कोन वोल्टेज) है. एक चेतावनी भी केंद्रित कर रहे हैं कि नमूना समाधान का उपयोग कर से बचने के लिए है.

वर्णित विधि ओलिगोपेप्टाइड तक सीमित नहीं है. विधि ध्रुवीय कार्बनिक यौगिकों, अमीनो एसिड और उनके डेरिवेटिव, organometallic यौगिकों, oligonucleotides है, और पेप्टाइड नकल उतार पॉलिमर सहित आणविक प्रणालियों की एक किस्म के लिए लागू किया जा सकता है. ट्रिपल quadrupole मास स्पेक्ट्रोमीटर उपयोग करने के अलावा, प्रयोग भी आयन जाल और क्यू TOF मास स्पेक्ट्रोमीटर का उपयोग किया जा सकता है.

इस प्रयोग में इस्तेमाल पेप्टाइड ठोस चरण पेप्टाइड संश्लेषण 29-31 की मानक पद्धति का उपयोग हमारी प्रयोगशाला में संश्लेषित किया गया था. रिंक एमाइड राल एमाइड सी टर्मिनस उपज के लिए ठोस समर्थन के रूप में इस्तेमाल किया गया था. सारे महाराज गतिज विधि का लाभ यह है कि टी में मामूली दोषउन्होंने पेप्टाइड नमूना दोष पेप्टाइड्स या संदर्भ एसिड के रूप में ही आम जनता के लिए नहीं है, जब तक अम्लता माप को प्रभावित नहीं करते.

प्रयोगात्मक माप acidities पर गठनात्मक प्रभाव की जांच करने के लिए कम्प्यूटेशनल पढ़ाई के साथ मिलकर किया जा सकता है. कम्प्यूटेशनल पढ़ाई उनकी गणना की acidities मैच कि पेप्टाइड्स की रचना की भविष्यवाणियों प्रदान करते हैं. मूल्यों की गणना के साथ प्रयोगात्मक मापा acidities की तुलना करके, पेप्टाइड्स की रचना का मूल्यांकन किया जा सकता है.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

Acknowledgments

Materials

कोली, EV

एक्स

1 / आर टी eff

वाई

- [(Δ एसिड एच - Δ एसिड एच औसत) / आरटी eff - Δ (Δ एस) / आर]

11.7 0.744 -0.728
17.6 0.700 -0.665
23.4 0.665 -0.611
29.3 0.645 -0.553
Name Company Catalog Number Comments
Mass Spectrometer Varian 1200 L and 320 L
Chloroacetic acid Sigma-Aldrich 402923
Bromoacetic acid Sigma-Aldrich B56307
Difluoroacetic acid Sigma-Aldrich 142859
Dichloroacetic acid Sigma-Aldrich D54702
Dibromoacetic acid Sigma-Aldrich 242357
Trifluoroacetic acid Sigma-Aldrich T6508

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Forsyth, W. R., Antosiewicz, J. M., Robertson, A. D. Empirical relationships between protein structure and carboxyl pKa values in proteins. Proteins: Struct. Funct. Genet. 48 (2), 388-403 (2002).
  2. Huyghues-Despointes, B. M. P., Scholtz, J. M., Baldwin, R. L. Effect of a single aspartate on helix stability at different positions in a neutral alanine-based peptide. Protein Sci. 2 (10), 1604-1611 (1993).
  3. Takahashi, N., Creighton, T. E. On the Reactivity and Ionization of the Active Site Cysteine Residues of Escherichia coli Thioredoxin. Biochemistry. 35 (25), 8342-8353 (1996).
  4. Gan, Z. R., Sardana, M. K., Jacobs, J. W., Polokoff, M. A. Yeast thioltransferase - the active site cysteines display differential reactivity. Archives of Biochemistry and Biophysics. 282 (1), 110-115 (1990).
  5. Philipps, B., Glockshuber, R. Randomization of the Entire Active-site Helix alpha 1 of the Thiol-disulfide Oxidoreductase DsbA from Escherichia coli. J. Biol. Chem. 277 (45), 43050-43057 (2002).
  6. Joshi, H. V., Meier, M. S. The effect of a peptide helix macrodipole on the pKa of an Asp side chain carboxylate. J. Am. Chem. Soc. 118, 12038-12044 (1996).
  7. Kortemme, T., Creighton, T. E. Ionization of cysteine residues at the termini of model α-helical peptides. Relevance to unusual thiol pKa values in proteins of the thioredoxin family. J. Mol. Biol. 253 (5), 799-812 (1995).
  8. Gallo, E. A., Gellman, S. H. Effect of a C-Terminal Cationic Group on the Competition between α-Helical Turn and β-Turn in a Model Depsipeptide. J. Am. Chem. Soc. 116 (25), 11560-11561 (1994).
  9. Honig, B., Nicholls, A. Classical electrostatics in biology and chemistry. Science. 268 (5214), 1144-1149 (1995).
  10. Warshel, A. Electrostatic basis of structure-function correlation in proteins. Acc. Chem. Res. 14 (9), 284-290 (1981).
  11. Cooks, R. G., Patrick, J. S., Kotiaho, T., McLuckey, S. A. Thermochemical determinations by the kinetic method. Mass Spectrom. Rev. 13 (4), 287-339 (1994).
  12. Cooks, R. G., Koskinen, J. T., Thomas, P. D. The kinetic method of making thermochemical determinations. J. Mass Spectrom. 34 (2), 85-92 (1999).
  13. Cheng, X., Wu, Z., Fenselau, C. Collision Energy Dependence of Proton-Bound Dimer Dissociation: Entropy Effects, Proton Affinities, and Intramolecular Hydrogen-Bonding in Protonated Peptides. J. Am. Chem. Soc. 115 (11), 4844-4848 (1993).
  14. Cerda, B. A., Wesdemiotis, C. Li+, Na+, and K+ Binding to the DNA and RNA Nucleobases. Bond Energies and Attachment Sites from the Dissociation of Metal Ion-Bound Heterodimers. J. Am. Chem. Soc. 118 (47), 11884-11892 (1996).
  15. Cooks, R. G., Wong, P. S. H. Kinetic Method of Making Thermochemical Determinations: Advances and Applications. Acc. Chem. Res. 31 (7), 379-386 (1998).
  16. Armentrout, P. B. Entropy Measurements and the Kinetic Method: a Statistically Meaningful Approach. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 11 (5), 371-379 (2000).
  17. Ren, J., Tan, J. P., Harper, R. T. Gas-Phase Acidities of Cysteine-Polyalanine Peptides I: A3,4CSH and HSCA3,4. J. Phys. Chem. A. 113 (41), 10903-10912 (2009).
  18. Morishetti, K. K., Huang, B. D. S., Yates, J. M., Ren, J. Gas-Phase Acidities of Cysteine-Polyglycine Peptides: The Effect of the Cysteine Position. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 21 (4), 603-614 (2010).
  19. Fersht, A. Structure and mechanism in protein science. , W.H. Freeman & Co. New York. (1999).
  20. Martin, J. L. Thioredoxin-a fold for all reasons. Structure. 3 (3), 245-250 (1995).
  21. Carvalho, A. P., Fernandes, P. A., Ramos, M. J. Similarities and Differences in the Thioredoxin Superfamily. Progress in Biophysics & Molecular Biology. 91 (3), 229-248 (2006).
  22. Bouchoux, G., Sablier, M., Berruyer-Penaud, F. Obtaining Thermochemical Data by the Extended Kinetic Method. J. Mass Spectrom. 39 (9), 986-997 (2004).
  23. Bouchoux, G., Desaphy, S., Bourcier, S., Malosse, C., Bimbong, R. N. B. Gas-Phase Protonation Thermochemistry of Arginine. J. Phys. Chem. B. 112 (11), 3410-3419 (2008).
  24. Bouchoux, G., Bimbong, R. N. B., Nacer, F. Gas-Phase Protonation Thermochemistry of Glutamic Acid. J. Phys. Chem. A. 113 (24), 6666-6676 (2009).
  25. Zheng, X., Cooks, R. G. Thermochemical Determinations by the Kinetic Method with Direct Entropy Correction. J. Phys. Chem. A. 106 (42), 9939-9946 (2002).
  26. Jones, C. M., Bernier, M., Carson, E., Colyer, K. E., Metz, R., Pawlow, A., Wischow, E. D., Webb, I., Andriole, E. J., Poutsma, J. C. Gas-phase acidities of the 20 protein amino acids. Int. J. Mass Spectrom. 267 (1-3), 54-62 (2007).
  27. Tan, J. P., Ren, J. Determination of the Gas-Phase Acidities of Cysteine-Polyalanine Peptides Using the Extended Kinetic Method. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 18 (2), 188-194 (2007).
  28. Harrison, A. G. The gas-phase basicities and proton affinities of amino acids and peptides. Mass Spectrom. Rev. 16 (4), 201-217 (1997).
  29. Peptides: Synthesis, Structures, and Applications. Gutte, B. , (1995).
  30. Barany, G., Merrifield, R. B. Solid-phase peptide synthesis. The Peptides. 2, Academic Press. New York. 1-284 (1979).
  31. Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis: A Practical Approach. Chan, W. C., White, P. D. , (2000).

Tags

रसायन विज्ञान अंक 76 जैव रसायन आण्विक जीवविज्ञान अम्लता गतिज विधि टक्कर प्रेरित पृथक्करण ट्रिपल quadrupole मास स्पेक्ट्रोमेट्री ओलिगोपेप्टाइड पेप्टाइड्स मास स्पेक्ट्रोमेट्री एमएस
ओलिगोपेप्टाइड की गैस चरण acidities का निर्धारण
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ren, J., Sawhney, A., Tian, Y.,More

Ren, J., Sawhney, A., Tian, Y., Padda, B., Batoon, P. Determination of the Gas-phase Acidities of Oligopeptides. J. Vis. Exp. (76), e4348, doi:10.3791/4348 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter