Summary
Växtviral nanopartiklar (VNPs) är lovande plattformar för tillämpningar inom biomedicin. Här beskriver vi förfaranden för växt VNP förökning, rening, karakterisering och biokonjugering. Slutligen visar vi att tillämpa VNPs för tumör målsökande och avbildning med en modell mus xenotransplantat och fluorescens avbildning.
Abstract
Användningen av nanomaterial har potential att revolutionera materialvetenskap och medicin. För närvarande är ett antal olika nanopartiklar utreds för applikationer inom diagnostik och behandling. Virala nanopartiklar (VNPs) från växter kan betraktas som själv-monterade bionanomaterials med definierade storlekar och former. Växtvirus undersökta i Steinmetz labbet inkluderar ikosaedriska partiklar bildade av Cowpea mosaikvirus (CPMV) och Brome mosaikvirus (BMV), som båda är 30 nm i diameter. Vi utvecklar också stavformade och fintrådiga strukturer som härrör från följande växtvirus: Tobak (TMV), som utgör styva stavar med måtten 300 nm med 18 nm och potatis-virus X (PVX), som bildar filamentösa partiklar 515 nm i längd och 13 nm i bredd (hänvisas läsaren till ref. 1 och 2 för ytterligare information om VNPs).
i planta, är exceptionellt stabila och biokompatibla. Även VNPs är "programmerbara" enheter, som kan utvecklats särskilt med genetisk modifiering eller kemiska biokonjugering 3. Strukturen för VNPs är känt för atomär upplösning och modifieringar kan utföras med rumslig precision på atomär nivå 4, en nivå av kontroll som inte kan uppnås med syntetiska nanomaterial med nuvarande state-of-the-art-teknik.
I detta dokument beskriver vi spridning av CPMV, PVX, TMV och BMV i Vigna ungiuculata och Nicotiana benthamiana växter. Extraktion och rening protokoll för varje VNP ges. Metoder för karakterisering av renade och kemiskt märkta VNPs beskrivs. I denna studie fokuserar vi på chemical märkning av VNPs med fluoroforer (t.ex. Alexa Fluor 647) och polyetylenglykol (PEG). Färgämnena underlättar spårning och detektering av VNPs 5-10, och PEG minskar immunogeniciteten av proteinhaltiga nanopartiklar och samtidigt förbättra sina farmakokinetik 8,11. Vi visar tumör homing av PEGylerade VNPs med hjälp av en musmodell xenograft tumör. En kombination av fluorescens avbildning av vävnader ex vivo med användning av Maestro Imaging System, fluorescens kvantifiering homogeniserade vävnader, och konfokal mikroskopi används för att studera biodistribution. VNPs rensas via det retikuloendoteliala systemet (RES); tumör målsökande uppnås passivt genom den förbättrade permeabiliteten och behålla (EPR) effekt 12. Den VNP nanoteknik är en kraftfull plug-and-play-teknik för att bild och behandla områden av sjukdom in vivo. Vi vidareutvecklar VNPs att bära narkotika last och kliniskt relevanta grupperingar avbildning samt vävnadsspecifika ligander tillrikta molekylära receptorer överuttryckta i cancer och hjärt-kärlsjukdomar.
Protocol
1. SRb (CPMV, BMV, PVX och TMV) förökning
- Ställ inomhus anläggning kammaren kontroller till 15 timmar på dagen (100% ljus, 25 ° C, 65% luftfuktighet) och 9 timmar av natten (0% ljus, 22 ° C, 60% luftfuktighet).
- Inokulera växter enligt tidslinjen i tabell 1.
| CPMV | PVX, TMV, och BMV |
| Dag 0: Plantera 3 cowpea frön / kruka. | Dag 0: Plantera ~ 30 N. benthamiana frön / kruka. Gödsla en gång i veckan med 1 matsked gödselmedel / 5 L vatten. |
| Dag 14: Re-pot N. benthamiana vid 1 anläggning / kruka. | |
| Dag 10: Infect blad primära blad med CPMV (5 μg/50 ul / löv) genom mekanisk inokulering med en lätt damning av karborundum. | Dag 28: Infect tre till fIve blad med PVX, TMV eller BMV (5 μg/50 ul / löv) genom mekanisk inokulering med en lätt damning av karborundum. |
| Dag 20: Harvest blad och förvara i -80 ° C. | Dag 42: Harvest blad och förvara i -80 ° C. |
Tabell 1. Tidslinje för odling, infektera, och skörda blad.
Obs: Endast CPMV utbredning visas som ett exempel.
2. SRb (CPMV, BMV, PVX och TMV) Rening
Obs: Alla steg utförs på is eller vid 4 ° C.
- Homogenisera 100 g frysta blad i en vanlig bländare med 2 volymer kall buffert (se tabell 2). Filtrera genom 2-3 skikt av ostduk.
- För PVX, justera pH till 6,5 med användning av 1 M HCl. Tillsätt 0,2% (vikt / volym) askorbinsyra och 0,2% (vikt / volym) natrium sulfite.
- Centrifugera homogenat rå anläggningen vid 5.500 xg under 20 minuter. Supernatanten.
- För BMV, skikt 25 ml supematant över 5 ml 10% (vikt / volym) sackaroslösning. Centrifugera vid 9.000 xg under 3 tim och återsuspendera pellets i 38,5% CsCl-lösning (vikt / volym). Blanda genom att skaka i 5 h och sedan fortsätta med steg 2,12.
- Extrahera växtmaterial genom att tillsätta 0,7 volymer av 1:1 (volym / volym) kloroform :1-butanol. Rör blandningen under 30-60 min.
- Centrifugera lösningen vid 5.500 xg under 20 minuter. Samla den övre vattenfasen.
- Lägg NaCl till 0,2 M och 8% (vikt / volym) PEG (molekylvikt 8.000). För TMV, också lägga 1% (volym / volym) Triton X-100. Rör om i minst 1 timme, låt stå under minst 1 timme.
- Centrifugera lösningen vid 15.000 xg under 15 minuter. Återsuspendera pelleten i 10 ml buffert. För PVX, tillsätt 0,1% β-merkaptoetanol och urea till 0,5 M.
- Centrifugera vid 8.000 xg i 30 min och supernatanten.
- Ultracentrifug supernatanten vid 160.000 xg under 3 timmar. Återsuspendera pelleten i 5 ml buffert Overnight.
- Bered en 10-40% sackarosgradient användning av lika volymer av 10%, 20%, 30%, och 40% sackaros i buffert (tyngsta först). Låt gradienten ekvilibrera över natten vid rumstemperatur.
- Ultracentrifug återsuspenderas pellets över sackarosgradient vid 100.000 xg under 2 timmar (24 timmar för BMV).
- Samla ljusspridande band och dialysera mot buffert.
- Karakterisera VNPs (nedan) och förvara vid 4 ° C. För långtidsförvaring, förvara vid -80 ° C.
| CPMV och TMV | 0,1 M kaliumfosfatbuffert (pH 7,0) 38,5 mM KH 2 PO 4 61,5 mM K 2 HPO 4 |
| PVX | 0,5 M boratbuffert (pH 7,8) 0,5 M borsyra Justera pH-värdet med NaOH |
| BMV | SAMA buffert (pH 4,5) 250 mM natriumacetat 10 mM MgClj 2 2 mM β-merkaptoetanol (tillsätt färsk) |
Tabell 2. Buffertar och deras recept för varje VNP.
Obs: Endast CPMV utbredning visas som ett exempel.
3. SRb (CPMV, BMV, PVX och TMV) Karakterisering
- Utför UV / synligt spektroskopi för att bestämma koncentrationen av VNPs.
- Mät absorbansen hos 2 il prov med användning av en spektrofotometer NanoDrop.
- Bestäm koncentrationen av partiklar och färgämnen använder Beer-Lambert lagen (A = εcl, där A är absorbansen, ε är extinktionskoefficienten, c är koncentrationen, och L är våglängden). Den ljuspassagelängden 0,1 cm för NanoDrop.
De VNP-specifika extinktionskoefficienter är:
CPMV: 8,1 cm -1 -1 mg ml (vid 260 nm)
PVX: 2,97 cm -1 -1 mg ml (vid 260 nm)
TMV: 3,0 cm -1 -1 mg ml (vid 260 nm)
BMV: 5,15 cm -1 -1 mg ml (vid 260 nm)
- Analysera partiklar genom size exclusion snabb protein vätskekromatografi (FPLC).
- Användning av en Superose 6 size exclusion-kolonn och ÄKTA Explorer belastning 50-100 pg VNPs i 200 pl 0,1 M kaliumfosfatbuffert (pH 7,0).
- Ställ detektorer till 260 nm (nukleinsyra), 280 nm (protein), och excitationsvåglängden hos alla bifogade färgämnen.
- Kördes vid en flödeshastighet av 0,5 ml / min under 72 minuter.
- Elueringsprofilen och A260: A280 nm visar om VNP preparatet är ren och om partiklarna är intakta och monteras.
Följande A260: 280 förhållanden indikerar en ren VNP beredning:
CPMV: 1,8 ± 0,1
PVX: 1,2 ± 0,1
TMV:1,1 ± 0,1
BMV: 1,7 ± 0,1
- Utför denaturerande (förgjutna NuPAGE) Bis-Tris polyakrylamid 4-12% gradientgelelektrofores att analysera renheten i sina förberedelser och konjugering till enskilda höljesproteiner.
- Tillsätt 3 ml 4x LDS provbuffert till 10 pg av partiklarna i 9 il kaliumfosfatbuffert. Tillsätt ytterligare 1 pl 4x LDS provbuffert och 3 pl av β-merkaptoetanol för att BMV att minska det höga antalet disulfidbindningar.
- Inkubera i värmeblock under 5 min vid 100 ° C.
- Fyll prover på en SDS-gel.
- Köra prover vid 200 V under 1 timme i 1x MOPS löpbufferten.
- Dokumentera gelen under UV-ljus för att synliggöra fluorescerande höljeproteiner.
- För icke-fluorescerande protein, färgas med Coomassie-blått (0,25% (vikt / volym) Coomassie Brilliant Blue R-250, 30% (volym / volym) metanol, 10% (volym / volym) ättiksyra) under 1 timme.
- Avfärga med 30% metanol, 10% ättiksyra över natten. ChanGE lösningen om så erfordras.
- Dokumentera gelén under vitt ljus.
- Analysera integriteten av partiklar genom transmissionselektronmikroskopi (TEM).
- Späd prover till 0,1-1 mg / ml i 20 pl avjoniserat vatten.
- Placera 20 | il droppar av proverna på parafilm.
- Täck droppar med TEM-galler och låt sitta i 2 minuter. Veke av överskott lösningen på gallret med filterpapper.
- Tvätta nätet genom att placera en droppe avjonat vatten och sedan suga torr.
- Stain rutnät genom att placera på en 20 | il droppe av 2% (vikt / volym) uranylacetat under 2 min. Wick bort överskottet fläcken med filterpapper.
- Tvätta nätet en gång i vatten.
- Observera nät enligt ett transmissionselektronmikroskop.
4. Kemisk Konjugering av VNPs med PEG och fluoroforer, rening och karakterisering
- För beräkningar för reaktionerna nedan, den molära massan av VNPs är:
CPMV: 5,6x 10 6 g / mol
PVX: 35 x 10 6 g / mol
TMV: 41 x 10 6 g / mol
BMV: 4,6 x 10 6 g / mol - Konjugat färgämnen och PEG till ytan lysiner i CPMV och PVX med en enstegs-N-hydroxisuccinimid kopplingsreaktion: Lägg 2.500 molekvivalenter (alla molära överskott avser molärt överskott per SRb) av Alexa Fluor 647 succinimidylester och 4.500 ekvivalenter NHS- PEG (molekylvikt 5.000) upplöstes i DMSO till CPMV i 0,1 M kaliumfosfatbuffert. När du arbetar med PVX, lägg till en 10.000 molöverskott av NHS-dye och NHS-PEG. Justera buffert och DMSO volymer så att den slutliga koncentrationen av CPMV och PVX är 2 mg / ml och DMSO innehållet är 10% av den totala reaktionsvolymen. Inkubera reaktionsblandningen över natten vid rumstemperatur skyddad från ljus. CPMV och PVX har 300 och 1.270 adresserbara lysiner, respektive. (Läsaren hänvisas till följande referenser för vidare läsning omkemisk modifiering av CPMV och PVX: 13-15).
- Conjugate färgämnen och PEG till tyrosiner i TMV by diazonium koppling följt av koppar (I)-katalyserad azid-alkyn cykloaddition.
- Förbered diazoniumsalt (alkyn) genom att blanda 400 pl 0,3 M p-toluensulfonsyramonohydrat, 25 | il 3,0 M natriumnitrit, och 75 | il av 0,68 M destillerad 3-etynylanilin upplöst i acetonitril vid 4 ° C under 1 timme.
- Lägg 3,3 ml boratbuffert, pH 8,8, innehållande 100 mM NaCl till 1,25 ml av TMV (20 mg / ml stamlösning).
- Reagera TMV med 450 pl av diazoniumsaltet (alkyn) lösning i ett isbad under 3 h för att lägga till en alkyn ligering handtag att TMV genom diazo-koppling. Lösningen kommer att förvandlas till en Ijusbrun färg. TMV har 2.140 tillgängliga tyrosiner för konjugering.
- Rena den slutliga produkten med en sackaros-kudde såsom beskrivs i steg 4,4.
- Fäst azid-funktionell Alexa Fluor 647 och PEG-azid (MW 5.000) using koppar (I)-katalyserad azid-alkyn cykloaddition (CuAAC). Tillsätt 2 ekvivalenter färgämne-och PEG-azid per höljesprotein och inkubera med 1 mM CuSO 4, 2 mM AMG, och 2 mM natriumaskorbat vid rumstemperatur under 15 minuter. Justera volymen buffert så att den slutliga reaktionen koncentrationen av TMV är 2 mg / ml. (Läsaren hänvisas till följande referenser för vidare läsning om kemisk modifiering av TMV: 16,17).
- Konjugat färgämnen till lysiner och PEG till cysteiner av BMV Cysteinmutant (cBMV):
- Lägg 2.000 molära ekvivalenter av Oregon Green 488 succinimidylester löst i DMSO till cBMV i 0,1 M tonkm buffert (50 mM Tris-bas, 50 mM NaCl, 10 mM KCI, 5 mM MgClj 2, pH 7,4). Justera buffert och DMSO volymer så att den slutliga koncentrationen av BMV är 1 mg / ml och DMSO innehållet är 10% av den totala reaktionsvolymen. Inkubera reaktionsblandningen över natten vid 4 ° C, skyddat från ljus.
- Renodla partiklar med centrifufugal filter som beskrivs i steg 4,4.
- Lägg 2.000 molärt överskott av PEG-maleimid (MW 2.000) med användning av samma reaktionsbetingelser som tidigare och inkubera reaktionsblandningen under 2 h vid 4 ° C. cBMV har 180 reaktiva lysiner och cysteiner. (Läsaren hänvisas till följande referenser för vidare läsning om kemisk modifiering av BMV: 18).
- Rening: Passera lösningen genom en 40% (vikt / volym) sukroskudde vid 160.000 xg under 2,5 timmar. Återupplösa pelleten i buffert. Alternativt dialysera mot lämplig buffert med 10 kDa cut-off spin filter.
- Karaktärisering: PEGylerade och fluorescensmärkt VNPs analyseras med användning av ovan beskrivna metoder: UV / synlig spektroskopi, SDS-gelelektrofores, FPLC, och TEM (ej visad, men se fig. 6 och 7).
5. Tumörmålsökning och avbildning med en modell mus xenograft
- Kultur HT-29 human koloncancer-celler i RPMI-medium kompletterat med 5% FBS, 1% penicillin-streptomycin och 1% L-glutamin vid 37 ° C i 5% CO 2 med användning 175 cm 2 cellodlingsflaskor.
- Tvätta cellerna två gånger med steril PBS och skörd genom inkubering med 5 ml trypsin-EDTA vid 37 ° C under 5 minuter. Inaktivera trypsinet med 5 ml RPMI-medium. Samla cellerna genom centrifugering vid 500 xg under 5 minuter. vid 4 ° C och återsuspendera i färskt RPMI vid 5x10 celler/50 6 il medium (bestämma totala cellantalet med trypanblått och en hemocytometer). Blanda med en lika stor volym av Matrigel före injektion (hålla alla lösningar och reagens steril).
- Upphandlar sex veckor gamla NCR nu / nu möss och behålla dem på en alfalfa fri kost i 2 veckor. [Anmärkning:. Samtliga djurförsök måste IACUC godkänd] Framkalla tumörxenografter genom subkutan injektion av 5x10 6 celler/100 ul / tumör i flankerna (2 tumörer / mus) med hjälp av en 18 1/2 gauge sterilnål. Övervaka djuren regelbundet. Mät tumörstorlek med skjutmått och låta tumörerna att växa till en genomsnittlig volym av 20 mm 3 (inom de närmaste 12 dagarna). Tilldela möss till två olika grupper slumpmässigt: PBS och VNP (n = 3 djur / grupp / tidpunkt). Med användning av en 1 ml 28 gauge spruta, administrera genom intravenös injektion i svansvenen 100 pl sterilt PBS eller 10 mg / kg VNP formulering.
Obs: Vävnadsodlingsplattor experiment och studier med levande djur kommer inte att visas. Hands-on demonstration kommer att begränsas till vävnad bearbetning och datainsamling. För en referens på HT-29 tumör xenotransplantatmodell, hänvisas till ref. 19
Tre tekniker används för att utvärdera tumör homing av VNPs:
- Fluorescens avbildning med Maestro Imaging System: Sacrifice möss vid olika tidpunkter (2, 24, och 72 timmar) med CO 2gas. Dissekera djur och punktskatter alla större organ (hjärna, hjärta, lungor, mjälte, njurar och lever) tillsammans med tumörerna på flankerna, placera vävnaderna på parafilm och analysera med fluorescens avbildning instrument med gul excitation och filter utsläpp (800 ms exponering) för att detektera närvaron av fluorescerande signaler i vävnaderna (härrörande från A647 konjugerad till VNPs). Spara bilderna och analysera fluorescensintensiteter med ImageJ 1.44o programvara ( http://imagej.nih.gov/ij ). Jämför mönstret upptaget av VNPs i tumörer med andra viktiga vävnader med tiden.
- Efter avbildning, skär varje vävnad i halv och bädda en halv i oktober förening för kryo-snittning och konfokala analys. Samla den andra hälften i förvägda Cryo-flaskor och omedelbart frysa dem med flytande N 2. Lagra vid -80 ° C tills redo för ytterligare bearbetning.
- Fluorescens kvantifiering: Record vävnader vikter. Tina frysta vävnader vid rumstemperatur och placera dem i separata 50 ml Falcon-rör innehållande 1 ml PBS. Med hjälp av en handhållen vävnadshomogenisator, homogenisera vävnaderna för 2-3 minuter i PBS och sedan överföra homogenatet till mikrofugrör. Centrifugera homogenaten under 10 min vid 13.000 xg för att avlägsna icke-homogeniserad vävnad.
- Pipettera 100 | il av supernatanten från vävnaderna från varje grupp (PBS och VNP formuleringar / poäng tid) till en 384 väl svart UV-platta. Utvärdera fluorescensintensitet (EX / Em våglängderna 600/665) med en plattläsare. Normalisera de erhållna fluorescerande värdena av vävnad vikter.
- Immunohistokemi: Förbered kryo-mikrotomen sektioner (10 um) och förvara vid -20 ° C. Stain vävnadssnitt för cellkärnor (DAPI) och endotelial cellmarkör (FITC-märkt anti-mus-CD31-antikropp). Utför konfokalmikroskopi analys för att kartlägga det vaskulära och intratumoral lokalisering av fluorescensmärkt VNPs..
Obs: Denna procedur kommer inte att visas, är representativa uppgifter som visas i figur 8. För hänvisning när immunohistokemi och de beskrivna metoderna färgning hänvisas till ref. 19
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Detta protokoll ger en strategi för kemisk modifiering av VNPs och deras tillämpningar för in vivo tumöravbildning. Djuret fluorescens avbildning, fluorescens kvantifiering och immunohistokemi tekniker som presenteras här är användbara för att studera biodistribution och utvärdera tumör homing. Dessa tekniker ger värdefull information om tillgång av nanopartiklar till tumören via EPR effekten. Genom att kombinera resultaten från de olika analysmetoder, får vi en kraftfull metod för att utvärdera lokalisering och biodistributionen av VNPs.
Innan dessa studier kan utföras är emellertid nödvändigt att erhålla en ren virusberedning. Bortsett från mekanisk ympning, är ett möjligt alternativ för VNP förökning agroinfiltration, vilket kan ha en hög omvandling och ackumulering takt. När förökningsmaterial av VNPs, bör man hålla växter infekterade med olika virus separat som to undvika korskontaminering. I synnerhet, är TMV lätt sprids och överförs mekaniskt. En annan avgörande steg att vara uppmärksam på utför virus rening på is eller vid 4 ° C. Alla buffertar ska användas iskall. Den lägre temperaturen är nödvändig för att förhindra skador på VNPs följd av proteaser och oxiderande enzymer närvarande i växtmaterialet.
Låga utbyten av renade VNPs kan uppstå från flera faktorer. En möjlig orsak kan vara ålder VNPs används för förökning. Det är föredraget att använda nyare virusberedningar. Till exempel, de C-terminala 24 aminosyrorna av S-höljesproteinet av CPMV är nödvändiga för undertryckande av geners. Deletion av denna yta-exponerade området sker över tiden på grund av proteolys. Även om strukturen och stabiliteten av CPMV inte påverkas, tillväxthämning och fördröjd spridning av viruset resultaten. En annan källa till låg avkastning är förlust av VNPs under rening. Särskilt påmärksamhet bör ges på resuspension steget efter PEG-fällning. Ofullständig återsuspension av pelleten skulle resultera i SRb förlorade i pelleten av det efterföljande centrifugeringssteget.
Totalt sett biokonjugering kemiska presenteras här är enkel. 14,17,18,21 De karakterisering beskrivna metoderna är värdefulla för att säkerställa partikel integritet och bestämma omfattningen av konjugering. Molära överskott kan justeras beroende på tillämpningen och graden av funktionalisering önskas.
När du arbetar med musen xenotransplantatmodell, är den viktigaste praxis efter aseptisk teknik. Dessutom är svansveninjektion ett kritiskt steg för att säkerställa en enhetlig dos prov för varje mus. Det kan hjälpa till att placera svansen i varmt vatten i förväg för att dilatera venen. En annan faktor är autofluorescens för fluorescens avbildning och mätning. Generellt är vävnad autofluorescens minimized efter 600 nm, vilket gör långa våglängder färgämnen med emissionsmaxima över 600 nm optimala som avbildningssonden. Emellertid normala mus diet består av klorofyll-innehållande alfalfa, som också fluorescerar rött. Som ett resultat, är det nödvändigt att behålla de möss på ett alfalfa diet under minst 2 veckor för att reducera bakgrundssignaler. Slutligen bör det noteras att fluorescensdetektering använder fluorescensavbildning är begränsad på grund av skillnader i spridningen och absorptionen miljöerna i olika vävnader. Följaktligen avbildning används för visualisering och som ett första metod för övervakning biodistribution, medan kvantifiering utförs med användning vävnadshomogenat.
Några fördelar med att använda VNPs som plattform tekniken är deras monodispersitet, biokompatibilitet, kapacitet för uppskalning produktion och mottaglighet för flera funktionalisering strategier. Förutom kemiteknik, är genteknik illustreras här med införandetning av cysteiner att BMV som ett mål för biokonjugering. Genetisk ingenjörskonst skulle också kunna användas för att införa målsökande peptider eller taggar affinitet. Medan protokollet som beskrivs använder dubbla märkta (färgämne och PEG) partiklar, pågående studier tittar på införliva ytterligare funktioner (dvs. läkemedel och inriktning) för att öka vävnadsspecificitet och terapeutisk effekt. Således fastställs i denna strategi grunden för framtida biomedicinska tillämpningar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av NIH / NIBIB bidrag R00 EB009105 (till NFS) och P30 EB011317 (till NFS), en NIH / NIBIB utbildningsstipendium T32 EB007509 (till AMW), en Case Western Reserve University Interdisciplinary Alliance investeringsbidrag (till NFS), och ett fall Comprehensive Cancer Center bidrag P30 CA043703 (till NFS). Vi tackar Steinmetz Lab doktorand forskare för deras praktiska stöd: Nadia Ayat, Kevin Chen, Sourav (Sid) Dey, Alice Yang, Sam Alexander, Craig D'Cruz, Stephen Hern, Lauren Randolph, Brian Så och Paul Chariou .
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| VNP production | |||
| Indoor plant chamber | Percival Scientific | E-41L2 | |
| V. unguiculata seeds (California black-eye no. 5) | Burpee | 51771A | |
| N. benthamiana seeds | N. benthamiana seeds were a gift from Salk Institute. Seeds are produced through plant propagation. | ||
| Carborundum | Fisher | C192-500 | |
| Pro-mix BX potting soil | Premier Horticulture | 713400 | |
| Jack's Professional 20-10-20 Peat-Lite Fertilizer | JR Peters | 77860 | |
| Equipment | |||
| 50.2 Ti rotor | Beckman | 337901 | |
| SW 32 Ti rotor | Beckman | 369694 | |
| Optima L-90K ultracentrifuge | Beckman | 365672 | |
| SLA-3000 rotor | Thermo Scientific | 07149 | |
| SS-34 rotor | Thermo Scientific | 28020 | |
| Sorvall RC-6 Plus centrifuge | Thermo Scientific | 46910 | |
| Polypropylene bottle | Beckman | 355607 | For SLA-3000 rotor |
| Polycarbonate bottle | Beckman | 357002 | For SS-34 rotor |
| Ultra-Clear tube | Beckman | 344058 | For sucrose gradient and SW 32 Ti rotor |
| Polycarbonate bottle | Beckman | 355618 | For pelleting and 50.2 Ti rotor |
| NanoDrop spectrophotometer | Thermo Scientific | NanoDrop2000c | |
| PowerEase 500 pre-cast gel system | Invitrogen | EI8675EU | |
| Superose 6 10/300 GL (24 ml) size-exclusion column | GE Healthcare | 17-5172-01 | |
| ÄKTA Explorer 100 Chromatograph | GE Healthcare | 28-4062-66 | |
| Allegra X-12R | Beckman | 392302 | Benchtop centrifuge |
| Cryostat | Leica | CM1850 | |
| Maestro 2 | Caliper Life Sciences | In vivo imaging system | |
| Tissue-Tearor | Biospec Products | 985370-395 | |
| Microplate reader | Tecan | Infinite-200 | |
| Transmission electron microscope | ZEISS | Libra 200FE | |
| FluoView laser scanning confocal microscope | Olympus | FV1000 | |
| Chemicals and Reagents | |||
| 3-ethynylaniline | Sigma Aldrich | 498289-5G | |
| 384 well black plate | BD Biosciences | 353285 | |
| 4-12% Bis-Tris NuPAGE SDS gel | Invitrogen | NP0321BOX | |
| 4X LDS sample buffer | Invitrogen | NP0008 | |
| Acetic Acid | Fisher | A385-500 | |
| Acetonitrile | Sigma Aldrich | 271004-1L | |
| Alexa Fluor 647 azide | Invitrogen | A10277 | |
| Alexa Fluor 647 carboxylic acid, succinimidyl ester | Invitrogen | A20006 | |
| Amicon Ultra-0.5 ml Centrifugal Filters | Millipore | UFC501096 | 10 kDa cut-off |
| Aminoguanidine hydrochloride | Acros Organics | 36891-0250 | |
| Boric acid | Fisher | A74-500 | |
| Coomassie Brilliant Blue R-250 | Fisher | BP101-25 | |
| CsCl | Acros Organics | 42285-1000 | |
| DAPI | MP Biomedicals | 157574 | |
| Dimethyl sulfoxide | Fisher | BP231-100 | |
| Filter paper | Fisher | 09-801K | P5 grade |
| FITC anti-mouse CD31 | BioLegend | 102406 | |
| Goat serum | Invitrogen | 16210-064 | |
| KCl | Fisher | BP366-500 | |
| L-ascorbic acid sodium salt | Acros Organics | 35268-0050 | |
| Methanol | Fisher | A412P-4 | |
| MgCl2 | Fisher | BP214-500 | |
| Microscope slides | Fisher | 12-544-3 | |
| Microscope cover glass | VWR | 48366-277 | |
| MOPS buffer | Invitrogen | NP0001 | |
| mPEG-mal | Nanocs | PG1-ML-2k | MW 2000 |
| mPEG-N3 | Nanocs | PG1-AZ-5k | MW 5000 |
| mPEG-NHS | Nanocs | PG1-SC-5k | MW 5000 |
| NaCl | Fisher | BP358-212 | |
| Oregon Green 488 succinimidyl ester *6-isomer* | Invitrogen | O-6149 | |
| p-toluenesulfonic acid monohydrate | Acros Organics | 13902-0050 | |
| Permount | Fisher | SP15-100 | |
| Potassium phosphate dibasic | Fisher | BP363-1 | |
| Potassium phosphate monobasic | Fisher | BP362-1 | |
| Sodium acetate | Fisher | BP333-500 | |
| Sodium nitrite | Acros Organics | 42435-0050 | |
| Sodium sulfite | Amresco | 0628-500G | |
| Sucrose | Fisher | S6-500 | |
| TEM grid | Ted Pella | FCF-400Cu | |
| Tris base | Fisher | BP152-500 | |
| Triton X-100 | EMD Chemicals | TX1568-1 | |
| β-mercapt–thanol | Fisher | O3446I-100 | |
| Tissue Culture | |||
| Fetal bovine serum | Invitrogen | 12483-020 | |
| Hemocytometer | Fisher | 0267110 | |
| HT-29 cells | ATCC | HTB-38 | |
| L-glutamine | Invitrogen | 25030-080 | |
| PBS | Cellgro | 21-040-CV | |
| Penicillin-streptomycin | Invitrogen | 10378-016 | |
| RPMI-1640 | Invitrogen | 31800-089 | |
| Tissue culture flasks | Corning | 431080 | 175 cm2 |
| Trypan Blue | Thermo Scientific | SV30084.01 | |
| Trypsin, 0.05% (1X) with EDTA 4Na, liquid | Invitrogen | 25300-054 | |
| Animal Studies | |||
| 18% Protein Rodent Diet | Harlan Teklad | Teklad Global 2018S | Alfalfa free diet |
| Insulin syringe | BD Biosciences | 329410 | 28 gauge |
| Isoflurane | Baxter | AHN3637 | |
| Matrigel Matrix basement membrane | BD Biosciences | 356234 | |
| NCR nu/nu mice | CWRU School of Medicine Athymic Animal and Xenograft Core Facility |
||
| Sterile syringe | BD Biosciences | 305196 | 18 1/2 gauge |
| Tissue-Tek CRYO-OCT Compound | Andwin Scientific | 4583 | |
References
- Description of Plant Viruses [Internet]. , Association of Biologists. Warwick, UK. Available from: http://dpvweb.net/ (2012).
- Carrillo-Tripp, M., Shepherd, C. M., Borelli, I. A., Venkataraman, S., Lander, G., Natarajan, P., Johnson, J. E., Brooks, C. L., Reddy, V. S. VIPERdb2: an enhanced and web API enabled relational database for structural virology. Nucl. Acids Res. 37, 436-442 (2009).
- Pokorski, J. K., Steinmetz, N. F. The art of engineering viral nanoparticles. Mol. Pharm. 8, 29-43 (2011).
- Steinmetz, N. F., Lin, T., Lomonossoff, G. P., Johnson, J. E. Structure-based engineering of an icosahedral virus for nanomedicine and nanotechnology. Curr. Top Microbiol. Immunol. 327, 23-58 (2009).
- Jung, B., Rao, A. L., Anvari, B. Optical Nano-Constructs Composed of Genome-Depleted Brome Mosaic Virus Doped with a Near Infrared Chromophore for Potential Biomedical Applications. ACS Nano. , (2011).
- Leong, H. S., Steinmetz, N. F., Ablack, A., Destito, G., Zijlstra, A., Stuhlmann, H., Manchester, M., Lewis, J. D. Intravital imaging of embryonic and tumor neovasculature using viral nanoparticles. Nat. Protoc. 5, 1406-1417 (2010).
- Leopold, P. L., Ferris, B., Grinberg, I., Worgall, S., Hackett, N. R., Crystal, R. G. Fluorescent virions: dynamic tracking of the pathway of adenoviral gene transfer vectors in living cells. Hum. Gene Ther. 9, 367-378 (1998).
- Lewis, J. D., Destito, G., Zijlstra, A., Gonzalez, M. J., Quigley, J. P., Manchester, M., Stuhlmann, H. Viral nanoparticles as tools for intravital vascular imaging. Nat. Med. 12, 354-360 (2006).
- Steinmetz, N. F., Ablack, A. L., Hickey, J. L., Ablack, J., Manocha, B., Mymryk, J. S., Luyt, L. G., Lewis, J. D. Intravital imaging of human prostate cancer using viral nanoparticles targeted to gastrin-releasing Peptide receptors. Small. 7, 1664-1672 (2011).
- Wu, C., Barnhill, H., Liang, X., Wang, Q., Jiang, H. A new probe using hybrid virus-dye nanoparticles for near-infrared fluorescence tomography. Optics Communications. 255, 366-374 (2005).
- Steinmetz, N. F., Cho, C. F., Ablack, A., Lewis, J. D., Manchester, M. Cowpea mosaic virus nanoparticles target surface vimentin on cancer cells. Nanomedicine (Lond). 6, 351-364 (2011).
- Maeda, H., Wu, J., Sawa, T., Matsumura, Y., Hori, K. Tumor vascular permeability and the EPR effect in macromolecular therapeutics: a review. Journal of Controlled Release. 65, 271-284 (2000).
- Chatterji, A., Ochoa, W., Paine, M., Ratna, B. R., Johnson, J. E., Lin, T. New addresses on an addressable virus nanoblock: uniquely reactive Lys residues on cowpea mosaic virus. Chem. Biol. 11, 855-863 (2004).
- Steinmetz, N. F., Mertens, M. E., Taurog, R. E., Johnson, J. E., Commandeur, U., Fischer, R., Manchester, M. Potato virus X as a novel platform for potential biomedical applications. Nano Lett. 10, 305-312 (2010).
- Wang, Q., Lin, T., Tang, L., Johnson, J. E., Finn, M. G. Icosahedral virus particles as addressable nanoscale building blocks. Angew. Chem. Int. Ed. 41, 459-462 (2002).
- Bruckman, M. A., Kaur, G., Lee, L. A., Xie, F., Sepulveda, J., Breitenkamp, R., Zhang, X., Joralemon, M., Russell, T. P., Emrick, T., Wang, Q. Surface modification of tobacco mosaic virus with "click" chemistry. Chembiochem. 9, 519-523 (2008).
- Schlick, T. L., Ding, Z., Kovacs, E. W., Francis, M. B. Dual-surface modification of the tobacco mosaic virus. J. Am. Chem. Soc. 127, 3718-3723 (2005).
- Yildiz, I., Tsvetkova, I., Wen, A. M., Shukla, S., Masarapu, M. H., Dragnea, B., Steinmetz, N. F. Engineering of Brome mosaic virus for biomedical applications. RSC Advances. , (2012).
- Brunel, F. M., Lewis, J. D., Destito, G., Steinmetz, N. F., Manchester, M., Stuhlmann, H., Dawson, P. E. Hydrazone ligation strategy to assemble multifunctional viral nanoparticles for cell imaging and tumor targeting. Nano Lett. 10, 1093-1097 (2010).
- Shukla, S., Ablack, A., Wen, A., Lee, K., Lewis, J., Steinmetz, N. F. Increased tumor homing and tissue penetration of the filamentous plant viral nanoparticle Potato virus X. Molecular Pharmaceutics. , (2012).
- Chatterji, A., Ochoa, W., Shamieh, L., Salakian, S. P., Wong, S. M., Clinton, G., Ghosh, P., Lin, T., Johnson, J. E. Chemical conjugation of heterologous proteins on the surface of Cowpea mosaic virus. Bioconjug. Chem. 15, 807-813 (2004).
