Summary
Метод, представленный здесь, включает в себя точную травмы живых эмбрионов данио рерио с высокой энергии лазерных импульсов и последующего анализа этих травм и их восстановления с течением времени. Мы также покажем, как генетически помечены одной или группы клеток скелетных мышц могут быть отслежены во время и после лазерного света индуцированных повреждений.
Protocol
1. Маркировка отдельных клеток
Вводят одну клетку эмбриона сцене с плазмидой GFP кодирования или любой GFP-гибридного белка под контролем β-актин промотора. Во время разработки, GFP тогда выражается в виде мозаики моды. Здесь мы использовали трансгенные конструкции Tg [β-актина: α-актинина-GFP], которая ставит α-актинина-гибридного белка GFP под контролем β-актин промотора.
2. Эмбрион внедрения
- Сбор эмбрионов данио рерио и поддерживать при нормальных условиях до 28 HPF (постановка по 12).
- Dechorionate эмбрионов под стереомикроскопа щипцами (Dumont № 5).
- Подготовьте предметное стекло микроскопа с кольцом вазелином.
- Подготовьте 1% низкой температурой плавления агарозы / 10% Tricaine решение с E3 среды: кипятить 100 мг агарозы в 10 мл E3 решением для получения жидкой и однородной решение агарозы; аликвоты и хранитьнеиспользованный раствор агарозы при -20 ° C для дальнейшего использования. Для немедленного использования, пусть вареные решение остыть и сохранить при макс. 39 ° C. Добавить Tricaine раствор для получения конечной концентрации 10% Tricaine. Оба Tricaine и агарозы которые необходимы для предотвращения эмбриональных движений.
- Вставить одного эмбриона в 1% легкоплавкой агарозы / 10% Tricaine / E3 среды в кольцо вазелином, с эмбрионом укладки, естественно, на стороне, аккуратно накрыть покровным только для поддержания эмбриона на месте, и, чтобы избежать выпуклые поверхность, которая нарушит света. В идеале, эмбриональных тканей мышц, которые будут направлены должна касаться покровное.
3. Эмбрион Лазерная ранены
- Подготовка лазерной микроострия и микроскопа:
- Пожалуйста, обратитесь к руководству микроострия лазерных подробные инструкции о том, как настроить и использовать лазер в сочетании с микроскопом.
- Выберите правильныйкраситель для генерации 435 нм лазерный луч длиной волны.
- Регулировка мощности лазера с помощью ослабления слайдер. Мощность лазера должна быть достаточно сильным, чтобы сломать стеклянную поверхность с помощью одного импульса (например, акцент на покровное вашего образца, чтобы проверить это). Это лазерная мощность, необходимая для ячейки абляции.
- Сосредоточьтесь на регион или ячейку интерес помощью сетки установлен в окуляр микроскопа. Используйте 20x цели (40x позволит более точно ущерб, но часто рабочее расстояние не является достаточной для этого объектива).
Примечание 1: лазер не только травмировать клетки в фокальной плоскости, но и клетки сверху и снизу, которые находятся в лазерном пучке. Убедитесь, что перед экспериментом, что лазер оптимально установить и настроить для максимальной фокус в Z-оси. Лучше всего, чтобы определить глубину лазерной травмы до проведения эксперимента для того, чтобы знать, какие клеткиа именно будет ранен.
- Настройте свет, необходимый для визуализации эксперимент: светлое для нормального использования, или флуоресценции если они нацелены на флуоресцентно-меченые клетки.
- Отправить импульсов лазерного излучения в целевом регионе или нескольких импульсов, в зависимости от желаемой степени травмы.
4. Анализ Ранение и восстановление
- При необходимости, процедуру лазерной травмы могут быть записаны вживую (например, с помощью опции поток приобретение программного обеспечения Metamorph) 6.
- Сразу после ранения, эмбрион должен быть удален мягко агарозном пинцетом и помещают обратно в яйцо воду для восстановления.
Примечание 2: мышечная активность (плавание и подергивания) является особенно важным для восстановления скелетных мышц. Так как эмбрион не может двигаться из-за Tricaine экспозиции и жесткой вложения агарозы, это не recommended для поддержания эмбрионов между горкой и покровное слишком долго.
- После выздоровления, эмбрион может быть зафиксирована и проанализирована по желанию световой, флуоресцентной или конфокальной микроскопии, как указано.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Лазерная опосредованной травмы была выполнена на иммобилизованных 1 день-эмбрионов. Как показано на рисунке 1, в нескольких лазерных импульсов можно создать небольшую рану, легко узнаваемый по поврежденным, петельная, актин богатых миофибрилл, что, как правило, натянутой между сомитов границ. Большее количество лазерных импульсов, однако, будет приводить к массовым повреждены сомитов блок, где большинство миофибриллы разрушаются. Тем не менее, мы можем наблюдать буквально, что «время лечит все раны", с небольшими травмами исцеление быстрее, чем крупные. После выздоровления актина окрашивания показывают, что миофибриллы снова охватывают сомитов нормально, однако, дополнительную информацию можно получить путем окрашивания для Xirp1. Белка Xirp1 является хорошим маркером для обнаружения, где травмы и восстановление произошло, как это эктопически локализованы вдоль восстановления миофибрилл в пределах ранее ранены мышечные клетки 6.
Для некоторых целей, важно, чтобы определить, какие клетки exactlУ ранены с лазерным, поэтому она может быть полезной для генетически маркировать некоторые клетки (например, мозаично выражения GFP с метками белков), чтобы быть в состоянии представить себе, какие именно клетки предназначена, а затем оценить, насколько соседние клетки имеют пострадавших, а также с помощью лазерного импульса (рис. 2). После окрашивания травм восстановление и антител, становится возможным найти и проанализировать целевые клетки снова благодаря структуре мозаично меченых клеток, окружающих его.
Один интересный подход для мониторинга регулярно в течение долгого времени, как лазер-опосредованной травмы влияет на сомитной мышцы. Для этого, лазерное повреждение эмбриона иммобилизованных могут быть записаны вживую увидеть немедленный эффект, например, в течение первой минуты (рис. 3). Кроме того, Timelapse записи может быть выполнена с любого желаемого интервала времени (например, 5-минутного интервала), для того, чтобы внимательно следить, как клетки переставитьвокруг раны.
Рисунок 1. Тяжесть повреждений, причиненных может сильно варьироваться, в зависимости от числа лазерных импульсов применяется. Таким образом, восстановление после травм будет продолжаться на разницу шагов, но в конце концов, большинство ран закрыты. Недавно мы показали, что Xirp1 (зеленый) является хорошим маркером для восстановления мышц, так как он усиливает свою активность после травм и локализуется в не-саркомерного актин (красный) поврежденные миофибриллы на 32 HPF 6.
Рисунок 2. Маркированный клетки могут быть специально предназначены (с изменениями из работы 6). CeООО метили мозаики выражение Tg [β-актина: α-актинина-GFP] (зеленый или черно-белый). Одна такая клетка была направлена здесь на 32 HPF и серьезно повреждены несколько лазерных импульсов, как показано красным болт. Белая стрелка указывает потерпевшая клетки; желтые стрелки указывают другие GFP-меченых клеток. Фото справа было принято после восстановления и окрашивание антител той же раны.
Рисунок 3. Онлайн приобретение поток травмы лазерным показывает, как травма влияет на весь блок сомитов. Монтаж одного изображения, записанные на Axioplan в режиме реального времени поток (то есть около 16 кадров / сек) с ДВС. Черная стрелка указывает, где лазер попадает в сомитной мышцы на 28 HPF. Красные стрелки указывают на втягивание концы поврежденногомиофибриллы. Эти динамические изменения в течение одного сомитов блока произошло в течение 2,5 сек.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Лазерная опосредованной травмы является мощным методом для нанесения ран желаемый размер разрушающимся клеток для изучения регенерации в контролируемых условиях у рыбок данио эмбрионов. Примечательно, что клетки могут быть нацелены именно (рис. 2), и оба травм области, а также сроки можно управлять. Впоследствии, на сайте травмы и процессы регенерации легко контролируются, записанных (рис. 3) и проанализированы (рис. 1). Однако, несмотря на лазерном хорошо сосредоточены в X-и Y-ось, она не полностью сосредоточены в Z-оси. Это может привести к повреждению клеток, расположенных под или над клетками интерес. Тем не менее, такой подход открывает огромное поле исследований в естественных условиях мышечной ремонт.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Мы благодарим Боб Новак (Андор технологии) за техническую помощь и советы. SA-S. поддерживается Гейзенберга общение Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG). Эта работа была поддержана грантом DFG SE2016/7-1.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Heating block | |||
| Pair #5 forceps | Dumont | ||
| Glass slides | Menzel | 76 x 26 mm | |
| Coverslips | Roth | 50 x 24 mm #1 | |
| Petroleum jelly | |||
| Stereomicroscope | Leica | MZFLIII | |
| Micropoint laser | Andor Technology | ||
| Fluorescence microscope | Zeiss | Axioplan II | |
| Metamorph software | Molecular devices | ||
Reagents
|
|||
References
- Charge, S. B., Rudnicki, M. A. Cellular and molecular regulation of muscle regeneration. Physiol. Rev. 84, 209-238 (2004).
- Steffen, L. S. The zebrafish runzel muscular dystrophy is linked to the titin gene. Dev. Biol. 309, 180-192 (2007).
- Bassett, D., Currie, P. D. Identification of a zebrafish model of muscular dystrophy. Clin. Exp. Pharmacol. Physiol. 31, 537-540 (2004).
- Kawahara, G., Serafini, P. R., Myers, J. A., Alexander, M. S., Kunkel, L. M. Characterization of zebrafish dysferlin by morpholino knockdown. Biochem. Biophys. Res. Commun. 413, 358-363 (2011).
- Behra, M., Etard, C., Cousin, X., Strähle, U. The use of zebrafish mutants to identify secondary target effects of acetylcholine esterase inhibitors. Toxicol. Sci. 77, 325-333 (2004).
- Otten, C., et al. Xirp proteins mark injured skeletal muscle in zebrafish. PLoS One. 7, e31041 (2012).
- Roostalu, U., Strähle, U. In vivo imaging of molecular interactions at damaged sarcolemma. Dev. Cell. 22, 515-529 (2012).
- Stickney, H. L., Barresi, M. J., Devoto, S. H. Somite development in zebrafish. Dev. Dyn. 219, 287-303 (2000).
- Stellabotte, F., Dobbs-McAuliffe, B., Fernandez, D. A., Feng, X., Devoto, S. H. Dynamic somite cell rearrangements lead to distinct waves of myotome growth. Development. 134, 1253-1257 (2007).
- Choi, W. Y., Poss, K. D. Cardiac regeneration. Curr. Top. Dev. Biol. 100, 319-344 (2012).
- Stewart, S., Stankunas, K. Limited dedifferentiation provides replacement tissue during zebrafish fin regeneration. Dev. Biol. 365, 339-349 (2012).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev. Dyn. , 203-253 (1995).
