Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Bioengineering

Virale nanopartikels voor doi: 10.3791/4352 Published: November 16, 2012

Summary

Plant virale nanodeeltjes (VNPs) zijn veelbelovend platform voor toepassingen in de medische biologie. Hier beschrijven we de procedures voor plantaardige VNP vermeerdering, zuivering, karakterisering, en bioconjugatie. Ten slotte tonen we de toepassing van VNPs voor tumor homing en beeldvorming met behulp van een muis xenograft model en fluorescentie beeldvorming.

Abstract

Het gebruik van nanomaterialen heeft de potentie om materialen wetenschap en geneeskunde een revolutie. Momenteel worden verschillende nanodeeltjes onderzocht voor toepassing in beeldvorming en therapie. Virale nanodeeltjes (VNPs) afgeleid van planten kan worden beschouwd als zelf-geassembleerde bionanomaterials met verschillende grootten en vormen. Plantenvirussen onderzochte in de Steinmetz lab zijn icosahedrale deeltjes gevormd door Cowpea mosaic virus (CPMV) en Brome mosaic virus (BMV), die beide 30 nm in diameter. We ontwikkelen ook staafvormig en filamenteuze structuren afgeleid van de volgende plantenvirussen: Tobacco mosaic virus (TMV), die stijve staven vormen met afmetingen van 300 nm met 18 nm en aardappelvirus X (PVX) die draadvormige deeltjes vormen 515 nm lang en 13 nm breed (wordt verwezen naar refs. 1 en 2 voor meer informatie over VNPs).

in planta, zijn uitzonderlijk stabiel en biocompatibel zijn. Ook VNPs zijn "geprogrammeerd" eenheden, die specifiek kunnen worden gemanipuleerd met behulp van genetische modificatie of chemische methoden bioconjugatie 3. De structuur van VNPs is bekend dat atomaire resolutie, en wijzigingen kunnen worden uitgevoerd met ruimtelijke precisie op het atomaire niveau 4, een niveau van controle die niet kan worden bereikt met behulp van synthetische nanomaterialen met de huidige state-of-the-art technologieën.

In dit artikel beschrijven we de verspreiding van CPMV, PVX, TMV, en BMV in Vigna ungiuculata en Nicotiana benthamiana planten. Extractie en zuivering protocollen voor elke VNP gegeven. Methoden voor het karakteriseren van gezuiverd en chemisch gelabelde VNPs beschreven. In dit onderzoek richten we ons op chemical etikettering van VNPs met fluoroforen (bijv. Alexa Fluor 647) en polyethyleenglycol (PEG). De kleurstoffen vergemakkelijken volg-en detectiesysteem van de VNPs 5-10, en PEG vermindert immunogeniciteit van het eiwitachtige nanodeeltjes terwijl het verbeteren van hun farmacokinetiek 8,11. We laten zien tumor homing van gePEGyleerde VNPs gebruik van een muis xenograft tumor model. Een combinatie van fluorescentie beeldvorming van weefsels ex vivo met Maestro Imaging System, fluorescentie kwantificering in gehomogeniseerde weefsels, en confocale microscopie wordt gebruikt om biodistributie te bestuderen. VNPs worden gewist via het reticulo-endotheliale systeem (RES); tumor homing wordt passief bereikt via de verbeterde doorlaatbaarheid en retentie (EPR) effect 12. De VNP nanotechnologie is een krachtige plug-and-play-technologie om beeld en te behandelen plaatsen van de ziekte in vivo. Wij blijven VNPs van drugs ladingen en klinisch relevante imaging eenheden, alsmede weefsel-specifieke liganden dragen naargericht moleculaire receptoren tot overexpressie gebracht in kanker en cardiovasculaire aandoeningen.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. VNP (CPMV, BMV, PVX, en TMV) Propagatie

  1. Stel de kamerplant kamer controlemiddelen om de 15 uur van de dag (100% licht, 25 ° C, 65% luchtvochtigheid) en 9 uur van de nacht (0% licht, 22 ° C, 60% luchtvochtigheid).
  2. Inoculeer planten volgens de tijdlijn in tabel 1.
CPMV PVX, TMV en BMV
Dag 0: Plant 3 cowpea zaden / pot. Dag 0: Plant ~ 30 N. benthamiana zaden / pot. Bemesten een keer per week met 1 eetlepel meststof / 5 L water.
Dag 14: Re-pot N. benthamiana op 1 plant / pot.
Dag 10: Infect verlaat primaire bladeren met CPMV (5 μg/50 ul / blad) door mechanische inoculatie met behulp van een dun laagje van carborundum. Dag 28: Infect drie tot five bladeren met PVX, TMV, of BMV (5 μg/50 ul / blad) door mechanische inoculatie met behulp van een dun laagje van carborundum.
Dag 20: Harvest bladeren en op te slaan in -80 ° C. Dag 42: Harvest bladeren en op te slaan in -80 ° C.

Tabel 1. Tijdlijn voor de teelt, infecteren, en oogsten bladeren.

Opmerking: alleen CPMV voortplanting wordt aangetoond als een voorbeeld.

2. VNP (CPMV, BMV, PVX, en TMV) Zuivering

Opmerking: Alle stappen worden uitgevoerd op ijs of bij 4 ° C.

  1. Meng 100 g bevroren bladeren in een standaard mixer met 2 volumes koude buffer (zie tabel 2). Filtreer door 2-3 lagen kaasdoek.
  2. Voor PVX, breng de pH op 6,5 met behulp van 1 M HCl. Voeg 0,2% (w / v) ascorbinezuur en 0,2% (w / v) natrium sulfite.
  3. Centrifugeer ruwe fabriek homogenaat bij 5.500 xg gedurende 20 minuten. Verzamel supernatant.
  4. Voor BMV, laag 25 ml supernatant over 5 ml van 10% (w / v) sucroseoplossing. Centrifugeer bij 9000 xg gedurende 3 uur en resuspendeer in pellets 38,5% CsCl oplossing (w / v). Mix op door gedurende 5 uur, ga dan verder met stap 2.12.
  5. Extraheren plantaardig materiaal door het toevoegen van 0,7 volumes van 1:1 (v / v) chloroform :1-butanol. Roer het mengsel gedurende 30-60 minuten.
  6. Centrifugeer bij 5.500 xg oplossing gedurende 20 minuten. Verzamel de bovenste waterige fase.
  7. Voeg NaCl tot 0,2 M en 8% (w / v) PEG (MW 8.000). Voor TMV ook met 1% (v / v) Triton X-100. Roer gedurende ten minste 1 uur, laat zitten gedurende ten minste 1 uur.
  8. Centrifugeer bij 15.000 xg oplossing gedurende 15 minuten. Hersuspendeer pellet in 10 ml buffer. Voor PVX, voeg 0,1% β-mercaptoethanol en ureum tot 0,5 M.
  9. Centrifugeer bij 8.000 g gedurende 30 min en verzamel supernatant.
  10. Ultracentrifuge supernatant bij 160.000 xg gedurende 3 uur. Resuspendeer de pellet in 5 ml buffer overnight.
  11. Bereid een 10-40% sucrosegradiënt met gelijke volumes van 10%, 20%, 30% en 40% sucrose in buffer (zwaarste eerst). Laat de gradiënt om 's nachts evenwicht bij kamertemperatuur.
  12. Ultracentrifuge geresuspendeerde pellet dan sucrose gradiënt op 100.000 xg gedurende 2 uur (24 uur voor BMV).
  13. Verzamel lichtverstrooiing band en dialyseren tegen buffer.
  14. Karakteriseren VNPs (hieronder) en bewaar bij 4 ° C. Voor langdurige opslag, bewaren bij -80 ° C.
CPMV en TMV 0,1 M kaliumfosfaatbuffer (pH 7,0)
38,5 mM KH 2 PO 4
61,5 mM K 2 HPO 4
PVX 0,5 M boraatbuffer (pH 7,8)
0,5 M boorzuur
Breng de pH met NaOH
BMV SAMA buffer (pH 4,5)
250 mM natriumacetaat
10 mM MgCl2
2 mM β-mercaptoethanol (voeg vers)

Tabel 2. Buffers en hun recepten voor elke VNP.

Opmerking: alleen CPMV voortplanting wordt aangetoond als een voorbeeld.

3. VNP (CPMV, BMV, PVX, en TMV) Karakterisering

  1. Voer UV / zichtbaar spectroscopie om de concentratie van VNPs bepalen.
    1. Meet de absorptie van 2 pl monster met een NanoDrop spectrofotometer.
    2. De concentratie van deeltjes en kleurstoffen met de Beer-Lambert law (A = εcl, waarbij A de absorptie, ε de extinctiecoëfficiënt, c de concentratie is en L de weglengte). De weglengte 0,1 cm voor de NanoDrop.
      De VNP-specifieke extinctie coëfficiënten zijn:
      CPMV: 8,1 cm -1 -1 mg ml (bij 260 nm)
      PVX: 2,97 cm -1 -1 mg ml (bij 260 nm)
      TMV: 3,0 cm -1 -1 mg ml (bij 260 nm)
      BMV: 5,15 cm -1 -1 mg ml (bij 260 nm)
  2. Analyseer deeltjes per grootte-uitsluiting snelle proteïne vloeistofchromatografie (FPLC).
    1. Met een Superose 6 grootte-exclusiekolom en de ÄKTA Explorer, belasting 50-100 ug VNPs in 200 pl 0,1 M kaliumfosfaatbuffer (pH 7,0).
    2. Stel detectors tot 260 nm (nucleïnezuur), 280 nm (proteïne), en de golflengte van de bijgevoegde kleurstoffen.
    3. Gelopen bij een stroomsnelheid van 0,5 ml / min gedurende 72 min.
    4. De elutieprofiel en A260: A280 nm geeft aan of de VNP voorbereiding zuiver is en of deeltjes zijn intact en gemonteerd.
      De volgende A260: 280 verhoudingen dan een zuiver preparaat VNP:
      CPMV: 1,8 ± 0,1
      PVX: 1,2 ± 0,1
      TMV:1,1 ± 0,1
      BMV: 1,7 ± ​​0,1
  3. Voer denaturerende (prefab NuPAGE) Bis-Tris 4-12% polyacrylamide gradiënt gel elektroforese om de zuiverheid van de bereiding en conjugatie analyseren individuele manteleiwitten.
    1. 3 ml 4x LDS-monsterbuffer van 10 ug van de deeltjes in 9 pl kaliumfosfaatbuffer. Een extra 1 ul van 4x LDS-monsterbuffer en 3 pl β-mercaptoethanol aan BMV het grote aantal disulfidebindingen verminderen.
    2. Incubeer in warmteblok gedurende 5 minuten bij 100 ° C.
    3. Laad monsters op een SDS-gel.
    4. Draaien monsters bij 200 V gedurende 1 uur in 1 x MOPS loopbuffer.
    5. Documenteer de gel onder UV-licht om fluorescerende manteleiwitten visualiseren.
    6. Voor niet-fluorescerend eiwit vlek met Coomassie blauw (0,25% (w / v) Coomassie Brilliant Blue R-250, 30% (v / v) methanol, 10% (v / v) azijnzuur) gedurende 1 uur.
    7. Destain met 30% methanol, 10% azijnzuur gedurende de nacht. Change oplossing indien nodig.
    8. Documenteer de gel onder wit licht.
  4. Analyseren integriteit van deeltjes door transmissie-elektronenmicroscopie (TEM).
    1. Verdun monsters 0,1-1 mg / ml in 20 ui DI water.
    2. Breng 20 pl druppels van de monsters op Parafilm.
    3. Bedek druppels met een TEM rooster en laat zitten voor 2 minuten. Wick de overtollige oplossing op de grid met filtreerpapier.
    4. Was net door het toestel op een daling van DI-water dan wicking droog.
    5. Vlek net door het op een 20 ul druppel 2% (w / v) uranylacetaat gedurende 2 minuten. Wick het overtollige vlek met filtreerpapier.
    6. Was net nog eens in het water.
    7. Let op raster onder een transmissie-elektronenmicroscoop.

4. Chemische conjugatie van PEG en VNPs met fluoroforen, zuivering en karakterisering

  1. Voor berekeningen voor de reacties onder de molaire massa van het VNPs zijn:
    CPMV: 5,6x 10 6 g / mol
    PVX: 35 x 10 6 g / mol
    TMV: 41 x 10 6 g / mol
    BMV: 4,6 x 10 6 g / mol
  2. Conjugaat kleurstoffen en PEG het oppervlak van lysines en CPMV PVX middels een stap N-hydroxysuccinimide koppelingsreactie: Voeg 2,500 molaire equivalenten (alle molaire overmaat zie molaire overmaat per VNP) van Alexa Fluor 647 succinimidyl ester en 4.500 equivalenten NHS- PEG (MW 5.000) opgelost in DMSO om CPMV in 0,1 M kaliumfosfaatbuffer. Bij het werken met PVX, voeg een 10.000 molaire overmaat van NHS-kleurstof en NHS-PEG. Stel de buffer en DMSO volumes zodanig dat de eindconcentratie van CPMV en PVX is 2 mg / ml DMSO en gehalte 10% van het totale reactievolume. Incubeer het reactiemengsel overnacht bij kamertemperatuur beschermd tegen licht. CPMV en PVX hebben 300 en 1270 adresseerbare lysines, respectievelijk. (Verwezen wordt naar de volgende verwijzingen voor verdere lezingchemische modificatie van CPMV en PVX: 13-15).
  3. Conjugaat kleurstoffen en PEG tyrosines van TMV door diazonium koppeling gevolgd door koper (I)-gekatalyseerde azide-alkyn cycloadditie.
    1. Bereid diazoniumzout (alkyn) door 400 ul 0,3 M p-tolueensulfonzuurmonohydraat, 25 ul van 3,0 M natriumnitriet en 75 pl van 0,68 M gedestilleerd 3-ethynylaniline opgelost in acetonitril bij 4 ° C gedurende 1 uur.
    2. Voeg 3,3 ml boraatbuffer, pH 8,8, die 100 mM NaCl tot 1,25 ml van TMV (20 mg / ml voorraadoplossing).
    3. Reageren de TMV met 450 ul van het diazoniumzout (alkyn) oplossing in een ijsbad gedurende 3 uur toevoegen een alkyn ligatie te hanteren door TMV diazonium koppeling. De oplossing zal veranderen in een licht bruine kleur. TMV heeft 2140 beschikbaar tyrosines voor conjugatie.
    4. Zuiver het eindproduct met een sucrosekussen zoals beschreven in stap 4.4.
    5. Bevestig azide-functionele Alexa Fluor 647 en PEG-azide (MW 5.000) using koper (I)-gekatalyseerde azide-alkyn cycloadditie (CuAAC). Voeg 2 equivalenten kleurstof en PEG-azide per manteleiwit en incubeer met 1 mM CuSO 4, 2 mM AMG en 2 mM natrium ascorbaat bij kamertemperatuur gedurende 15 minuten. Stel het volume buffer zodanig dat de uiteindelijke concentratie van TMV reactie is 2 mg / ml. (Verwezen wordt naar de volgende verwijzingen voor verdere lezing chemische modificatie van TMV: 16,17).
  4. Conjugaat kleurstoffen lysines en PEG cysteïnen van BMV cysteine ​​mutant (cBMV):
    1. Voeg 2000 molequivalenten Oregon Green 488 succinimidylester opgelost in DMSO om cBMV in 0,1 M TNKM buffer (50 mM Tris base, 50 mM NaCl, 10 mM KCl, 5 mM MgCl2, pH 7,4). Stel de buffer en DMSO volumes zodanig dat de eindconcentratie van BMV is 1 mg / ml DMSO en gehalte 10% van het totale reactievolume. 'S nachts Incubeer het reactiemengsel bij 4 ° C beschermd tegen licht.
    2. Purify deeltjes met behulp van Centrifugal filters zoals beschreven in stap 4.4.
    3. Voeg 2,000 molaire overmaat van PEG-maleïmide (MW 2.000) met dezelfde reactieomstandigheden als voorheen en incubeer het reactiemengsel gedurende 2 uur bij 4 ° C. cBMV heeft 180 reactief lysines en cysteïnes. (Verwezen wordt naar de volgende verwijzingen voor verdere lezing chemische modificatie van BMV: 18).
  5. Zuivering: laat de oplossing door een 40% (w / v) sucrose kussen 160.000 xg gedurende 2,5 uur. Re-los de pellet op in buffer. Als alternatief dialyseren tegen een passende buffer met behulp van 10 kDa cut-off spin-filters.
  6. Karakterisering: gePEGyleerde en fluorescent-gelabelde VNPs worden geanalyseerd met de hierboven beschreven werkwijzen: UV / zichtbare spectroscopie, SDS gel elektroforese, FPLC en TEM (niet getoond, maar zie figuren 6 en 7).

5. Tumor targeting en imaging met behulp van een muis xenograft model

  1. Cultuur HT-29 menselijke colonkankercellen in RPMI medium aangevuld met 5% FBS, 1% penicilline-streptomycine en 1% L-glutamine bij 37 ° C in 5% CO2 met 175 cm 2 celkweek kolven.
  2. Was tweemaal cellen met steriel PBS en geoogst door incubatie met 5 ml trypsine-EDTA bij 37 ° C gedurende 5 minuten. Inactiveren de trypsine met 5 ml RPMI medium. Verzamel cellen door centrifugeren bij 500 xg gedurende 5 minuten. bij 4 ° C en resuspendeer in vers RPMI op 5x10 6 cells/50 ul medium (het totaal aan cellen met trypan blauw en een hemocytometer). Te mengen met een gelijk volume Matrigel de injectie (om al oplossingen en steriele reagentia).
  3. Procure zes weken oude NCR nu / nu muizen en hen op een luzerne vrij dieet voor 2 weken. [Opmerking:. Procedures waarbij dieren worden moet IACUC goedgekeurd] Laten tumorxenotransplantaten door subcutane injectie van 5x10 6 cellen/100 pl / tumor in de flanken (2 tumoren / muis) met behulp van een 18 1/2 meter sterielenaald. Regelmatig toezicht op de dieren. Meet de tumorgrootte met calipers en laat de tumoren groeien tot een gemiddelde volume van 20 mm3 (binnen 12 dagen). Wijs muizen op twee verschillende groepen willekeurig: PBS en VNP (n = 3 dieren / groep / tijdstip). Met een 1 ml insulinespuit 28 gauge, toedienen door intraveneuze injectie staartader 100 pi steriel PBS of 10 mg / kg VNP formulering.

Opmerking: Weefselkweek experimenten en studies met levende dieren zullen niet worden aangetoond. Hands-on demonstratie zal worden beperkt tot weefsel verwerking en data-acquisitie. Voor een verwijzing op de HT-29 tumor xenograft model, wordt verwezen naar ref. 19

Drie technieken worden gebruikt om tumor homing van VNPs evalueren:

  1. Fluorescentie beeldvorming met Maestro Imaging System: Sacrifice muizen op verschillende tijdstippen (2, 24 en 72 uur) met behulp van CO2gas. Prepareer de dieren en accijnzen alle belangrijke organen (hersenen, hart, longen, milt, nieren en lever), samen met de tumoren op de flanken, plaatst u de weefsels op parafilm en analyseren met fluorescentie beeldvorming instrument met behulp van gele excitatie-en emissie filters (800 ms blootstelling) de aanwezigheid van fluorescentiesignalen in de weefsels (afgeleid van A647 label geconjugeerd met het VNPs) detecteren. Sla de afbeeldingen en analyseren fluorescerende intensiteit met behulp van ImageJ 1.44o software ( http://imagej.nih.gov/ij ). Vergelijk de patroon van opname van de VNPs in tumoren met andere belangrijke weefsels met de tijd.
  2. Na beeldvorming, snijd elk weefsel in de helft en insluiten ene helft in OCT compound voor cryo-snijden en confocale analyse. Verzamel de andere helft in vooraf gewogen cryobuisjes en onmiddellijk te bevriezen ze met behulp van vloeibare N 2. Bij -80 ° C tot gereed voor verdere verwerking.
  3. Fluorescentie kwantificering: Resnoer weefsels gewichten. Ontdooi bevroren weefsels bij kamertemperatuur en plaats ze in afzonderlijke 50 ml Falcon buizen met 1 ml PBS. Als u een draagbare weefsel homogenisator, Homogeniseer de weefsels gedurende 2-3 minuten in PBS en transporteert dan het homogenaat om microfugebuizen. Centrifugeer de homogenaten gedurende 10 min bij 13.000 xg niet-gehomogeniseerde weefsel.
  4. Pipetteer 100 ul van de supernatant uit de weefsels van elke groep (PBS formuleringen en VNP / tijdstippen) in een 384 putjes zwarte UV plaat. Evalueer fluorescentie-intensiteit (Ex / Em golflengten 600/665) met behulp van een bord lezer. Normaliseren van de verkregen fluorescentie waarden door het weefsel gewichten.
  5. Immunohistochemie: Bereid cryo-microtoom secties (10 micrometer) en bewaar bij -20 ° C. Vlek weefselsecties voor celkernen (DAPI) en endotheliale celmarker (FITC-gelabeld anti-muis CD31 antilichaam). Voer confocale microscopie analyse aan de vasculaire en intra-tumorale lokalisatie van fluorescentie-gemerkt VNP kaarts.

Opmerking: Deze procedure wordt niet aangetoond representatieve gegevens worden weergegeven in figuur 8. Voor een overzicht van immunohistochemie en kleuring beschreven werkwijzen wordt verwezen naar ref 19.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Dit protocol verschaft een benadering voor de chemische modificatie van VNPs en hun toepassingen in vivo tumor imaging. Het dier fluorescentie beeldvorming, fluorescentie kwantificering en immunohistochemie technieken hier gepresenteerd zijn nuttig voor het bestuderen van biologische verdeling en evalueren van tumor homing. Deze technieken leveren waardevolle informatie over de toegang van de nanodeeltjes aan de tumor via de EPR effect. Door de resultaten van de verschillende analysemethoden, krijgen we een krachtige aanpak voor het evalueren lokalisatie en biodistributie van het VNPs.

Voordat deze studies kan echter worden uitgevoerd, is het essentieel het verkrijgen van een zuivere viruspreparaat. Naast de mechanische inoculatie, een mogelijk alternatief voor VNP propagatie agroinfiltration, die een hoge transformatie en accumulatiesnelheid kan hebben. Wanneer het uitdragen van de VNPs, moet erop worden gelet dat planten die besmet zijn met verschillende virussen aparte als t houdeno om kruisbesmetting te vermijden. In het bijzonder wordt TMV snel uit en mechanisch overgebracht. Een andere belangrijke stap om rekening te houden met voert virus zuivering op ijs of bij 4 ° C. Alle buffers moeten worden gebruikt ijskoud. De lagere temperatuur is noodzakelijk om schade aan de VNPs voorkomen als gevolg van proteasen en oxiderende enzymen in het plantaardige materiaal.

Lage opbrengst van gezuiverd VNPs voortvloeien uit meerdere factoren. Een mogelijke oorzaak zou de leeftijd van de VNPs voor vermeerdering zijn. Het verdient de voorkeur recentere viruspreparaten gebruiken. Bijvoorbeeld de C-terminale 24 aminozuren van de S manteleiwit van CPMV nodig zijn voor het onderdrukken van gene silencing. Deletie van dit oppervlak-blootgestelde gebied optreedt tijd door proteolyse. De structuur en stabiliteit van CPMV niet worden beïnvloed, groeiachterstand en vertraagde verspreiding van het virus resultaten. Een andere bron van lage opbrengsten is het verlies van de VNPs tijdens de zuivering. Het bijzonder bijTention moet worden gegeven aan de resuspensie stap na PEG precipitatie. Onvolledige resuspensie van de pellet zou leiden VNP verloren in de pellet van de volgende centrifugatiestap.

Over het geheel genomen de bioconjugatie chemie hier gepresenteerde eenvoudig. 14,17,18,21 De beschreven karakterisering methoden zijn waardevol voor het waarborgen van deeltjes integriteit en het bepalen van de omvang van conjugatie. Molaire overmaat kan dienovereenkomstig aangepast afhankelijk van de toepassing en de graad van gewenste functionalisering.

Bij het werken met de muis xenograft model wordt de meest essentiële praktijk na aseptische techniek. Bovendien de staartader injectie is een belangrijke stap om een ​​uniforme sample dosis voor elke muis waarborgen. Het kan helpen om de staart te plaatsen in warm water op voorhand om de ader te verwijden. Een andere overweging is autofluorescentie voor fluorescentie beeldvorming en metingen. In het algemeen, weefsel autofluorescentie is het minimaliserened groter dan 600 nm, het maken van lange golflengte kleurstoffen met emissie maxima groter dan 600 nm optimaal als de imaging probe. Echter, normale muis voeding uit chlorofyl bevattende alfalfa, die ook fluoresceert rood. Dientengevolge moet de muizen op een dieet alfalfa gedurende ten minste 2 weken te verminderen achtergrondsignalen. Tenslotte moet worden opgemerkt dat fluorescentiedetectie behulp van fluorescentie beeldvorming beperkt door verschillen in de verstrooiing en absorptie omgevingen van de verschillende weefsels. Derhalve wordt imaging gebruikt voor visualisatie en als eerste methode voor controle biodistributie, terwijl kwantificering wordt uitgevoerd met weefselhomogenaten.

Enkele voordelen van het gebruik van VNPs als het platform technologie zijn hun monodispersiteit, biocompatibiliteit, mogelijkheid voor opschaling productie, en ontvankelijkheid voor meerdere functionalisering strategieën. Naast chemische engineering, genetische manipulatie wordt hier geïllustreerd met de introductietie van cysteïnen aan BMV als doel voor bioconjugatie. Gentechnologie kan ook worden gebruikt om voeren gerichte peptiden of affiniteit tags. Terwijl de beschreven protocol maakt gebruik van dual-gelabeld (kleurstof en PEG) deeltjes, zijn lopende studies kijken naar het opnemen van bijkomende functionaliteiten (dat wil zeggen, therapeutica en targeting) om weefsel specificiteit en de therapeutische werkzaamheid te verbeteren. Zo, deze aanpak legt de basis voor toekomstige biomedische toepassingen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Geen belangenconflicten verklaard.

Acknowledgments

Dit werk werd ondersteund door NIH / NIBIB subsidies R00 EB009105 (tot NFS) en P30 EB011317 (tot NFS), een NIH / NIBIB opleiding subsidie ​​T32 EB007509 (tot AMW), een Case Western Reserve University Interdisciplinair Alliance Investment Grant (tot NFS), en een zaak Comprehensive Cancer Center subsidie ​​P30 CA043703 (tot NFS). Wij danken het Steinmetz-Lab undergraduate student onderzoekers voor hun hands-on ondersteuning: Nadia Ayat, Kevin Chen, Sourav (Sid) Dey, Alice Yang, Sam Alexander, Craig D'Cruz, Stephen Hern, Lauren Randolph, Brian Dus, en Paul Chariou .

Materials

Name Company Catalog Number Comments
VNP production
Indoor plant chamber Percival Scientific E-41L2
V. unguiculata seeds (California black-eye no. 5) Burpee 51771A
N. benthamiana seeds N. benthamiana seeds were a gift from Salk Institute. Seeds are produced through plant propagation.
Carborundum Fisher C192-500
Pro-mix BX potting soil Premier Horticulture 713400
Jack's Professional 20-10-20 Peat-Lite Fertilizer JR Peters 77860
Equipment
50.2 Ti rotor Beckman 337901
SW 32 Ti rotor Beckman 369694
Optima L-90K ultracentrifuge Beckman 365672
SLA-3000 rotor Thermo Scientific 07149
SS-34 rotor Thermo Scientific 28020
Sorvall RC-6 Plus centrifuge Thermo Scientific 46910
Polypropylene bottle Beckman 355607 For SLA-3000 rotor
Polycarbonate bottle Beckman 357002 For SS-34 rotor
Ultra-Clear tube Beckman 344058 For sucrose gradient and SW 32 Ti rotor
Polycarbonate bottle Beckman 355618 For pelleting and 50.2 Ti rotor
NanoDrop spectrophotometer Thermo Scientific NanoDrop2000c
PowerEase 500 pre-cast gel system Invitrogen EI8675EU
Superose 6 10/300 GL (24 ml) size-exclusion column GE Healthcare 17-5172-01
ÄKTA Explorer 100 Chromatograph GE Healthcare 28-4062-66
Allegra X-12R Beckman 392302 Benchtop centrifuge
Cryostat Leica CM1850
Maestro 2 Caliper Life Sciences In vivo imaging system
Tissue-Tearor Biospec Products 985370-395
Microplate reader Tecan Infinite-200
Transmission electron microscope ZEISS Libra 200FE
FluoView laser scanning confocal microscope Olympus FV1000
Chemicals and Reagents
3-ethynylaniline Sigma Aldrich 498289-5G
384 well black plate BD Biosciences 353285
4-12% Bis-Tris NuPAGE SDS gel Invitrogen NP0321BOX
4X LDS sample buffer Invitrogen NP0008
Acetic Acid Fisher A385-500
Acetonitrile Sigma Aldrich 271004-1L
Alexa Fluor 647 azide Invitrogen A10277
Alexa Fluor 647 carboxylic acid, succinimidyl ester Invitrogen A20006
Amicon Ultra-0.5 ml Centrifugal Filters Millipore UFC501096 10 kDa cut-off
Aminoguanidine hydrochloride Acros Organics 36891-0250
Boric acid Fisher A74-500
Coomassie Brilliant Blue R-250 Fisher BP101-25
CsCl Acros Organics 42285-1000
DAPI MP Biomedicals 157574
Dimethyl sulfoxide Fisher BP231-100
Filter paper Fisher 09-801K P5 grade
FITC anti-mouse CD31 BioLegend 102406
Goat serum Invitrogen 16210-064
KCl Fisher BP366-500
L-ascorbic acid sodium salt Acros Organics 35268-0050
Methanol Fisher A412P-4
MgCl2 Fisher BP214-500
Microscope slides Fisher 12-544-3
Microscope cover glass VWR 48366-277
MOPS buffer Invitrogen NP0001
mPEG-mal Nanocs PG1-ML-2k MW 2000
mPEG-N3 Nanocs PG1-AZ-5k MW 5000
mPEG-NHS Nanocs PG1-SC-5k MW 5000
NaCl Fisher BP358-212
Oregon Green 488 succinimidyl ester *6-isomer* Invitrogen O-6149
p-toluenesulfonic acid monohydrate Acros Organics 13902-0050
Permount Fisher SP15-100
Potassium phosphate dibasic Fisher BP363-1
Potassium phosphate monobasic Fisher BP362-1
Sodium acetate Fisher BP333-500
Sodium nitrite Acros Organics 42435-0050
Sodium sulfite Amresco 0628-500G
Sucrose Fisher S6-500
TEM grid Ted Pella FCF-400Cu
Tris base Fisher BP152-500
Triton X-100 EMD Chemicals TX1568-1
β-mercapt–thanol Fisher O3446I-100
Tissue Culture
Fetal bovine serum Invitrogen 12483-020
Hemocytometer Fisher 0267110
HT-29 cells ATCC HTB-38
L-glutamine Invitrogen 25030-080
PBS Cellgro 21-040-CV
Penicillin-streptomycin Invitrogen 10378-016
RPMI-1640 Invitrogen 31800-089
Tissue culture flasks Corning 431080 175 cm2
Trypan Blue Thermo Scientific SV30084.01
Trypsin, 0.05% (1X) with EDTA 4Na, liquid Invitrogen 25300-054
Animal Studies
18% Protein Rodent Diet Harlan Teklad Teklad Global 2018S Alfalfa free diet
Insulin syringe BD Biosciences 329410 28 gauge
Isoflurane Baxter AHN3637
Matrigel Matrix basement membrane BD Biosciences 356234
NCR nu/nu mice CWRU School
of Medicine Athymic Animal and Xenograft Core Facility
Sterile syringe BD Biosciences 305196 18 1/2 gauge
Tissue-Tek CRYO-OCT Compound Andwin Scientific 4583

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Description of Plant Viruses [Internet]. Association of Biologists. Warwick, UK. Available from: http://dpvweb.net/ (2012).
  2. Carrillo-Tripp, M., Shepherd, C. M., Borelli, I. A., Venkataraman, S., Lander, G., Natarajan, P., Johnson, J. E., Brooks, C. L., Reddy, V. S. VIPERdb2: an enhanced and web API enabled relational database for structural virology. Nucl. Acids Res. 37, 436-442 (2009).
  3. Pokorski, J. K., Steinmetz, N. F. The art of engineering viral nanoparticles. Mol. Pharm. 8, 29-43 (2011).
  4. Steinmetz, N. F., Lin, T., Lomonossoff, G. P., Johnson, J. E. Structure-based engineering of an icosahedral virus for nanomedicine and nanotechnology. Curr. Top Microbiol. Immunol. 327, 23-58 (2009).
  5. Jung, B., Rao, A. L., Anvari, B. Optical Nano-Constructs Composed of Genome-Depleted Brome Mosaic Virus Doped with a Near Infrared Chromophore for Potential Biomedical Applications. ACS Nano. (2011).
  6. Leong, H. S., Steinmetz, N. F., Ablack, A., Destito, G., Zijlstra, A., Stuhlmann, H., Manchester, M., Lewis, J. D. Intravital imaging of embryonic and tumor neovasculature using viral nanoparticles. Nat. Protoc. 5, 1406-1417 (2010).
  7. Leopold, P. L., Ferris, B., Grinberg, I., Worgall, S., Hackett, N. R., Crystal, R. G. Fluorescent virions: dynamic tracking of the pathway of adenoviral gene transfer vectors in living cells. Hum. Gene Ther. 9, 367-378 (1998).
  8. Lewis, J. D., Destito, G., Zijlstra, A., Gonzalez, M. J., Quigley, J. P., Manchester, M., Stuhlmann, H. Viral nanoparticles as tools for intravital vascular imaging. Nat. Med. 12, 354-360 (2006).
  9. Steinmetz, N. F., Ablack, A. L., Hickey, J. L., Ablack, J., Manocha, B., Mymryk, J. S., Luyt, L. G., Lewis, J. D. Intravital imaging of human prostate cancer using viral nanoparticles targeted to gastrin-releasing Peptide receptors. Small. 7, 1664-1672 (2011).
  10. Wu, C., Barnhill, H., Liang, X., Wang, Q., Jiang, H. A new probe using hybrid virus-dye nanoparticles for near-infrared fluorescence tomography. Optics Communications. 255, 366-374 (2005).
  11. Steinmetz, N. F., Cho, C. F., Ablack, A., Lewis, J. D., Manchester, M. Cowpea mosaic virus nanoparticles target surface vimentin on cancer cells. Nanomedicine (Lond). 6, 351-364 (2011).
  12. Maeda, H., Wu, J., Sawa, T., Matsumura, Y., Hori, K. Tumor vascular permeability and the EPR effect in macromolecular therapeutics: a review. Journal of Controlled Release. 65, 271-284 (2000).
  13. Chatterji, A., Ochoa, W., Paine, M., Ratna, B. R., Johnson, J. E., Lin, T. New addresses on an addressable virus nanoblock: uniquely reactive Lys residues on cowpea mosaic virus. Chem. Biol. 11, 855-863 (2004).
  14. Steinmetz, N. F., Mertens, M. E., Taurog, R. E., Johnson, J. E., Commandeur, U., Fischer, R., Manchester, M. Potato virus X as a novel platform for potential biomedical applications. Nano Lett. 10, 305-312 (2010).
  15. Wang, Q., Lin, T., Tang, L., Johnson, J. E., Finn, M. G. Icosahedral virus particles as addressable nanoscale building blocks. Angew. Chem. Int. Ed. 41, 459-462 (2002).
  16. Bruckman, M. A., Kaur, G., Lee, L. A., Xie, F., Sepulveda, J., Breitenkamp, R., Zhang, X., Joralemon, M., Russell, T. P., Emrick, T., Wang, Q. Surface modification of tobacco mosaic virus with "click" chemistry. Chembiochem. 9, 519-523 (2008).
  17. Schlick, T. L., Ding, Z., Kovacs, E. W., Francis, M. B. Dual-surface modification of the tobacco mosaic virus. J. Am. Chem. Soc. 127, 3718-3723 (2005).
  18. Yildiz, I., Tsvetkova, I., Wen, A. M., Shukla, S., Masarapu, M. H., Dragnea, B., Steinmetz, N. F. Engineering of Brome mosaic virus for biomedical applications. RSC Advances. (2012).
  19. Brunel, F. M., Lewis, J. D., Destito, G., Steinmetz, N. F., Manchester, M., Stuhlmann, H., Dawson, P. E. Hydrazone ligation strategy to assemble multifunctional viral nanoparticles for cell imaging and tumor targeting. Nano Lett. 10, 1093-1097 (2010).
  20. Shukla, S., Ablack, A., Wen, A., Lee, K., Lewis, J., Steinmetz, N. F. Increased tumor homing and tissue penetration of the filamentous plant viral nanoparticle Potato virus X. Molecular Pharmaceutics. (2012).
  21. Chatterji, A., Ochoa, W., Shamieh, L., Salakian, S. P., Wong, S. M., Clinton, G., Ghosh, P., Lin, T., Johnson, J. E. Chemical conjugation of heterologous proteins on the surface of Cowpea mosaic virus. Bioconjug. Chem. 15, 807-813 (2004).
Virale nanopartikels voor<em&gt; In vivo</em&gt; Tumor Imaging
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wen, A. M., Lee, K. L., Yildiz, I., Bruckman, M. A., Shukla, S., Steinmetz, N. F. Viral Nanoparticles for In vivo Tumor Imaging. J. Vis. Exp. (69), e4352, doi:10.3791/4352 (2012).More

Wen, A. M., Lee, K. L., Yildiz, I., Bruckman, M. A., Shukla, S., Steinmetz, N. F. Viral Nanoparticles for In vivo Tumor Imaging. J. Vis. Exp. (69), e4352, doi:10.3791/4352 (2012).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter