Summary
여기에 제시된 방법은 고 에너지 레이저 펄스와 시간을 통해 이러한 부상과 회복의 후속 분석 라이브 zebrafish 배아의 정확한 부상을 포함한다. 우리는 또한 유전자 하나의 표시 또는 골격근 세포의 그룹이 동안 레이저 광 유도 손상 후 추적 할 수있는 방법을 보여줍니다.
Abstract
다양한 실험 방법은 손쥐 근육 영양 장애 모델도 myotoxin 주사 (bupivacaine, cardiotoxin 또는 notexin), 근육 transplantations (denervation-devascularization 유도 재생), 집중적 인 운동을 포함하여 근육 재생을 연구하는 목적으로 근육 부상을 유발하기 위해 마우스를 사용하지만, 한 MDX 마우스 (이 방법의 검토 1 참조) 등. zebrafish에서 유전자 접근법은 근육의 영양 장애의 phenotypes (예 : runzel 2 sapje 3 등) 전시 및 영양 장애 - 관련 유전자의 표현 4 차단 oligonucleotide morpholinos를 안티센스 돌연변이가 포함되어 있습니다. 또, 화학 접근함으로써 결국 근육 영양 장애 5 연결 hypercontraction, 그 결과도 Galanthamine, 화학 화합물 억제 acetylcholinesterase와 예 가능합니다. 그러나, 유전 및 약리 접근 g물리적으로 입은 부상의 정도가보다 쉽게 spatially과 시간적으로 한 통제하는 반면 enerally, 개인 내의 모든 근육에 영향을 미칩니다. 현지화 신체적 부상은 내부 통제 등의 contralateral 근육 평가를 할 수 있습니다. 다른 그룹은 최근 매우 로컬 개별 배아 zebrafish 근육의 플라즈마 막에 손상을하기 위해 두 광자 레이저 (822 nm 정도)의 사용을보고하면서 실제로, 우리는 최근 zebrafish 배아 6 골격근 재생을 공부하는 레이저로 인한 세포 절개를 사용 세포 7.
여기, 우리는 zebrafish 배아의 골격근 세포 손상에 대한 micropoint 레이저 (ANDOR 기술)를 사용하는 방법을보고합니다. micropoint 레이저는 435 nm의 파장을 대상으로 휴대 절제에 적합한 고 에너지 레이저입니다. 레이저는 현미경이 동일한 시간 F에서 사용할 수있는 방식으로 (우리의 설치, Zeiss의 광학 현미경)을 현미경에 연결되어또는 샘플에와 남긴 상처 (brightfield 또는 형광)의 효과를 시각화를위한 레이저 빛을 초점을 맞추고. 레이저 펄스를 제어하기위한 매개 변수 파장, 강도, 그리고 펄스의 수를 포함합니다.
의 투명성과 외부 배아 발달로 인해, zebrafish 배아는 레이저 유도 부상 및 모두 후속 복구를 공부 높은 의무가 있습니다. 1 ~ 2 일 후 수정을, somitic 골격근 세포는 점차적으로 꼬리 8, 9 트렁크에서 somitogenesis의 진행으로 인해 뒤쪽하기 위해 앞의 성숙을 받고있다. 이 단계에서 배아는 자발적으로 경련과 수영을 시작합니다. zebrafish는 최근 성인 zebrafish 10, 11 부상 후 다시 생성 할 수 있습니다 조직의 여러 유형 (등 혈관, neuronal, 심장)으로, 조직 재생 연구의 중요한 척추 모델 생물체로 인식되었습니다.
Protocol
1. 단일 셀 라벨
β-고를 프로모터의 조절하에 플라스미드 인코딩 GFP 또는 GFP-융합 단백질과 함께 한 세포 단계 배아를 삽입. 개발 과정, GFP는 다음 모자이크 방식으로 표현된다. 여기, 우리는 사용 된 유전자 변형 구조 TG [β-고를 : α-actinin-GFP], 그 β-고를 프로모터의 제어에 따라 α-Actinin-GFP 융합 단백질을 남깁니다.에게
2. 배아 퍼가기
- zebrafish의 배아를 수집 및 28 hpf (준비는 12에 따라)까지 정상적인 조건에서 유지합니다.
- 포셉 (뒤몽 # 5)으로 stereomicroscope에 따라 Dechorionate 배아.
- 석유 젤리 링과 현미경 슬라이드를 준비합니다.
- 1 %의 낮은 녹는 점 아가로 오스 / E3 매체가 10% tricaine 솔루션 준비 : 액체와 균일 한 아가로 오스 솔루션을 얻기 위해 10 ML E3 솔루션에 종기가 100 MG 아가로 오스를, 나누어지는 및 매장자세한 사용을위한 -20 ° C에서 사용하지 않는 아가로 오스 솔루션입니다. 즉시 사용을 위해, 삶은 솔루션은 냉각과 맥스를 유지 보자. 39 ° C. 10% tricaine의 최종 농도를 얻기 위해 tricaine 주식 솔루션을 추가합니다. tricaine와 아가로 오스는 모두 배아 움직임을 방지하기 위해 필요합니다.
- 배아은 옆에 자연스럽게 놓고와 함께, 1 % 석유 젤리 링에서 낮은 용융 아가로 오스 / 10 % tricaine / E3 매체에 하나의 배아를 삽입, 부드럽게 제자리에 배아를 유지하고 볼록을 피하기 위해 coverslip으로 커버 빛을 깰 것이다 표면. 이상적으로, 타겟팅됩니다 배아 근육 조직은 coverslip을 터치해야합니다.
3. 태아 레이저 남긴 상처
- micropoint 레이저와 현미경을 준비 :
- 현미경과 함께 설정하고 레이저를 사용하는 방법에 대한 자세한 내용은 micropoint 레이저 설명서를 참조하십시오.
- 올바른을 선택435 nm의 파장 레이저 빔의 생성을위한 염료.
- 감쇠 슬라이더를 사용하여 레이저 파워를 조정합니다. 레이저 전원은 단일 펄스 (이 테스트 샘플의 coverslip에 예를 들면 초점)로 유리 표면을 아프게 할 수있을 정도로 회복이 있어야합니다. 이 세포 절제에 필요한 레이저 파워입니다.
- 현미경의 접안 렌즈에 설치된 reticle을 사용하여 관심있는 지역이나 셀에 초점을 맞 춥니 다. 20x 목표를 (40x 더 정확한 손상을 수 있지만, 종종 작동 거리가 렌즈에 충분하지 않습니다)를 사용하십시오.
주 1 : 레이저는 초점 비행기 내에서 세포를 손상뿐만 아니라, 위의 셀과 레이저 빔 내에있는 아래에되지 않습니다. 레이저가 최적으로 설정하고 Z 축에서 최대 초점을 조정하는 실험을하기 전에 있는지 확인합니다. 그것은 알기 위해 실험을 수행하기 전에 레이저 부상의 깊이를 결정하는 가장 적합한 셀s이 (가) 정확히 부상 될 것입니다.
- 휘황 - 라벨 세포를 타겟으로하는 경우 정상적인 사용, 또는 형광에 대한 brightfield : 실험을 시각화에 필요한 빛을 설정합니다.
- 부상 원하는 정도에 따라 대상 지역 또는 여러 펄스에 레이저 빛의 펄스를 보냅니다.
4. 남긴 상처 및 복구 분석
- 원하는 경우, 레이저 부상의 절차는 라이브 (예 : Metamorph 소프트웨어의 스트림 인수 옵션을 사용) 6.를 기록 할 수 있습니다
- 즉시 남긴 상처 후, 배아는 포셉으로 아가로 오스에서 부드럽게 제거 및 복구에 달걀 물에 다시 배치해야합니다.
2 참고 : 근육질 활동 (수영 꿈틀) 골격근 복구를 위해 특히 중요합니다. 배아는 tricaine 노출과 치열한 아가로 오스 퍼가기 때문에 이동할 수 없습니다 때문에, recomme하지 않습니다너무 오래 슬라이드와 coverslip 사이의 배아을 유지하기 위해 nded.
- 표시로 복구 후, 배아는 빛, 형광 또는 공 촛점 현미경에 의해 수정하고 원하는대로 분석 할 수 있습니다.
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Representative Results
레이저로 인한 부상은 고정 일일 된 배아에서 수행되었다. 그림 1에 도시 된 바와 같이, 몇 레이저 펄스는 일반적으로 체절 경계 사이에 뻗어있는 손상된, 코일, 고를 풍부한 myofibrils로 쉽게 알아볼 수, 작은 상처를 생성 할 수 있습니다. 레이저 펄스의 더 많은 그러나 대부분의 myofibrils이 파괴되어 크게 손상 체절 블록에서 발생합니다. 그럼에도 불구하고, 우리는 그대로 큰 사람보다 더 빨리 회복 작은 부상으로, "시간이 모든 상처를 치유"라고 볼 수 있습니다. 복구 후, 고를의 stainings는 myofibrils가 다시 정상적으로 체절에 걸쳐 것을 보여하지만, 추가 정보가 Xirp1에 얼룩으로 얻은 수 있습니다. Xirp1 단백질 그것이 ectopically 이전에 부상을 근육 세포 6 시간 내에 myofibrils를 복구 함께 지역화로 부상 및 복구가 발생한 곳을 검출하기위한 좋은 표시입니다.
특정 용도를 들어, 세포가 exactl를 결정하는 것이 중요합니다Y는 레이저로 부상되며, 따라서 유전자의 주변 세포가 있는지 여부를 평가하기 위해 정확하게 어떤 세포가 타겟으로하는 후 시각화 할 수하기 위해 일부 세포를 (mosaically GFP 태그 단백질을 표현하여 예) 라벨을 유용 할 수 있습니다 레이저 펄스 (그림 2)에 의해뿐만 아니라 영향을받은. 상해 복구 및 항체 염색 후는 주변 mosaically 표시된 셀의 패턴 덕분에 찾아 다시 대상 셀을 분석하는 것이 가능하게됩니다.
하나의 흥미로운 접근 방식은 레이저로 인한 손상은 somitic 근육에 영향을 미치는 방법을 시간이 지남에 따라 정기적으로 모니터링하는 것입니다. 이 경우, 고정 배의 레이저 부상은 예를 들어 첫 번째 분 (그림 3)에 즉시 효과를 볼 수 라이브 녹음 할 수 있습니다. 또한, timelapse 녹음은 세포가 재 배열 밀접 방법에 따라 할 수 있도록, 원하는 시간 간격 (예 : 5 분 간격)로 수행 할 수 있습니다상처 주변.
1 그림. 입은 부상의 심각도는 따라서, 부상에서 회복 차이 보에서 진행됩니다. 적용 레이저 펄스의 수에 따라 크게 다를 수 있지만, 결국, 대부분의 상처은 실행 종료와 함께 해제된다. 우리는 최근이 부상에 upregulated 32 hpf 6 손상된 myofibrils의 비 sarcomeric 고를 (빨간색)에 localizes되어 있기 때문에 Xirp1 (녹색)가, 근육 재생에 대한 좋은 표시입니다 것으로 나타났습니다.
그림 2. 표시 셀은 특별히 (참조 6에서 수정) 타겟팅 할 수 있습니다. CE는재편은 TG의 모자이크 식으로 라벨이 붙지 만 [β-고를 : α-actinin-GFP] (녹색 또는 흑백). 하나의 셀이 32 hpf '에서 대상과 심각하게 여러 레이저 펄스에 의해 손상되었다, 같은 빨간색 볼트로 표시. 흰색 화살표는 부상당한 셀을 나타냅니다, 노란색 화살표는 다른 GFP-라벨 세포를 나타냅니다. 오른쪽의 그림은 그 상처의 복구 및 항체 염색 후 촬영되었다.
그림 3. 레이저 부상 라이브 스트림 인수 부상이 전체 체절 블록에 영향을 미치는 방법을 공개한다. DIC와 함께 라이브 스트림 모드 (즉, 약 16 프레임 / 초)에 Axioplan로 기록 단일 사진의 몽타쥬가. 레이저 28 hpf에서 somitic 근육에 도달 할 곳 검은 색 화살표가 표시됩니다. 빨간색 화살표는 retracting가 손상의 종료 표시myofibril. 한 체절 블록 내에서 이러한 역동적 인 변화는 2.5 초 내에 발생했습니다.
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Discussion
레이저로 인한 손상은 zebrafish 배아의 제어 조건 하에서 재생을 연구하기 위해 셀을 흡열하여 원하는 크기의 상처를 가하는위한 강력한 방법입니다. 특히, 세포는 정확하게 타겟팅 할 수 있습니다 (그림 2)와 상해 지역뿐만 아니라 타이밍이 모두 제어 할 수 있습니다. 그 후, 부상 사이트 및 재생 프로세스는 쉽게, 모니터링 기록 (그림 3) 및 (그림 1) 분석됩니다. 레이저 잘 X 축, Y 축에 초점이 맞추어 져 있지만 그러나 그것은 완전히 Z 축에 초점을 맞추고 있지 않습니다. 이 관심의 셀 아래에 이상에 위치한 세포에 손상을 줄 수 있습니다. 그럼에도 불구하고, 이러한 방식은 근육 수리 생체 조사에서의 광대 한 필드를 열어 준다.
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Disclosures
관심 없음 충돌이 선언 없습니다.
Acknowledgments
우리는 기술적 인 도움과 조언을 밥 Nowak (ANDOR 기술)을 감사드립니다. SA-S. 독일 Forschungsgemeinschaft (DFG)의 하이젠 베르크 친목에 의해 지원됩니다. 이 작품은 기금 SE2016/7-1을 DFG의 지원을했습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Heating block | |||
| Pair #5 forceps | Dumont | ||
| Glass slides | Menzel | 76 x 26 mm | |
| Coverslips | Roth | 50 x 24 mm #1 | |
| Petroleum jelly | |||
| Stereomicroscope | Leica | MZFLIII | |
| Micropoint laser | Andor Technology | ||
| Fluorescence microscope | Zeiss | Axioplan II | |
| Metamorph software | Molecular devices | ||
Reagents
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References
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