Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

קביעת Acidities גז השלב של Oligopeptides

Published: June 24, 2013 doi: 10.3791/4348
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1Department of Chemistry, University of the Pacific

Summary

קביעת acidities גז השלב של oligopeptides המכיל ציסטאין מתוארת. הניסויים מבוצעים באמצעות ספקטרומטר מסת quadrupole משולש. את acidities היחסי של פפטידים נמדדים באמצעות ניסויי דיסוציאציה התנגשות-Induced, ואת acidities כמותיות נקבעות באמצעות טבחים ממושכים שיטה קינטית.

Abstract

שאריות חומצת אמינו הנמצאים בתפקידים שונים בחלבונים מקופלים מפגינות לעתים קרובות דרגות acidities שונות. לדוגמה, שאריות ציסטאין ממוקמים ליד או N-סופית של סליל היא לעתים קרובות יותר חומצי מזה ליד או C-הסופית 1-6. למרות שמחקרים ניסיוניים נרחבים על מאפייני חומצת הבסיס של פפטידים בוצעו בשלב המרוכז, במיוחד בתמיסות מימיות 6-8, התוצאות לעתים קרובות מסובכות על ידי השפעות ממס 7. למעשה, מרבית האתרים הפעילים בחלבונים הממוקמים בסמוך לאזור הפנים שבו אפקטי ממס כבר ממוזערים 9,10. על מנת להבין את תכונות חומצת בסיס מהותיות של פפטידים וחלבונים, חשוב לבצע המחקרים בסביבה נטולת ממס.

אנו מציגים שיטה למדידת acidities של oligopeptides בגז השלב. אנו משתמשים המכיל ציסטאין Oligopeptide, עלא 3 CysNH 3), כמודל למתחם. המדידות מתבססות על השיטה המבוססת היטב המורחבת טבחים הקינטית (איור 1) 11-16. הניסויים מתבצעים באמצעות ספקטרומטר מסה משולש quadrupole ממשק עם יינון electrospray (ESI) מקור יון (איור 2). עבור כל דגימת פפטיד, חומצות התייחסות למספר נבחרו. חומצות התייחסות הן תרכובות אורגניות מבני דומות עם acidities גז שלב ידוע. פתרון של התערובת של הפפטיד וחומצת התייחסות מוחדר ספקטרומטר המסה, ומקבץ anionic גז שלב פרוטון בכריכה של חומצת פפטיד הפניה הוא נוצר. אשכול פרוטון בכריכה מבודד המוני ומקוטע בהמשך דרך התנגשות-Induced דיסוציאציה (CID) ניסויים. את שכיחות יון שבר כתוצאה מכך הם נותחו באמצעות מערכת יחסים בין acidities וקינטיקה דיסוציאציה יון האשכול. חומציות גז השלב של הפפטיד היא אז obtaiנד על ידי רגרסיה לינארית של החלקות תרמו הקינטית 17,18.

השיטה ניתן ליישם במגוון רחב של מערכות מולקולריות, כולל תרכובות אורגניות, חומצות אמינו ונגזרותיהם, oligonucleotides וoligopeptides. על ידי השוואת acidities גז השלב נמדד בניסוי עם אותם הערכים שחושבו עבור conformers שונה, ניתן להעריך השפעות קונפורמציה על acidities.

Introduction

את acidities של שאריות חומצת אמינו הוא בין המאפיינים החשובים ביותר המשפיעים על thermochemical מבנים, תגובתיות, והתהליכים שהתרחש קיפול של חלבונים 9,19. שאריות חומצת אמינו בודדות לעתים קרובות להראות acidities היעיל שונה בהתאם למיקומם בחלבונים. בפרט, את השאריות הנמצאות באתרים הפעילים מפגינות לעתים קרובות מוטרד acidities באופן משמעותי. דוגמה אחת כזו היא שאריות ציסטאין המתגוררים באתרים הפעילים של סופר המשפחה של אנזימי thioredoxin 20,21. ציסטאין האתר הפעיל הוא חומצי במיוחד בהשוואה לאלו בפרשו חלבונים 3-5. היה מי שהציע שקונפורמציה הסליל יכולה להיות תרומה משמעותית לחומציות יוצאת דופן. ישנם מחקרים ניסיוניים נרחבים על מאפייני חומצת הבסיס של פפטידים שבוצעו בפתרונות, בעיקר בתמיסות מימיות 2,6-8. התוצאות לעתים קרובות היו מסובכות על ידי אפקטי ממס7. למעשה, מרבית האתרים הפעילים בחלבונים הממוקמים בסמוך לאזור הפנים שבו אפקטי ממס הם מזעריים 9,10.

על מנת להבין את תכונות חומצת בסיס מהותיות של פפטידים וחלבונים, חשוב לבצע את המחקרים בסביבה נטולת ממס. כאן אנו מציגים שיטה המבוססת על ספקטרומטריית מסה לקביעת חומציות גז השלב. הגישה שמכונה שיטה הקינטית המורחבת טבחים. שיטה זו יושמה בהצלחה במגוון רחב של מערכות כימיות לזיהוי תכונות thermochemical שונים, כגון חומציות גז השלב, זיקת הפרוטון, זיקת יון המתכת, זיקה האלקטרונית, ואנרגיה יינון 11-15, 22-26. יש לנו ליישם שיטה זו על מנת לקבוע את acidities גז השלב של סדרה של אוליגו ציסטאין-polyalanine וציסטאין-polyglycine פפטידים 17,18,27. מחקרים אלה מראים כי ציסטאין N-מסוף peptidES באופן משמעותי יותר חומצי מאלה C-המסוף המתאימים. את acidities הגבוהות של לשעבר צפוי בשל השפעות קונפורמציה הסליל שבי אניון thiolate הוא התייצב בחום על ידי האינטראקציה עם מקרו דיפול סליל. בגלל האופי בלתי נדיף ותרמית יציב של פפטידים, השיטה הקינטית היא הגישה המעשית ביותר שקיים כיום כדי לייצר כמויות thermochemical מדויקות למדי חומצת בסיס של פפטידים 28.

התכנית הכללית והמשוואה קשורה לשיטה הקינטית מוצגות באיור 1. קביעת חומציות גז השלב של הפפטיד (AH) מתחילה עם הקמתה של סדרה של אניוני מצרר פרוטון בכריכות, [• H • i] ¯ (או [¯ • + H • אני ¯] ¯), באזור מקור יון של ספקטרומטר המסה, שבו ¯ ואני ¯ הם צורות deprotonated של הפפטיד וחומצות התייחסות, בהתאמה. חומצות התייחסות הן תרכובות אורגניות עם acidities גז שלב ידוע. חומצות התייחסות צריכה להיות מבנים דומים זה לזה (אך לא בהכרח דומה לזה של פפטיד). הדמיון של המבנים בין חומצות התייחסות מבטיח דמיון של entropies של deprotonation ביניהם. אשכול פרוטון בכריכה האניונים נבחרו המוניים והופעל collisionally ולאחר מכן ניתק באמצעות התנגשות-Induced דיסוציאציה (CID) ניסויים כדי להניב את אניוני monomeric המקביל, ¯ ואני ¯, עם קבועי קצב של K ו-K אני, בהתאמה, מוצג באיור 1 א. אם פיצולים משניים הם זניחים, יחס השפע של יוני בר CID, [¯] / [i ¯], מייצג מידה משוערת של היחס של קבועי קצב, K / K i. בהנחה שאין activat ההפוךמחסומי יונים בשני ערוצי דיסוציאציה, יון מוצר CID הסתעפות יחסים, בפיו [א ¯] / [A i ¯] חומצות התייחסות, יהיה מתואם ליניארי לחומציות גז השלב של הפפטיד (Δ החומצה H) ואלה של (Δ חומצת ח ט), כפי שמוצג באיור 1. במשוואה זו, Δ חומצת H ממוצע היא חומציות גז השלב הממוצעת של חומצות התייחסות, Δ (Δ S) הוא מונח האנטרופיה (שניתן להניח מתמיד אם חומצות התייחסות הן מבחינה מבנית דומות זה לזה), R הוא קבוע גז אוניברסלי, ו-T EFF הוא הטמפרטורה היעילה של המערכת. הטמפרטורה היעילה היא פרמטר אמפירי שתלוי במספר משתנים ניסיוניים, כולל את האנרגיה ההתנגשות.

הערך של חומציות גז השלב נקבע על ידי בניית שני סטים של חלקות תרמו הקינטית. הסט הראשון הוא obמזרקה על ידי התוויית LN ([¯] / [i ¯]) נגד Δ חומצת H i - Δ חומצת H ממוצע, כפי שמוצגת באיור 4 א. רגרסיה לינארית תניב קבוצה של קווים ישרים עם המדרונות של X = 1 / RT EFF ומיירט של Y = - [Δ H החומצה - חומצת Δ H AVG] / RT EFF - Δ (Δ S) / R. הסט השני של חלקות מתקבל על ידי מתכנן את תוצאת מיירט (Y) מהקבוצה הראשונה נגד המדרונות המתאימים (X), כפי שמוצגת באיור 4. רגרסיה לינארית מייצרת קו חדש עם שיפוע של Δ H החומצה - חומצת Δ H AVG ויירוט של Δ (Δ S) / R. הערך של Δ החומצה H לאחר מכן התקבל מהמדרון ומונח אנטרופיה, Δ (Δ S), מתקבלהיירוט.

הניסויים מבוצעים באמצעות ספקטרומטר מסת quadrupole משולש ממשק ליינון electrospray (ESI) מקור יון. תרשים סכמטי של ספקטרומטר המסה מוצג באיור 2. ניסויי CID מבוצעים על ידי מסת בחירת אניוני מצרר פרוטונים הכרוכים עם יחידת quadrupole הראשונה ומאפשרת להם לעבור התנגשויות עם אטומי ארגון דלפו לתוך תא ההתנגשות המתקיים בלחץ של סביב 0.5 mTorr. את יוני מוצר דיסוציאציה מנותחים המוניים עם יחידת quadrupole השלישית. ספקטרום CID נרשם בכמה אנרגיות התנגשות עם מגוון מ '/ z הרחב מספיק כדי לכסות את כל שברים משניים האפשריים. עוצמות יון מוצר CID נמדדות על ידי הגדרת המכשיר בניטור התגובה הנבחרת (SRM) במצב שבו הסריקה מתמקדת ביוני מוצר נבחרים. ניסויי CID מבוצעים בארבע אנרגיות התנגשות שונות, המקביל לאנרגיות מרכז מסה של-E (ס"מ) של 1.0, 1.5, 2.0, ו -2.5 EV, בהתאמה. מרכז האנרגיה של המסה מחושבת באמצעות המשוואה: E = E ס"מ המעבדה [מ '/ (M + מ')], שבו דואר מעבדה היא האנרגיה ההתנגשות במסגרת המעבדה, מ 'הוא המסה של ארגון, ו-M הוא המסה של פרוטון יון האשכול בכריכה.

במאמר זה, אנו משתמשים עלא Oligopeptide 3 CysNH 2 (CH 3) כמתחם המודל. C-הסופית הוא amidated וקבוצת תיאול (SH) של שאריות ציסטאין תהיה חומצי באתר. הבחירה של חומצות התייחסות המתאימות היא קריטית למדידת ההצלחה של חומציות גז השלב. חומצות התייחסות האידיאליות הן דומות מבחינה מבנית (זה לזה) תרכובות אורגניות עם ערכי חומציות גז שלב מבוססים היטב. חומצות התייחסות צריכה להיות ערכי חומציות קרובים לזו של פפטידים. לפפטיד CH 3, שש הלוגניים carboxyliחומצות C הן נבחרו כחומצות התייחסות. חומצות התייחסות לשש הן חומצת chloroacetic (MCAH), bromoacetic חומצה (MBAH), חומצת difluoroacetic (DFAH), חומצת dichloroacetic (DCAH), חומצת dibromoacetic (DBAH), וtrifluoroacetic (TFAH). שניים מהם, וDFAH MBAH, ישמש כדי להמחיש את הפרוטוקול.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. הכנה של פתרונות לדוגמא

  1. ראשון להכין את פתרונות המניות של הפפטיד ואת חומצות התייחסות לשש מעורב בשימוש בממס של מתנול ומים ביחס נפח של 1:1. את פתרונות המניות צריכים להיות בריכוז של כ -10 מ '-3
  2. לשקול את 1 מ"ג של מדגם פפטיד המוצק, CH 3, בצינור 1.5 מיליליטר אפנדורף ולהוסיף 1.0 מ"ל של חומר ממס מעורב של מתנול ומים, ומערבבים בעזרת מערבולת.
  3. לשקול את 1 מ"ג של חומצת difluoroacetic (DFAH) ולהוסיף 1.0 מ"ל של הממס מעורב של מתנול ומים, ומערבבים בעזרת מערבולת.
  4. להשתמש באותו הליך כדי להפוך את פתרונות המניות להתייחסות חומצות חומצה אחרת חמש chloroacetic (MCAH), bromoacetic החומצה (MBAH), חומצת dichloroacetic (DCAH), dibromoacetic חומצה (DBAH), וחומצת trifluoroacetic (TFAH).
  5. צייר כ -50 μl של פתרון מניות פפטיד לתוך צינור 1.5 מיליליטר אפנדורף, ולצייר על 50 μl של פתרון המניות של DFAH לsaשלי צינור Eppendorf. לדלל את התמיסה המעורבת עם 900 μl של הממס מעורב של מתנול ומים כדי להשיג ריכוז סופי של כ -10 מ '-4 תמיסה מדוללת זה תשמש כפתרון לדוגמה עבור מדידות ספקטרומטריית המסה. היחס בפועל של הפפטיד לחומצת ההתייחסות, כמו גם את הריכוז הסופי של פתרון המדגם יותאם מבוסס על שכיחות אות יון שנצפתה בספקטרומטר המסה.
  6. השתמש באותו הליך כדי להכין את פתרונות לדוגמה של פפטיד עם חמש חומצות התייחסות האחרות.

2. ספקטרומטריית מסה 1 מידות: גיבוש יון אשכול פרוטון בכריכה

  1. הצעד הראשון של מדידת ספקטרומטריית המסה הוא ליצור יוני מצרר פרוטון בכריכות יציבות של פפטיד עם חומצת התייחסות.
  2. הגדר את המכשיר במצב השלילי יון MS עם מתח מחט ESI ב-4.5 קילו וולט, מתח הנימים בכ -35 וולט, וטמפרטורת גז הייבוששמור על 150 ° C. הגדר את רוחב שיא Q1 ורוחב שיא Q3 הן לקנה המידה המכויל (רוחב השיא הוא פרמטר כלי שניתן להשתמש בו כדי להתאים את הרזולוציה של הפסגות. ההגדרה "מכוילת בקנה מידה" מאפשרת לך להציג פסגות צרות להפרדת שיא טובה יותר ). מתח הנימים וטמפרטורת גז הייבוש יכולים להיות מותאם כדי לשפר את שכיחות יון שנצפתה.
  3. להשרות על 0.5 מ"ל של פתרון המדגם של פפטיד DFAH לתוך מזרק 1 מיליליטר המילטון ולחבר את המזרק לכניסת מחט ESI באמצעות צינורות להציץ. לאחר מכן הנח את המזרק על מזרק המשאבה. הפעל את משאבת המזרק כדי להחדיר את פתרון המדגם לתוך מחט ESI עם קצב הזרימה ב10 μl / דקה.
  4. הפעל את מתח מחט ESI כדי להפעיל את תהליך ESI. הפעל את הגלאי. תצוגת ספקטרום המונית צריכה להיות שנצפתה במצב הפרופיל. אם המסך נמצא במצב centroid, לעבור למצב הפרופיל. צפה היווצרות יון אשכול הפרוטון הנכנס על ידי monitoring השיא ב '/ z 428. שפע האות של יון האשכול יכול להיות מותאם על ידי כוונון עדין של המכשיר. פרמטר חשוב הוא מתח הנימים. אפשר לשנות באופן ידני את מתח הנימים (בדרך כלל בטווח של -20 עד -50 V) על מנת למקסם את השפע של השיא ב '/ z 428.

3. ספקטרומטריית מסת מדידה 2: ניסויי bracketing CID

  1. השלב הבא הוא לבצע את ניסוי bracketing CID.
  2. לאחר השפע של יון האשכול מגיע לערך הרצוי (סביב 100 mV), לעבור למכשיר מצב MS / MS. במצב זה, פונקציות Q1 כגוש מסנן כדי לבודד את יון האשכול, פונקציות Q2 כתא ההתנגשות, ופונקציות Q3 כמנתח המוני.
  3. הגדר את גז ההתנגשות (ארגון, במקרה זה) בלחץ 0.5 mTorr ואנרגיה ההתנגשות ב17 eV. שלוש פסגות צריכים להיות שנצפתה בחלון ראוות הספקטרום ההמוני. השיא ב '/ z 428 מתאים ליון האשכול, [DFA • H • 3 CS] ¯. שני השיאים ב '/ z 332 ו'/ z 95 מתאים לפפטיד deprotonated (3 CS ¯) וחומצת difluoroacetic deprotonated (DFA ¯), בהתאמה. השיא בקטין מ '/ z 298 הוא שבר משני פפטיד deprotonated. לרכוש ספקטרום CID למשך 2 דקות, איור 3 א.
  4. לבצע ניסויים דומים CID ולרכוש ספקטרום CID לפתרון המדגם של פפטיד עם חומצת bromoacetic (MBAH), איור 3.
  5. לבצע ניסויים דומים CID ולרכוש את ספקטרום CID לפתרונות לדוגמא של פפטיד עם כל חומצות התייחסות האחרות. ספקטרום CID שיתקבל יהיה איכותי בדומה ל3 א ו 3 ב מספרים, אבל את ערכי m / z וגבה השיא היחסי יהיו שונים.

4. ספקטרומטריית מסת מדידה 3: שיטת קינטי

  1. השלב האחרון הוא לרכוש את ספקטרום SRM.
  2. לעבור לתצוגת ספקטרום centroid ולהגדיר את המכשיר לניטור התגובה הנבחר (SRM) במצב. שמור מ '/ z 428 כיון המבודד על ידי quadrupole הראשון (Q1), ולמלא בארבעה המונים (יחס מסה למטען) כדי להיות במעקב על ידי quadrupole השלישי (רבעון 3). ארבעת ההמונים הם מ '/ z 428 (יון האשכול), מ' / z 332 (יון פפטיד), מ '/ z 298 (שבר של יון פפטיד), ו'/ z 95 (DFA ¯ יון). שמור על לחץ גז ההתנגשות ברמה של 0.5 mTorr.
  3. הגדר את האנרגיה ההתנגשות ל11.7 eV ולרכוש את הספקטרום למשך 5 דקות.
  4. לשנות את האנרגיה ההתנגשות ל17.6 eV ולרכוש את הספקטרום למשך 5 דקות.
  5. לשנות את האנרגיה ההתנגשות ל23.4 EV, ו29.3 EV, ולרכוש את הספקטרום בשתי אנרגיות התנגשות למשך 5 דקות.
  6. לבצע מדידות דומות לפפטיד עם כל חומצות התייחסות האחרות.

5. ניתוח נתונים

  1. העתק את הערכים של עוצמות יון מאלl ספקטרום SRM על גבי גיליון עבודה של Excel.
  2. לחשב את יחסי יון מוצר CID הסתעפות, LN ([¯] / [i ¯]), שנמדד לכל ששת אשכולות פרוטון בכריכות בכל אנרגיות התנגשות ארבע. ערכי מדגם מוצגים בטבלת 1.
  3. להתוות את ערכיה של LN ([¯] / [i ¯]) נגד הערכים של חומצת Δ H i - Δ H החומצה AVG. זה ייתן לי ארבע חלקות מתאימות לנתונים בארבע אנרגיות התנגשות, איור 4 א.
  4. לחלץ את הערכים של המדרונות ומיירט על ידי רגרסיה לינארית מארבעת המגרשים. במקרה זה, המדרונות הם ערכים חיוביים ואת מיירט הם ערכים שליליים. תן הסימן "X" למדרונות והסמל "Y" למיירט. התוצאות מוצגות בטבלה 2. הכפל את הערכים של Y ב -1 ולהשתמש בסמל Y 'כדי לייצג את הערכים החיוביים (זה מאפשר ציר ה-Y לדיסלשחק ערכים חיוביים). שימו לב, המרה זו היא אופציונלית כל עוד הערכים התואמים משמשים כדי להפוך את העלילה לשלב הבא.
  5. להתוות את הערכים של Y "נגד הערכים של X, איור 4. רגרסיה לינארית של העלילה מניבה שיפוע של 1.706 ויירוט של -0.536. השיפוע מתאים לחומצת H Δ - Δ H החומצה AVG. הערך של Δ חומצת H AVG ידוע להיות 330.5 קלוריות / מול, אשר נקבעה על ידי הקבוצה של חומצות התייחסות לנבחרות. הערך של חומציות גז השלב של הפפטיד לאחר מכן התקבל מהמדרון: Δ החומצה H (3 CH) = 332.2 קלוריות / מול.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

  1. ניסויי סוגר CID לספק מידע על acidities היחסי של פפטיד בהשוואה לחומצות התייחסות לנבחרות. שניים ספקטרום CID נציג של הפפטיד (CH 3) עם שתי חומצות התייחסות, וDFAH MBAH, מוצג באיור 3. באיור 3 א שפע יון (גובה שיא) של יון פפטיד הוא חלש יותר מזה של DFA ¯, ובאיור 3 ב, השפע של יון יון פפטיד הוא חזק יותר מזה של MBA ¯. הספקטרום שתיים מציע כי חומציות גז השלב של הפפטיד היא בטווח שבין acidities של שתי חומצות התייחסות לאלה.
  2. הערך הכמותי של חומציות גז השלב של הפפטיד נקבע מניסויי CID כמותיים. החלקות תרמו הקינטית לניתוק של אשכולות פרוטון בכריכות של פפטיד עם חומצות התייחסות לשש מוצגות באיור 4. רגרסיה לינארית של החלקות לפי relati תרמו הקינטיתonship בין חומציות גז השלב והסתעפות יחס יון מוצר CID (איור 1) נותן את הערך של חומציות גז השלב של הפפטיד 3 CH, אשר הוא 332.2 קלוריות / מול. ערכי מדגם של המדרונות ומיירט מוצגים בלוחות 1 ו -2.

איור 1
איור 1. התכנית הכוללת של השיטה הקינטית המורחבת טבחים.) ערכה של פרוטון בכריכת אשכול יון דיסוציאציה. ב) היחסים תרמו הקינטית בין acidities גז השלב ויון מוצר CID הסתעפות יחס. במשוואה זו, Δ חומצת H אני הוא ערך חומציות גז השלב של חומצות התייחסות הבודדות, Δ חומצת H ממוצע הואחומציות גז שלב verage של חומצות התייחסות, Δ החומצה H הוא חומציות גז השלב לפפטיד, Δ (Δ S) הוא מונח אנטרופיה, R הוא קבוע הגז האוניברסלי, ו-T EFF הוא הטמפרטורה היעילה של המערכת .

איור 2
איור 2. ציור סכמטי של ספקטרומטר. ESI מסה משולש quadrupole הוא מקור יון יינון electrospray. Q1 Q3 ומייצגים את יחידות quadrupole הראשונות ושלישית, בהתאמה. לאחר ביצוע ניסוי CID, יוני מצרר פרוטון בכריכה נבחרו על ידי מסת Q1, והם מודרכים לתוך תא ההתנגשות להתנגש עם (AR) את אטומי הארגון דלפו לתוך תא ההתנגשות, ואת יוני שבר כתוצאה מכך הם נותחו על ידי Q3.

איור 3 איור 3. ספקטרום CID ליוני מצרר פרוטון בכריכות של פפטיד עם שתי חומצות התייחסות, א) [DFA • H • 3 ג] ¯ ו ב) [MBA • H • 3 ג] ¯. הספקטרום הם זממו כיחסיים שפע יון כנגד הערך '/ z.

איור 4
איור 4. החלקות תרמו הקינטית לפפטיד עם שש חומצות התייחסות שנאספו בארבע אנרגיות התנגשות) העלילה של Y = LN ([¯] / [i ¯]) נגד X = Δ החומצה H I - החומצה. Δ H AVG . ב) העלילה של Y '= [Δ H החומצה - חומצת Δ H </ Em> AVG] / RT EFF - Δ (Δ S) / R נגד X = 1 / RT EFF.

טבלת מס '1. ערכים של יחסי יון מוצר CID הסתעפות, LN ([¯] / [i ¯]), עבור יוני המקבץ של פפטיד עם DFAH וMBAH.

אני HA 11.7 eV 17.6 eV 23.4 eV 29.3 eV
MCAH 3.68 3.50 3.39 3.45
MBAH 2.83 2.65 2.45 2.24
DFAH -0.442 -0.268 -0.0921 0.167
DCAH -2.60 -2.41 -2.22 -2.13
DBAH -2.43 -2.44 -2.49 -2.60
TFAH -5.41 -5.02 -4.71 -4.44
טבלת 2. ערכים של המדרונות (X) ואת המיירט (Y) כתוצאה מרגרסיה לינארית של הסט הראשון של חלקות תרמו קינטית.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

המדידה המוצלחת של חומציות גז השלב של פפטיד מסתמכת במידה רבה על הבחירה של חומצות התייחסות מתאימות. חומצות התייחסות האידיאליות הן תרכובות אורגניות מבני דומות עם ערכי חומציות גז שלב מבוססים היטב. חומצות התייחסות צריכה להיות מבנים דומים זה לזה. זה יבטיח אנטרופיה דומה של deprotonation לכל אחת מחומצות התייחסות בקבוצה. חומצות התייחסות צריכה להיות ערכי חומציות קרובים לאלה של פפטידים. לoligopeptides המכיל ציסטאין קצר עם amidated C-טרמיני, הלוגניים חומצות קרבוקסיליות הן חומצות התייחסות מתאימות. צעד מכריע לקראת ניסויי CID מוצלחים הוא היווצרות של יוני מצרר פרוטון בכריכות היציבים עם שפע גבוה. היציבות והשפע ניתן לשפר במידה רבה על ידי התאמת היחס של הפפטיד לחומצת ההתייחסות, הריכוז של פתרון המדגם, ואת התנאים אינסטרומנטליים (כגון מתח המחט, ייבושטמפרטורת גז, ומתח הנימים). מצב אינסטרומנטלי אחד מכריע הוא מתח הנימים (או מתח קונוס לסוגי מכשירים מסוימים אחרים). זהירות אחת היא להימנע מפתרונות לדוגמה שמרוכזים יותר מדי שימוש.

השיטה המתוארת אינה מוגבלת לoligopeptides. השיטה ניתן ליישם במגוון רחב של מערכות מולקולריות, כולל תרכובות אורגניות קוטביות, חומצות אמינו ונגזרותיהם, תרכובות אורגנומתכתית, oligonucleotides, ופולימרים פפטיד מחק. בנוסף לשימוש בספקטרומטר המסה משולש quadrupole, יכול גם להתבצע ניסוי באמצעות מלכודות יונים וספקטרומטרים המוני ש-TOF.

הפפטיד משמש בניסוי זה היה מסונתז במעבדה שלנו תוך שימוש בשיטה הסטנדרטית של סינתזת פפטיד שלב מוצקה 29-31. השרף אמיד רינק שימש כתמיכה מוצקה להניב C-הסופית אמיד. היתרון בשיטה הוא שהטבחים הקינטית זיהומים קלים בtהוא מדגם הפפטיד אינו משפיע על מדידות החומציות, כל עוד אין להם את אותם הזיהומים המונים כמו פפטידים או את התייחסות לחומצות.

יכולות להיות בשילוב המדידות הניסיוניות עם מחקרים חישובית לבחינת השפעות קונפורמציה על acidities. מחקרים חישובית לספק תחזיות של את התצורות השונות של פפטידים התואמים acidities המחושב שלהם. על ידי השוואת acidities נמדד בניסוי עם הערכים מחושבים, ניתן להעריך את התצורות השונות של פפטידים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

אין לחשוף.

Acknowledgments

Materials

E Colli, EV

X

1 / RT EFF

Y

- [(Δ H החומצה - חומצת Δ H ממוצע) / RT EFF - Δ (Δ S) / R]

11.7 0.744 -0.728
17.6 0.700 -0.665
23.4 0.665 -0.611
29.3 0.645 -0.553
Name Company Catalog Number Comments
Mass Spectrometer Varian 1200 L and 320 L
Chloroacetic acid Sigma-Aldrich 402923
Bromoacetic acid Sigma-Aldrich B56307
Difluoroacetic acid Sigma-Aldrich 142859
Dichloroacetic acid Sigma-Aldrich D54702
Dibromoacetic acid Sigma-Aldrich 242357
Trifluoroacetic acid Sigma-Aldrich T6508

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Forsyth, W. R., Antosiewicz, J. M., Robertson, A. D. Empirical relationships between protein structure and carboxyl pKa values in proteins. Proteins: Struct. Funct. Genet. 48 (2), 388-403 (2002).
  2. Huyghues-Despointes, B. M. P., Scholtz, J. M., Baldwin, R. L. Effect of a single aspartate on helix stability at different positions in a neutral alanine-based peptide. Protein Sci. 2 (10), 1604-1611 (1993).
  3. Takahashi, N., Creighton, T. E. On the Reactivity and Ionization of the Active Site Cysteine Residues of Escherichia coli Thioredoxin. Biochemistry. 35 (25), 8342-8353 (1996).
  4. Gan, Z. R., Sardana, M. K., Jacobs, J. W., Polokoff, M. A. Yeast thioltransferase - the active site cysteines display differential reactivity. Archives of Biochemistry and Biophysics. 282 (1), 110-115 (1990).
  5. Philipps, B., Glockshuber, R. Randomization of the Entire Active-site Helix alpha 1 of the Thiol-disulfide Oxidoreductase DsbA from Escherichia coli. J. Biol. Chem. 277 (45), 43050-43057 (2002).
  6. Joshi, H. V., Meier, M. S. The effect of a peptide helix macrodipole on the pKa of an Asp side chain carboxylate. J. Am. Chem. Soc. 118, 12038-12044 (1996).
  7. Kortemme, T., Creighton, T. E. Ionization of cysteine residues at the termini of model α-helical peptides. Relevance to unusual thiol pKa values in proteins of the thioredoxin family. J. Mol. Biol. 253 (5), 799-812 (1995).
  8. Gallo, E. A., Gellman, S. H. Effect of a C-Terminal Cationic Group on the Competition between α-Helical Turn and β-Turn in a Model Depsipeptide. J. Am. Chem. Soc. 116 (25), 11560-11561 (1994).
  9. Honig, B., Nicholls, A. Classical electrostatics in biology and chemistry. Science. 268 (5214), 1144-1149 (1995).
  10. Warshel, A. Electrostatic basis of structure-function correlation in proteins. Acc. Chem. Res. 14 (9), 284-290 (1981).
  11. Cooks, R. G., Patrick, J. S., Kotiaho, T., McLuckey, S. A. Thermochemical determinations by the kinetic method. Mass Spectrom. Rev. 13 (4), 287-339 (1994).
  12. Cooks, R. G., Koskinen, J. T., Thomas, P. D. The kinetic method of making thermochemical determinations. J. Mass Spectrom. 34 (2), 85-92 (1999).
  13. Cheng, X., Wu, Z., Fenselau, C. Collision Energy Dependence of Proton-Bound Dimer Dissociation: Entropy Effects, Proton Affinities, and Intramolecular Hydrogen-Bonding in Protonated Peptides. J. Am. Chem. Soc. 115 (11), 4844-4848 (1993).
  14. Cerda, B. A., Wesdemiotis, C. Li+, Na+, and K+ Binding to the DNA and RNA Nucleobases. Bond Energies and Attachment Sites from the Dissociation of Metal Ion-Bound Heterodimers. J. Am. Chem. Soc. 118 (47), 11884-11892 (1996).
  15. Cooks, R. G., Wong, P. S. H. Kinetic Method of Making Thermochemical Determinations: Advances and Applications. Acc. Chem. Res. 31 (7), 379-386 (1998).
  16. Armentrout, P. B. Entropy Measurements and the Kinetic Method: a Statistically Meaningful Approach. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 11 (5), 371-379 (2000).
  17. Ren, J., Tan, J. P., Harper, R. T. Gas-Phase Acidities of Cysteine-Polyalanine Peptides I: A3,4CSH and HSCA3,4. J. Phys. Chem. A. 113 (41), 10903-10912 (2009).
  18. Morishetti, K. K., Huang, B. D. S., Yates, J. M., Ren, J. Gas-Phase Acidities of Cysteine-Polyglycine Peptides: The Effect of the Cysteine Position. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 21 (4), 603-614 (2010).
  19. Fersht, A. Structure and mechanism in protein science. , W.H. Freeman & Co. New York. (1999).
  20. Martin, J. L. Thioredoxin-a fold for all reasons. Structure. 3 (3), 245-250 (1995).
  21. Carvalho, A. P., Fernandes, P. A., Ramos, M. J. Similarities and Differences in the Thioredoxin Superfamily. Progress in Biophysics & Molecular Biology. 91 (3), 229-248 (2006).
  22. Bouchoux, G., Sablier, M., Berruyer-Penaud, F. Obtaining Thermochemical Data by the Extended Kinetic Method. J. Mass Spectrom. 39 (9), 986-997 (2004).
  23. Bouchoux, G., Desaphy, S., Bourcier, S., Malosse, C., Bimbong, R. N. B. Gas-Phase Protonation Thermochemistry of Arginine. J. Phys. Chem. B. 112 (11), 3410-3419 (2008).
  24. Bouchoux, G., Bimbong, R. N. B., Nacer, F. Gas-Phase Protonation Thermochemistry of Glutamic Acid. J. Phys. Chem. A. 113 (24), 6666-6676 (2009).
  25. Zheng, X., Cooks, R. G. Thermochemical Determinations by the Kinetic Method with Direct Entropy Correction. J. Phys. Chem. A. 106 (42), 9939-9946 (2002).
  26. Jones, C. M., Bernier, M., Carson, E., Colyer, K. E., Metz, R., Pawlow, A., Wischow, E. D., Webb, I., Andriole, E. J., Poutsma, J. C. Gas-phase acidities of the 20 protein amino acids. Int. J. Mass Spectrom. 267 (1-3), 54-62 (2007).
  27. Tan, J. P., Ren, J. Determination of the Gas-Phase Acidities of Cysteine-Polyalanine Peptides Using the Extended Kinetic Method. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 18 (2), 188-194 (2007).
  28. Harrison, A. G. The gas-phase basicities and proton affinities of amino acids and peptides. Mass Spectrom. Rev. 16 (4), 201-217 (1997).
  29. Peptides: Synthesis, Structures, and Applications. Gutte, B. , (1995).
  30. Barany, G., Merrifield, R. B. Solid-phase peptide synthesis. The Peptides. 2, Academic Press. New York. 1-284 (1979).
  31. Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis: A Practical Approach. Chan, W. C., White, P. D. , (2000).

Tags

כימיה גיליון 76 ביוכימיה ביולוגיה מולקולרית חומציות שיטה הקינטית התנגשות המושרה דיסוציאציה ספקטרומטריית מסה משולשת quadrupole oligopeptides פפטידים ספקטרומטריית מסה MS
קביעת Acidities גז השלב של Oligopeptides
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ren, J., Sawhney, A., Tian, Y.,… More

Ren, J., Sawhney, A., Tian, Y., Padda, B., Batoon, P. Determination of the Gas-phase Acidities of Oligopeptides. J. Vis. Exp. (76), e4348, doi:10.3791/4348 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter