激光伤害的斑马鱼胚胎骨骼肌

Summary

这里介绍的方法，包括精确的具有高能量的激光脉冲和随后的分析随时间的伤害和其恢复损伤的活斑马鱼胚胎。我们还展示了如何转基因标记的单或骨骼肌细胞可以被跟踪和激光损伤后。

Abstract

不同的实验方法，使用鼠标的目的是研究肌肉再生，的包括myotoxin注射（布比卡因，心脏毒素或notexin），，，肌肉移植（神经损伤周围血管离断术诱导再生），大强度运动引起肌肉损伤，但也小鼠的肌营养不良症模型如评论这些方法mdx小鼠（参见图^1）。在斑马鱼基因的方法包括突变体，表现出肌营养不良症的表型（，如runzel ²或sapje ^3）和反义寡核苷酸吗啉代，阻止营养不良相关基因的表达。此外，化学方法，也有可能， 例如 ，加兰他敏，一种化学化合物抑制乙酰胆碱酯酶，从而导致hypercontraction，最终导致肌营养不良症^5。然而，遗传学和药理学方法克enerally影响个人所有的肌肉内，而身体造成伤害的程度，更容易控制时间和空间上^1。本地化的人身伤害可以作为内部控制的评估对侧肌肉。事实上，我们最近用激光消融介导的细胞研究在斑马鱼胚胎⁶骨骼肌再生，而另一组最近报道了利用双光子激光（822 nm）的损害本地个别胚胎斑马鱼肌肉的细胞膜细胞^7。

在这里，我们报告使用微点激光（安道尔的技术）在斑马鱼胚胎骨骼肌细胞损伤的方法。微点激光是一种高能量的激光，这是适合于在波长为435nm的靶细胞消融。的激光以这样的方式被连接到显微镜（在我们的设置，光学显微镜从蔡司）显微镜，可以使用在同一时间f或聚焦在样品上的激光和用于可视化的伤人（明或荧光）的影响。用于控制激光脉冲的参数包括波长，强度和脉冲数。

由于其透明度和外部的胚胎发育，斑马鱼胚胎的研究为激光损伤和随后的复苏是非常适合的。受精后1至2天，体节骨骼肌细胞逐渐接受由前向后成熟体节发育的进展，从树干尾^8，9。在这些阶段，胚胎自发地抽搐，并开始游泳。最近斑马鱼已被确认为一个重要的脊椎动物模式生物组织再生的研究，许多类型的组织（心脏，神经，血管等）损伤的成年斑马鱼^10，11后是可以再生的。

Protocol

1。单细胞进行标记

注入单细胞阶段的胚胎的质粒编码GFP或任何GFP融合蛋白的β-肌动蛋白启动子的控制下。在开发过程中，GFP的表达，在时尚的马赛克。这里，我们使用的转基因构建体的Tg []，放置的α-辅肌动蛋白-GFP融合蛋白的β-肌动蛋白启动子的控制下的β-肌动蛋白：α-辅肌动蛋白-GFP。

2。胚胎嵌入

1. 收藏报错斑马鱼胚胎中，并保持在正常条件下，直到28高倍视野（分段根据^12）。
2. Dechorionate胚胎体视显微镜下，用镊子（杜蒙＃5）。
3. 准备在显微镜载片用凡士林环。
4. 准备1％低熔点琼脂糖/在10毫升10％的三卡因溶液与E3介质：煮沸100毫克琼脂糖E3溶液，得到的液体和均匀的琼脂糖溶液;等分和存储未使用的琼脂糖溶液，在-20℃下以供进一步使用。立即使用，让煮熟的解决方案冷静下来，保持在最大。 39°C。添加三卡因库存中的溶液中，得到的最终浓度为10％的三卡因。三卡因和琼脂糖均是必要的，以防止胚胎的变动。
5. 嵌入单个胚胎在1％低熔点琼脂糖/ 10％三卡因/ E3介质凡士林环内，与胚胎铺设自然的一侧，轻轻用盖玻片覆盖，只是为了保持胚胎到位并避免凸这将打破光的表面。理想的情况下，将有针对性的胚胎肌肉组织的触摸盖玻片。

3。胚胎激光伤人

1. 准备微点激光和显微镜：
   1. 如何设置和使用的激光显微镜结合的详细说明，请参阅微点激光手册。
   2. 选择正确的染料的435纳米波长的激光束的产生。
   3. 调整激光功率，通过使用衰减滑块。激光功率足够强大，打破了玻璃表面的单脉冲（ 例如对焦的样本，以测试此盖玻片）。这是细胞消融所需的激光功率。
2. 专注于感兴趣的使用安装在显微镜的目镜的分划板的区域或小区。使用20倍的物镜（40倍，将允许更精确的损害，但往往此透镜的工作距离是不够的）。

注1：激光不仅会损伤细胞的聚焦平面内，而且细胞的上方和下方激光束内。确保激光最佳地设定和调整内的z-轴的最大焦点的实验之前。最好是确定的激光损伤的深度进行实验之前，为了知道哪个小区极可能会受伤。

3. 设置的可视化的实验所需要的光：明场正常使用，或荧光如果目标是荧光标记的细胞。
4. 寄脉冲的激光的目标区域，或多个脉冲，这取决于所期望的程度的损伤。

4。伤人及恢复分析

1. 如果需要，该程序可以被记录的激光损伤活（ 例如，使用Metamorph软件流采集选项）。
2. 伤人后，立即被删除的胚胎从琼脂糖轻轻用钳子放回蛋水的恢复。

注2：肌肉活动（游泳和抽搐）是特别重要的是骨骼肌肉的恢复。由于胚胎不能移动，因为三卡因曝光和僵硬琼脂糖嵌入，它不是recommended，以维持胚胎幻灯片和盖玻片之间的时间过长。

3. 恢复后，可以固定的，胚胎，分析所需的通过光，荧光或共聚焦显微镜。

Representative Results

激光介导的损伤进行固定1日龄胚胎。数的激光脉冲在图1中所示，可以生成一个小伤口，由损坏的，盘绕，肌动蛋白丰富的肌原纤维，通常拉伸之间的体节边界容易辨认。然而，较高的激光脉冲造成的大规模破坏的体节块，其中最肌原纤维被破坏。不过，我们可以从字面上遵守“时间可以治愈一切伤口”愈合速度比大的小伤。恢复后，肌动蛋白，肌原纤维染色显示再次跨越正常的体节，但是，附加信息可以获得的染色Xirp1的。的Xirp1检测损伤和恢复时有发生，大量的本地化以及恢复以前受伤的肌肉细胞内的肌原纤维蛋白是一种很好的标记。

为了某些目的，重要的是要确定哪些细胞exactly所用激光中受伤，因此，它可能是有用的基因标记，以便能够精确可视化是针对哪个小区，然后评估其相邻小区是否有一些细胞（ 例如通过mosaically表达GFP标记的蛋白质）受到影响，以及由激光脉冲（ 图2）。损伤恢复和抗体染色后，它变得可以发现和分析目标小区再次感谢mosaically标记的细胞，它周围的图案。

一个有趣的方法是定期监察，随着时间的推移，激光介导的损伤是如何影响到体节肌肉。对于这一点，可记录激光损伤的固定的胚胎活到看的直接影响， 例如 ，在一分钟内（ 图3）。此外，“延时记录可进行任何所需的时间间隔（ 例如 5分钟间隔），为了遵循密切细胞如何重新排列在伤口周围。

图1。造成的伤害的严重程度可以相差很大，取决于激光脉冲的数量从伤病中恢复，因此，将继续在不同的步伐，但最终，大部分的伤口被关闭。我们最近的研究表明Xirp1（绿色）是一个很好的标志，因为它是肌肉再生上调后，受伤和本地化受损的肌原纤维的非横纹肌肌动蛋白（红色）在32 HPF ^6。

图2。可以专门针对标记细胞（修改后的参^6），CELLS标记的通过镶嵌表达的Tg [β-肌动蛋白α-肌动蛋白GFP（绿色或单色）。在这里，主要是针对这样的一个细胞在32 hpf时和几个激光脉冲造成严重的损坏，如所表示的红色的螺栓。中的白色箭头表示损伤的细胞;黄色箭头表示其他GFP标记的细胞。在右边的图片是经过一个伤口的恢复和抗体染色。

图3。直播流收购的激光损伤揭示，伤势如何影响整个体节块。蒙太奇的单一图片记录实时数据流模式（ 即约16帧/秒），DIC在Axioplan。黑色的箭头表示激光打体节的肌肉，在28 HPF。红色箭头表示缩回端部损坏的肌原纤维。这些动态的变化发生在2.5秒内体节块的。

Discussion

激光介导的损伤是造成所需大小的伤口，切除细胞，以研究在受控条件下的斑马鱼胚胎再生一个功能强大的方法。值得注意的是，细胞可以有针对性的精确（ 图2），可以控制损伤区以及定时。随后，上述损伤部位和再生过程很容易监测，记录（ 图3），并进行分析（ 图1）。然而，虽然激光以及集中在x-和y-轴，它不能完全集中在z-轴。这可能会导致损坏位于下面或上面所关注的细胞的细胞。然而，这种方法在体内的调查，对肌肉的修复开辟了一个广阔的领域。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Heating block
Pair #5 forceps	Dumont
Glass slides	Menzel		76 x 26 mm
Coverslips	Roth		50 x 24 mm #1
Petroleum jelly
Stereomicroscope	Leica		MZFLIII
Micropoint laser	Andor Technology
Fluorescence microscope	Zeiss		Axioplan II
Metamorph software	Molecular devices
Reagents Low-melting point agarose ( #50081, Lonza) Tricaine stock solution: 400 mg Tricaine (#A-5040, Sigma-Aldrich ) / 100 ml dH2O pH 9.0 E3 medium (5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl2, 0.33 mM MgSO4)