Summary
यहाँ प्रस्तुत विधि उच्च ऊर्जा लेजर दालों और ये समय के साथ और उनके वसूली चोटों के बाद के विश्लेषण के साथ रहते zebrafish भ्रूण की सटीक चोट शामिल हैं. हम यह भी पता चलता है कि आनुवंशिक एकल लेबल या कंकाल की मांसपेशी कोशिकाओं के समूहों के दौरान और लेजर प्रकाश प्रेरित क्षति के बाद लगाया जा सकता है.
Protocol
1. एकल कक्षों लेबलिंग
Β-actin एक प्रमोटर के नियंत्रण के तहत प्लाज्मिड एन्कोडिंग या किसी भी GFP-संलयन प्रोटीन GFP के साथ एक कोशिका चरण भ्रूण इंजेक्षन. विकास के दौरान, GFP तो एक मोज़ेक फैशन में व्यक्त की है. Β-actin प्रमोटर के नियंत्रण के अधीन α-Actinin - GFP संलयन प्रोटीन देता है: यहाँ, हम ट्रांसजेनिक का निर्माण टीजी [β-actin α-actinin - GFP] का उपयोग
2. भ्रूण एम्बेडिंग
- Zebrafish भ्रूण ले लीजिए और 28 HPF (मचान के अनुसार 12) जब तक सामान्य परिस्थितियों में बनाए रखने के.
- संदंश (# Dumont 5) के साथ stereomicroscope के तहत Dechorionate भ्रूण.
- एक खुर्दबीन स्लाइड तैयार एक पेट्रोलियम जेली अंगूठी के साथ.
- एक 1% कम पिघलने agarose / 10 में% E3 मध्यम के साथ tricaine समाधान बिंदु तैयार: 10 मिलीलीटर E3 समाधान में फोड़ा 100 मिलीग्राम agarose एक तरल और सजातीय agarose समाधान प्राप्त करने, अशेष भाजक और स्टोर-20 डिग्री सेल्सियस में आगे उपयोग के लिए अप्रयुक्त agarose समाधान. तत्काल उपयोग के लिए, उबला हुआ समाधान नीचे शांत करने के लिए और अधिकतम पर बनाए रखने. 39 डिग्री सेल्सियस 10% tricaine की एक अंतिम एकाग्रता प्राप्त tricaine स्टॉक समाधान जोड़ें. दोनों tricaine और agarose भ्रूण आंदोलनों को रोकने के लिए आवश्यक हैं.
- 1% कम पिघलने पेट्रोलियम जेली रिंग के भीतर मध्यम agarose / 10% / tricaine E3 में एक एकल भ्रूण एम्बेड, भ्रूण पक्ष पर स्वाभाविक रूप से बिछाने के साथ, धीरे एक coverslip के साथ कवर सिर्फ जगह में भ्रूण को बनाए रखने के लिए और एक उत्तल से बचने सतह पर जो प्रकाश को तोड़ना होगा. आदर्श रूप में, भ्रूण मांसपेशियों के ऊतकों है कि लक्षित किया जाएगा coverslip छूना चाहिए.
3. लेजर घायल भ्रूण
- Micropoint लेजर और माइक्रोस्कोप तैयार:
- कैसे स्थापित करने और माइक्रोस्कोप के साथ संयोजन के रूप में लेजर का उपयोग पर विस्तृत निर्देश लिए लेजर पुस्तिका micropoint देखें.
- सही चयन करेंएक 435 एनएम तरंगदैर्ध्य लेजर बीम की पीढ़ी के लिए डाई.
- क्षीणन स्लाइडर का उपयोग करके लेजर बिजली समायोजित करें. लेजर शक्ति मजबूत करने के लिए एक नाड़ी (उदाहरण के लिए अपने इस परीक्षण के लिए नमूना के coverslip पर ध्यान केंद्रित) के साथ एक गिलास सतह को तोड़ने के लिए पर्याप्त होना चाहिए. यह लेजर शक्ति सेल पृथक के लिए आवश्यक है.
- क्षेत्र या खुर्दबीन के नेत्र में स्थापित लजीला व्यक्ति का उपयोग ब्याज की सेल पर ध्यान दें. एक 20x उद्देश्य (40x अधिक सटीक क्षति अनुमति है, लेकिन अक्सर काम दूरी इस लेंस के लिए पर्याप्त नहीं है) का प्रयोग करें.
नोट 1: लेजर फोकस विमान के भीतर ही कोशिकाओं घायल नहीं है, लेकिन जाएगा भी ऊपर कोशिकाओं और नीचे है कि लेजर बीम के भीतर हैं. प्रयोग है कि लेजर बेहतर सेट कर दिया जाता है और z-अक्ष के भीतर एक अधिक से अधिक ध्यान केंद्रित करने के लिए समायोजित करने से पहले सुनिश्चित करें कि. यह सबसे अच्छा है प्रयोग का प्रदर्शन करने के क्रम में पता करने के लिए पहले लेजर चोट की गहराई का निर्धारण जो सेलबिल्कुल घायल हो जाएगा.
- प्रकाश प्रयोग visualizing के लिए आवश्यक सेट: सामान्य उपयोग करते हैं, या प्रतिदीप्ति के लिए brightfield अगर एक fluorescently लेबल सेल को लक्षित है.
- लेज़र प्रकाश की एक नाड़ी भेजें लक्षित क्षेत्र, या कई दालों, चोट के वांछित डिग्री पर निर्भर करता है.
4. लोग घायल हो गए और रिकवरी के विश्लेषण
- अगर वांछित, लेजर चोट की प्रक्रिया रहते हैं (जैसे Metamorph सॉफ्टवेयर की धारा अधिग्रहण के विकल्प का उपयोग कर) 6. दर्ज किया जा सकता
- घायल के बाद तुरंत, भ्रूण agarose से धीरे हटा दिया जाना चाहिए और संदंश के साथ वसूली के लिए अंडे पानी में वापस रखा.
नोट 2: पेशी गतिविधि (तैराकी और हिल) कंकाल की मांसपेशियों की वसूली के लिए विशेष रूप से महत्वपूर्ण है. चूंकि भ्रूण tricaine जोखिम और कड़ी agarose embedding की वजह से नहीं जा सकते हैं, यह recomme नहीं हैभी लंबे समय के लिए स्लाइड और coverslip के बीच भ्रूण को बनाए रखने के लिए nded.
- वसूली के बाद, भ्रूण और तय किया जा सकता है और प्रकाश, या प्रतिदीप्ति confocal माइक्रोस्कोपी द्वारा विश्लेषण के रूप में वांछित के रूप में संकेत दिया गया है.
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Representative Results
लेजर की मध्यस्थता चोट immobilized 1 दिन पुराने भ्रूण पर प्रदर्शन किया था. चित्र 1 में दिखाया गया है, कुछ लेजर दालों एक छोटा सा घाव उत्पन्न, आसानी से क्षतिग्रस्त, coiled, Actin अमीर myofibrils कि आम तौर पर कायखंड सीमाओं के बीच फैला रहे हैं द्वारा स्वीकार करने योग्य हो सकता है. लेजर दालों के एक उच्च संख्या लेकिन एक व्यापक से क्षतिग्रस्त कायखंड ब्लॉक, जहां सबसे myofibrils नष्ट कर रहे हैं में परिणाम देगा. फिर भी, हम सचमुच कि "समय सारे घाव भर देता है" छोटे बड़े लोगों की तुलना में तेजी चिकित्सा चोटों के साथ पालन कर सकते हैं. वसूली के बाद, Actin stainings बताते हैं कि myofibrils फिर विखंड अवधि सामान्य रूप से, तथापि, अतिरिक्त जानकारी Xirp1 के लिए धुंधला द्वारा प्राप्त किया जा सकता है. Xirp1 प्रोटीन जहां चोट और वसूली हुई है, के रूप में यह ectopically पूर्व घायल मांसपेशी 6 कोशिकाओं के भीतर myofibrils ठीक साथ स्थानीय है का पता लगाने के लिए एक अच्छा मार्कर है.
कुछ प्रयोजनों के लिए, यह निर्धारित करने के लिए महत्वपूर्ण है जो कोशिकाओं exactly लेजर के साथ घायल हो गए हैं, इसलिए यह उपयोगी हो सकता है के लिए आनुवंशिक रूप से कुछ कोशिकाओं (mosaically GFP टैग प्रोटीन व्यक्त जैसे) लेबल के क्रम में सेल लक्षित है जो ठीक है और फिर कल्पना का आकलन है कि अपने पड़ोसी की कोशिकाओं में सक्षम हो सकता है लेजर पल्स (2 चित्रा) के रूप में अच्छी तरह से प्रभावित है. चोट वसूली और एंटीबॉडी धुंधला हो के बाद, यह संभव हो जाता है खोजने के लिए और लक्षित सेल फिर से विश्लेषण mosaically लेबल यह कोशिकाओं के आसपास के पैटर्न के लिए धन्यवाद.
एक दिलचस्प दृष्टिकोण कैसे चोट लेजर मध्यस्थता विखंडकीय मांसपेशी को प्रभावित करता है समय पर नियमित रूप से निगरानी करने के लिए है. इस के लिए, immobilized भ्रूण की लेजर चोट करने के लिए 1 मिनट के भीतर (3 चित्रा) उदा तत्काल प्रभाव देखने के लिए जीना दर्ज किया जा सकता है. इसके अलावा, timelapse रिकॉर्डिंग किसी भी वांछित समय अंतराल (उदाहरण के लिए 5 मिनट अंतराल) के साथ प्रदर्शन किया जा सकता है, में आदेश का पालन करने के लिए बारीकी से कैसे कोशिकाओं को पुनर्व्यवस्थितघाव के आसपास.
चित्रा 1. प्रवृत्त चोट की गंभीरता बहुत भिन्न हो, लेजर लागू दालों की संख्या के आधार पर कर सकते हैं तदनुसार, चोट से उबरने के अंतर paces पर आगे बढ़ना होगा, लेकिन अंत में, सबसे घाव बंद हो जाती हैं. हमने हाल ही में पता चला है कि Xirp1 (हरा) मांसपेशियों के उत्थान के लिए एक अच्छा मार्कर है, क्योंकि यह चोट पर upregulated है और क्षतिग्रस्त myofibrils गैर sarcomeric (लाल) 32 6 HPF actin localizes.
चित्रा 2. लेबल की कोशिकाओं के लिए विशेष रूप (रेफरी से 6 संशोधित) लक्षित किया जा CE.LLS टीजी के मोज़ेक अभिव्यक्ति द्वारा चिह्नित किया गया था [β-actin: α actinin - GFP] (हरे या मोनोक्रोम). ऐसा ही एक सेल यहाँ 32 HPF में निशाना बनाया गया और गंभीर रूप से कई लेजर दालों से क्षतिग्रस्त है, के रूप में लाल बोल्ट ने संकेत दिया. सफेद तीर घायल सेल को इंगित करता है, पीले तीर अन्य कोशिकाओं GFP लेबल से संकेत मिलता है. सही पर तस्वीर ही घाव की वसूली और एंटीबॉडी धुंधला हो जाना के बाद लिया गया था.
चित्रा 3. लेजर चोट के लाइव स्ट्रीम अधिग्रहण से पता चलता है कि कैसे चोट पूरे विखंड ब्लॉक को प्रभावित करता है एक डीआईसी के साथ जीना धारा मोड (यानी लगभग 16 फ्रेम / सेक) में Axioplan में दर्ज चित्रों का असेंबल. काला तीर इंगित करता है जहां लेजर 28 HPF में विखंडकीय मांसपेशी हिट. लाल तीर से संकेत मिलता है retracting एक क्षतिग्रस्त समाप्त होता हैmyofibril. एक विखंड ब्लॉक के भीतर इन गतिशील परिवर्तन 2.5 सेकंड के भीतर हुई.
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Discussion
लेजर की मध्यस्थता की चोट कोशिकाओं ablating क्रम में zebrafish भ्रूण में नियंत्रित परिस्थितियों में उत्थान अध्ययन के द्वारा एक वांछित आकार के घाव inflicting के लिए एक शक्तिशाली तरीका है. विशेष रूप से, कोशिकाओं ठीक लक्षित किया जा सकता है (2 चित्रा) और दोनों चोट के रूप में के रूप में अच्छी तरह से क्षेत्र में समय से नियंत्रित किया जा सकता है. बाद में, चोट साइट और उत्थान प्रक्रियाओं को आसानी से निगरानी कर रहे हैं दर्ज (3 चित्रा) और विश्लेषण (1 चित्रा). हालांकि, हालांकि लेजर x-और y-अक्ष में अच्छी तरह से ध्यान केंद्रित किया है, यह पूरी तरह से z-अक्ष में ध्यान केंद्रित नहीं है. यह ब्याज की कोशिकाओं के नीचे या ऊपर स्थित कोशिकाओं को नुकसान का कारण हो सकता है. फिर भी, इस दृष्टिकोण मांसपेशी की मरम्मत के vivo जांच में एक विशाल क्षेत्र को खोलता है.
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Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
हम तकनीकी मदद और सलाह के लिए बॉब Nowak (Andor प्रौद्योगिकी) धन्यवाद. SA-S. ड्यूश Forschungsgemeinschaft (DFG) हाइजेनबर्ग फैलोशिप द्वारा समर्थित है. इस काम अनुदान SE2016/7-1 DFG द्वारा समर्थित किया गया.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Heating block | |||
| Pair #5 forceps | Dumont | ||
| Glass slides | Menzel | 76 x 26 mm | |
| Coverslips | Roth | 50 x 24 mm #1 | |
| Petroleum jelly | |||
| Stereomicroscope | Leica | MZFLIII | |
| Micropoint laser | Andor Technology | ||
| Fluorescence microscope | Zeiss | Axioplan II | |
| Metamorph software | Molecular devices | ||
Reagents
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References
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