Summary
Il metodo qui presentato comprende il pregiudizio preciso di embrioni di zebrafish in diretta con alta energia impulsi laser e la successiva analisi di tali lesioni e il loro recupero con il tempo. Mostriamo anche come geneticamente etichettati singoli o gruppi di cellule muscolari scheletriche possono essere monitorati durante e dopo un danno luce laser indotto.
Abstract
Diversi approcci sperimentali sono stati utilizzati nel topo per indurre infortunio muscolare, con l'obiettivo di studiare la rigenerazione muscolare, compresi gli apporti myotoxin (bupivacaina, cardiotossina o notexin), trapianti muscolari (denervazione-devascolarizzazione rigenerazione indotta), esercizio fisico intenso, ma anche modelli murini distrofia muscolare come ad esempio il topo mdx (per una rassegna di questi approcci vedi 1). In zebrafish, approcci genetici includono mutanti che presentano fenotipi distrofia muscolare (come runzel 2 o sapje 3) e antisenso Morpholinos oligonucleotide che bloccano l'espressione di geni associati alla distrofia 4. Inoltre, approcci chimici sono possibili, per esempio con Galanthamine, un composto chimico inibente acetilcolinesterasi, ottenendo in tal modo ipercontrazione, che finisce per distrofia muscolare 5. Approcci tuttavia, genetici e farmacologici generally colpire tutti i muscoli all'interno di un individuo, mentre l'entità delle ferite inferte fisicamente sono più facilmente controllabili spazialmente e temporalmente 1. Localizzata lesioni consente la valutazione del muscolo controlaterale come controllo interno. Infatti, abbiamo recentemente utilizzato ablazione laser-mediata delle cellule per studiare la rigenerazione del muscolo scheletrico nel zebrafish 6, mentre un altro gruppo ha recentemente riportato l'uso di un laser a due fotoni (822 nm) per danneggiare molto localmente la membrana plasmatica di singoli muscoli zebrafish embrionale celle 7.
Qui, si riporta un metodo per utilizzare il laser Micropoint (Andor Technology) per lesioni cellula muscolare scheletrica in zebrafish. Il laser Micropoint è un laser ad alta energia che è adatto per l'ablazione cellula bersaglio alla lunghezza d'onda di 435 nm. Il laser viene collegato ad un microscopio (nel nostro setup, un microscopio ottico Zeiss da) in modo tale che il microscopio può essere utilizzato al tempo stesso fo focalizzare la luce laser sul campione e per visualizzare gli effetti della ferita (campo chiaro o fluorescenza). I parametri per controllare gli impulsi laser comprendono lunghezza d'onda, intensità e numero di impulsi.
Grazie alla sua trasparenza ed esterna sviluppo embrionale, l'embrione di zebrafish è altamente suscettibile sia indotta da laser pregiudizio e per lo studio del successivo recupero. Tra 1 e 2 giorni dopo la fecondazione, somitic cellule muscolari scheletriche progressivamente maturano da anteriore a posteriore a causa della progressione della somitogenesis dal tronco alla coda 8, 9. In queste fasi, embrioni spontaneamente twitch e avviare il nuoto. Il pesce zebra è stata recentemente riconosciuta come un importante organismo modello vertebrato per lo studio della rigenerazione dei tessuti, come molti tipi di tessuti (cardiache, neuronale, vascolare ecc) possono essere rigenerati dopo lesione nell'adulto zebrafish 10, 11.
Protocol
1. Etichettatura singole cellule
Iniettare unicellulari embrioni allo stadio con un plasmide codificante GFP o qualsiasi proteina di fusione GFP sotto il controllo di un promotore di β-actina. Durante lo sviluppo, GFP è quindi espresso in modo mosaico. Qui, abbiamo usato il costrutto transgenico Tg [β-actina: α-actinina-GFP], che pone l'α-actinina-proteina di fusione GFP sotto il controllo del promotore di β-actina.
2. Embrione Embedding
- Raccogliere embrioni di zebrafish e mantenere, in condizioni normali, fino al 28 HPF (stadiazione secondo a 12).
- Embrioni Dechorionate allo stereomicroscopio con una pinza (Dumont # 5).
- Preparare un vetrino da microscopio con un anello di vaselina.
- Preparare un 1% a basso punto di fusione agarosio / 10% soluzione tricaine con mezzo E3: bollire 100 mg di agarosio in 10 ml di soluzione E3 ad ottenere un liquido omogeneo e soluzione di agarosio, aliquota e memorizzareinutilizzato soluzione di agarosio a -20 ° C per un ulteriore uso. Per l'uso immediato, lasciare che la soluzione bollita raffreddare e mantenere al massimo. 39 ° C. Aggiungi soluzione madre tricaine per ottenere una concentrazione finale del 10% tricaine. Sia tricaine e agarosio sono necessari per impedire movimenti embrionali.
- Incorporamento di un singolo embrione in 1% di agarosio a basso punto di fusione / 10% tricaine / E3 media all'interno dell'anello vaselina, con l'embrione, che naturalmente sul lato, delicatamente coprire con un coprioggetto solo per mantenere l'embrione in atto e per evitare un convesso superficie che avrebbe rotto la luce. Idealmente, il tessuto muscolare embrionale che saranno destinati dovrebbe toccare il coprioggetto.
3. Embryo Laser-ferimento
- Preparare il laser Micropoint e il microscopio:
- Si prega di fare riferimento al manuale Micropoint laser per le istruzioni dettagliate su come impostare e utilizzare il laser in combinazione con il microscopio.
- Selezionare la correttacolorante per la generazione di un fascio laser 435 nm di lunghezza d'onda.
- Regolare la potenza del laser utilizzando il cursore attenuazione. La potenza del laser dovrebbe essere abbastanza forte per rompere una superficie di vetro con un singolo impulso (es. fuoco sul vetrino del campione per testare questa). Questa è la potenza necessaria per l'ablazione laser cella.
- Concentrarsi sulla regione o cella di interesse utilizzando il reticolo installato nel oculare del microscopio. Utilizzare un obiettivo 20x (40x permetterà danni più precisa, ma spesso la distanza di lavoro non è sufficiente per questo obiettivo).
Nota 1: Il laser non solo danneggiare le cellule all'interno del piano di fuoco, ma anche celle sopra e sotto che sono entro il raggio laser. Assicurarsi prima dell'esperimento che il laser sia impostato in modo ottimale e regolata per una massima attenzione ai asse z. È preferibile determinare la profondità del danno laser prima di eseguire l'esperimento per sapere quale cellas esattamente saranno feriti.
- Impostare la luce necessaria per visualizzare l'esperimento: campo chiaro per l'uso normale, il targeting o la fluorescenza se una cella fluorescente marcato.
- Inviare un impulso di luce laser per la regione mirati, o più impulsi, a seconda del grado desiderato di lesioni.
4. Analisi della Ferita e recupero
- Se desiderato, la procedura di lesioni laser possono essere registrati vivo (ad esempio utilizzando l'opzione di acquisizione flusso del software Metamorph). 6
- Subito dopo il ferimento, l'embrione deve essere rimosso con delicatezza dal agarosio con una pinza e rimesso in acqua uovo per il recupero.
Nota 2: l'attività muscolare (nuoto e spasmi), è particolarmente importante per il recupero del muscolo scheletrico. Poiché l'embrione non può muoversi a causa dell'esposizione tricaine e l'incorporamento rigida agarosio, non è RACCOMAnded mantenere gli embrioni tra vetrino e coprioggetto per troppo tempo.
- Dopo il recupero, l'embrione può essere fissato e analizzati come desiderato dalla luce, microscopia a fluorescenza o confocale come indicato.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Lesioni laser-mediata è stata eseguita su immobilizzati 1 giorno di età embrioni. Come mostrato in figura 1, un paio di impulsi laser può generare una ferita piccola, facilmente riconoscibili dai danneggiati, arrotolati, Actina ricchi miofibrille che sono normalmente tese tra i confini somite. Un più alto numero di impulsi laser sarà comunque comportare un blocco somite massicciamente danneggiato, dove vengono distrutti maggior miofibrille. Tuttavia, si può osservare che letteralmente "il tempo guarisce tutte le ferite", con piccole ferite che guariscono più velocemente di quelle più grandi. Dopo il recupero, colorazioni actina mostrano che miofibrille nuovo coprono l'somite normalmente, tuttavia, ulteriori informazioni possono essere ottenute dalla colorazione per Xirp1. La proteina Xirp1 è un buon marcatore per rilevare cui lesione e recupero si verifica, come è ectopicamente localizzata lungo recupero miofibrille all'interno delle cellule muscolari precedentemente feriti 6.
Per alcuni scopi, è importante per determinare le celle exactly sono ferite con il laser, quindi, potrebbe essere utile etichettare geneticamente alcune cellule (ad esempio mosaically esprimendo una proteina GFP-tag) per essere in grado di visualizzare con precisione quale cella si rivolge e quindi di valutare se le celle confinanti hanno risentito nonché dagli impulsi laser (Figura 2). Dopo la colorazione lesioni recupero e anticorpo, diventa possibile trovare e analizzare la cellula bersaglio nuovamente grazie al modello di cellule marcate mosaically circondano.
Un approccio interessante è quello di monitorare regolarmente nel corso del tempo come il laser-mediata lesione colpisce il muscolo somitic. Per questo, il pregiudizio laser dell'embrione immobilizzato può essere registrato dal vivo per vedere gli effetti immediati, ad esempio, all'interno del primo minuto (Figura 3). Inoltre, le registrazioni timelapse può essere eseguita con qualsiasi intervallo di tempo desiderato (ad esempio, 5 min intervallo), per seguire da vicino come le cellule ridisporreintorno alla ferita.
Figura 1. La gravità del danno inflitto può variare notevolmente, a seconda del numero di impulsi laser applicata. Pertanto, il recupero da lesioni procederà a ritmi differenza, ma alla fine, la maggior parte delle ferite sono chiuse. Abbiamo recentemente dimostrato che Xirp1 (verde) è un buon indicatore per la rigenerazione muscolare, dal momento che è upregulated su lesioni e localizzati non sarcomerica Actina (rosso) delle miofibrille danneggiate al 32 HPF 6.
Figura 2. Cellule con etichetta possono essere destinati specificamente (modificato da Rif. 6). CeLLS sono stati etichettati da espressione mosaico di Tg [β-actina: α-actinina-GFP] (verde o bianco e nero). Una di queste cellule è stata mirata qui a 32 HPF e gravemente danneggiata da impulsi laser diversi, come indicato dal bullone rosso. La freccia bianca indica la cella di feriti; frecce gialle indicano altre cellule GFP-etichettati. L'immagine a destra è stata scattata dopo colorazione recupero e anticorpi della ferita stessa.
Figura 3. Acquisizione streaming in diretta di lesioni laser rivela come la lesione interessa l'intero blocco somite. Sequenza di immagini singole registrate al Axioplan in modalità streaming in diretta (vale a dire circa 16 fotogrammi / sec) con DIC. La freccia nera indica dove il laser colpisce il muscolo somitic a 28 HPF. Le frecce rosse indicano la scomparsa estremità di un danneggiatomiofibrilla. Questi cambiamenti dinamici all'interno di un isolato somite si sono verificati entro 2,5 sec.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Laser-mediata lesione è un metodo efficace per infliggere ferite della dimensione desiderata da ablazione cellule per studiare la rigenerazione in condizioni controllate in zebrafish. In particolare, le cellule possono essere mirati proprio (Figura 2) e sia l'area ferita e tempi può essere controllato. Successivamente, il sito di lesione e processi di rigenerazione sono facilmente controllati, registrati (Figura 3) e analizzati (Figura 1). Tuttavia, anche se il laser è ben focalizzata nella x-e y-asse, non è completamente concentrata in dell'asse z. Questo può causare danni alle cellule situate sotto o sopra le cellule di interesse. Tuttavia, questo approccio apre un vasto campo di ricerche in vivo di riparazione del muscolo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Acknowledgments
Ringraziamo Bob Nowak (Andor Technology) per assistenza e consulenza tecnica. SA-S. è sostenuto da una borsa di studio Heisenberg della Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG). Questo lavoro è stato sostenuto da DFG concessione SE2016/7-1.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Heating block | |||
| Pair #5 forceps | Dumont | ||
| Glass slides | Menzel | 76 x 26 mm | |
| Coverslips | Roth | 50 x 24 mm #1 | |
| Petroleum jelly | |||
| Stereomicroscope | Leica | MZFLIII | |
| Micropoint laser | Andor Technology | ||
| Fluorescence microscope | Zeiss | Axioplan II | |
| Metamorph software | Molecular devices | ||
Reagents
|
|||
References
- Charge, S. B., Rudnicki, M. A. Cellular and molecular regulation of muscle regeneration. Physiol. Rev. 84, 209-238 (2004).
- Steffen, L. S. The zebrafish runzel muscular dystrophy is linked to the titin gene. Dev. Biol. 309, 180-192 (2007).
- Bassett, D., Currie, P. D. Identification of a zebrafish model of muscular dystrophy. Clin. Exp. Pharmacol. Physiol. 31, 537-540 (2004).
- Kawahara, G., Serafini, P. R., Myers, J. A., Alexander, M. S., Kunkel, L. M. Characterization of zebrafish dysferlin by morpholino knockdown. Biochem. Biophys. Res. Commun. 413, 358-363 (2011).
- Behra, M., Etard, C., Cousin, X., Strähle, U. The use of zebrafish mutants to identify secondary target effects of acetylcholine esterase inhibitors. Toxicol. Sci. 77, 325-333 (2004).
- Otten, C., et al. Xirp proteins mark injured skeletal muscle in zebrafish. PLoS One. 7, e31041 (2012).
- Roostalu, U., Strähle, U. In vivo imaging of molecular interactions at damaged sarcolemma. Dev. Cell. 22, 515-529 (2012).
- Stickney, H. L., Barresi, M. J., Devoto, S. H. Somite development in zebrafish. Dev. Dyn. 219, 287-303 (2000).
- Stellabotte, F., Dobbs-McAuliffe, B., Fernandez, D. A., Feng, X., Devoto, S. H. Dynamic somite cell rearrangements lead to distinct waves of myotome growth. Development. 134, 1253-1257 (2007).
- Choi, W. Y., Poss, K. D. Cardiac regeneration. Curr. Top. Dev. Biol. 100, 319-344 (2012).
- Stewart, S., Stankunas, K. Limited dedifferentiation provides replacement tissue during zebrafish fin regeneration. Dev. Biol. 365, 339-349 (2012).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev. Dyn. , 203-253 (1995).
