Laser-Påført skade af zebrafisk Embryonale skeletmuskulatur

Summary

Den metode, der præsenteres her omfatter den præcise skade af levende zebrafisk embryoner med højenergi-laserpulser og den efterfølgende analyse af disse skader og deres opsving med tiden. Vi viser også, hvordan genetisk mærkede enkelt eller grupper af skeletmuskelceller kan spores under og efter laserlys skader.

Abstract

Forskellige eksperimentelle metoder er blevet anvendt i mus for at inducere muskel skade med det formål at studere muskelregenerationen, herunder myotoxin injektioner (bupivacain, cardiotoxin og notexin), muskel transplantationer (denervering-devascularization induceret regeneration), intensiv træning, men også murine muskeldystrofi modeller såsom MDX mus (for en gennemgang af disse tilgange se ^1). I zebrafisk, indbefatter genetiske tilgange mutanter, som udviser muskeldystrofi fænotyper (f.eks runzel ² eller sapje ³⁾ og antisense-oligonukleotid morpholinos, der blokerer ekspression af dystrofi-associerede gener ^4. Desuden kemiske metoder er også mulige, fx med Galanthamin, en kemisk forbindelse inhibere acetylcholinesterase, hvilket resulterer i hypercontraction, som i sidste ende fører til muskelsvind ^5. Men genetiske og farmakologiske metoder generally påvirker alle muskler i et individ, hvorimod omfanget af fysisk påført skader er mere let kontrolleres rumligt og tidsligt ^1. Lokaliseret fysisk skade det muligt at vurdere kontralaterale muskler som en intern kontrol. Faktisk har vi for nylig anvendte laser-medieret celle ablation at studere skeletmuskulaturen regenerering i zebrafisk embryo ^6, mens en anden gruppe nylig rapporteret anvendelsen af et to-foton laser (822 nm) at skade meget lokalt plasmamembranen af individuelle embryonisk zebrafisk muskel celler ^7.

Her rapporterer vi en fremgangsmåde til anvendelse af micropoint laser (Andor Technology) for skeletmuskulatur cellebeskadigelse i zebrafisk embryo. The micropoint laser er en højenergi-laser, som er egnet til målrettet celle ablation ved en bølgelængde på 435 nm. Laseren er forbundet til et mikroskop (i vores setup, et optisk mikroskop fra Zeiss) på en sådan måde, at mikroskopet kan anvendes samtidigt feller fokuserer laserlyset ned på prøven, og til visualisering af virkningerne af sårdannelsen (lysfelt eller fluorescens). Parametrene til styring laserimpulser omfatter bølgelængde, intensitet og antal af pulser.

På grund af sin åbenhed og ekstern embryonale udvikling, zebrafisk embryo er meget modtagelig for både laser-induceret skade og for at studere den efterfølgende opsving. Mellem 1 og 2 dage efter befrugtning, somitic skeletmuskelceller gradvis undergår modning fra anterior til posterior følge progressionen af somitogenesis fra stammen til halen ^{8, 9.} På disse stadier, spontant embryoner spjæt og indlede svømning. The zebrafisk er for nylig blevet anerkendt som en vigtig vertebrat modelorganisme til undersøgelse af vævsregeneration, som mange typer af væv (hjerte, neuronal, vaskulær etc.) kan regenereres efter skade i den voksne zebrafisk ^{10, 11.}

Protocol

1. Mærkning enkeltceller

Injicere en celle embryoer med et plasmid, der koder for GFP eller GFP-fusionsproteinet under kontrol af en β-actin-promotoren. Under udvikling er GFP udtrykkes derefter i en mosaik mode. Her anvendte vi det transgene konstrukt Tg [β-actin: α-actinin-GFP], hvilket placerer α-actinin-GFP-fusionsproteinet under kontrol af β-actin-promotoren.

2. Embryo Embedding

1. Saml zebrafisk embryoner og under normale omstændigheder holde indtil 28 HPF (iscenesættelse i henhold til ^12).
2. Dechorionate embryoner under stereomikroskop med pincet (Dumont # 5).
3. Forbered et objektglas med en vaseline ring.
4. Der fremstilles en 1% lav-smeltepunkt agarose / 10% tricaine opløsning med E3 medium: kog 100 mg agarose i 10 ml E3 opløsning til opnåelse af en flydende og homogen agaroseopløsning, portion og gemubrugt agaroseopløsning ved -20 ° C til yderligere anvendelse. Til øjeblikkelig brug, lad kogt løsning køle ned og holdes ved max. 39 ° C. Tilføj tricaine stamopløsning til opnåelse af en slutkoncentration på 10% tricaine. Både tricaine og agarose er nødvendige for at forhindre embryonale bevægelser.
5. Indlejre et enkelt embryo i 1% lavtsmeltende agarose / 10% tricaine / E3 medium i vaseline ring, med embryonet om naturligt på den side, forsigtigt dækkes med et dækglas blot at fastholde en embryo på plads og for at undgå en konveks overflade, som ville bryde lyset. Ideelt set bør den embryoniske muskelvæv, der er målrettet røre dækglasset.

3. Embryo Laser sårdannelse

1. Forbered micropoint laser og mikroskopet:
   1. Der henvises til micropoint laser manual for detaljerede instruktioner om, hvordan du konfigurerer og bruge laser i forbindelse med mikroskop.
   2. Vælg den korrektefarvestof til frembringelse af en 435 nm bølgelængde laserstråle.
   3. Juster lasereffekt ved hjælp af dæmpning skyderen. Lasereffekten skal være stærk nok til at bryde en glasoverflade med en enkelt impuls (f.eks fokus på dækglasset på din prøve at teste dette). Dette er den lasereffekten for luftcelle ablation.
2. Fokus på regionen eller cellen af ​​interesse ved hjælp af sigtemidlet installeret i mikroskopets okular. Brug et 20x objektiv (40x vil tillade mere præcis skader, men ofte arbejdsafstanden ikke er tilstrækkelig til dette objektiv).

Note 1: Laseren vil ikke kun skade celler i fokusplan, men også celler over-og underside der er inden for laserstrålen. Sørg før forsøget, at laseren optimalt er sat op og justeret til en maksimal fokus i z-aksen. Det er bedst at bestemme dybden af ​​laser skade før udførelse af eksperimentet for at vide, hvilken celles præcis vil komme til skade.

3. Nedsat lyset nødvendige til visualisering eksperimentet: brightfield til normal brug, eller fluorescens, hvis målretning en fluorescens-mærket celle.
4. Sende en puls af laserlys til den målregion, eller flere pulser, afhængigt af den ønskede grad af skade.

4. Analyse af Anskydning and Recovery

1. Om ønsket kan fremgangsmåden ifølge laser skade sendes direkte (fx ved brug af strøm-valgmuligheden for Metamorph software). ⁶
2. Umiddelbart efter såring, bør fosteret fjernes forsigtigt fra agarosen med pincet og placeret tilbage i æg vand til nyttiggørelse.

Note 2: Muskuløs aktivitet (svømning og trækninger) er særlig vigtig for skeletmuskulatur opsving. Da embryonet ikke kan bevæge sig på grund af tricaine eksponering og den stive agarose indlejring, er det ikke recommended at opretholde embryoner mellem objektglas og dækglas for længe.

3. Efter genvinding, kan embryoet fastsættes og analyseres som ønsket af lys-, fluorescens-eller konfokal mikroskopi som angivet.

Representative Results

Laser-medieret skade blev udført på immobiliserede 1 dag-gamle embryoner. Som vist i figur 1, kan et par laserpulser genererer et lille sår, let genkendelig af de beskadigede, snoede, Actin-rige myofibriller, der normalt udspændt mellem somit grænser. Et højere antal laserimpulser vil dog resultere i et massivt beskadiget somit blok, hvor de fleste myofibriller bliver ødelagt. Ikke desto mindre kan vi bogstaveligt konstatere, at "tiden læger alle sår", med små skader healing hurtigere end større partikler. Efter inddrivelsen viser Actin farvninger at myofibriller igen spænder over somit normalt, men kan yderligere oplysninger kan opnås ved farvning for Xirp1. The Xirp1 proteinet er en god markør til påvisning, hvor skade og genvinding er forekommet, eftersom det ektopisk er lokaliseret langs udvinding myofibriller i tidligere beskadigede muskelceller ^6.

Til nogle formål er det vigtigt at bestemme, hvilke celler exactly er skadet med laseren, og derfor kan det være nyttigt at genetisk mærke visse celler (f.eks mosaically ekspression af et GFP-mærket protein) for at være i stand til at visualisere præcist hvilken celle målrettes og derefter at vurdere, om de nærliggende celler har blevet påvirket såvel af laserpuls (figur 2). Efter skade genvinding og antistoffarvning, bliver det muligt at finde og analysere den målrettede celle igen takket være mønstret af mosaically mærkede celler, der omgiver den.

En interessant tilgang er at overvåge regelmæssigt over tid, hvordan laser-medieret skade påvirker somitic muskel. Til dette kan laseren skade af den immobiliserede embryo sendes direkte at se de umiddelbare virkninger, fx inden for det første minut (figur 3). Endvidere kan timelapse optagelser udføres med enhver ønsket tidsinterval (fx 5 min interval), med henblik på at følge hvordan cellerne omarrangereomkring såret.

Figur 1. Sværhedsgraden af påførte skade kan variere meget, afhængigt af antallet af laser anvendt impulser. Derfor vil genrejsning efter skade forløbe ved forskel Skridt, men i sidste ende er de fleste sår lukket. Vi har for nylig vist, at Xirp1 (grøn) er en god markør for muskelregenerationen, da det er opreguleret efter skade og lokaliseres til ikke-sarcomerisk Actin (rød) af beskadigede myofibriller ved 32 HPF ^6.

Figur 2. Mærkede celler kan rettes specielt mod (modificeret fra ref ^6). CeLLS blev mærket ved mosaik ekspression af Tg [β-actin: α-actinin-GFP] (grøn eller monokrom). Én sådan celle blev trafiksignaler ved 32 HPF og alvorligt beskadiget af flere laserimpulser, som angivet med røde bolt. Den hvide pil angiver den skadede celler, gule pile angiver andre GFP-mærkede celler. Billedet til højre er taget efter helbredelse og antistof farvning af samme sår.

Figur 3. Live stream køb af laser skade afslører, hvordan skaden påvirker hele somit blokken. Montage af enkelte billeder optaget på Axioplan i live stream mode (dvs. omkring 16 billeder / sek) med DIC. Den sorte pil angiver, hvor laseren rammer somitic muskel ved 28 HPF. Røde pile angiver trække ender af en beskadigetmyofibril. Disse dynamiske ændringer inden for en somit blok sket inden for 2,5 sek.

Discussion

Laser-medieret læsion er en kraftfuld metode til at påføre sår med en ønsket størrelse ved at ablatere celler for at studere regeneration under kontrollerede forhold i zebrafisk embryo. Især kan celler være målrettet præcist (fig. 2), og både den skade område samt timing kan styres. Efterfølgende bliver skadestedet og regenerationsprocesser let kontrolleres, registreres (fig. 3) og analyseret (figur 1). Selv om laseren er udmærket fokuseret i x-og y-aksen, er det ikke fuldt fokuseret på z-aksen. Dette kan forårsage beskadigelse af celler placeret under eller over cellerne af interesse. Ikke desto mindre denne tilgang åbner et stort område af in vivo undersøgelser af muskel reparation.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Heating block
Pair #5 forceps	Dumont
Glass slides	Menzel		76 x 26 mm
Coverslips	Roth		50 x 24 mm #1
Petroleum jelly
Stereomicroscope	Leica		MZFLIII
Micropoint laser	Andor Technology
Fluorescence microscope	Zeiss		Axioplan II
Metamorph software	Molecular devices
Reagents Low-melting point agarose ( #50081, Lonza) Tricaine stock solution: 400 mg Tricaine (#A-5040, Sigma-Aldrich ) / 100 ml dH2O pH 9.0 E3 medium (5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl2, 0.33 mM MgSO4)