Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Bioengineering

Virale Nanopartikler for doi: 10.3791/4352 Published: November 16, 2012

Summary

Plant virale nanopartikler (VNPs) er lovende platforme til applikationer i biomedicin. Her beskriver vi procedurerne for plante VNP formering, oprensning, karakterisering, og bioconjugation. Endelig viser vi anvendelsen af ​​VNPs for tumor homing og billeddannelse ved hjælp af en mus xenograft model og fluorescensimagografi.

Abstract

Anvendelsen af ​​nanomaterialer har potentialet til at revolutionere materialevidenskab og medicin. I øjeblikket er en række forskellige nanopartikler, som undersøges for anvendelse i billeddannelse og terapi. Virale nanopartikler (VNPs) stammer fra planter kan betragtes som selv-samlet bionanomaterials med veldefinerede størrelser og former. Plantevira, der undersøges i Steinmetz lab omfatter ikosaedriske partikler dannet ved Cowpea-mosaikvirus (CPMV) og Brome mosaikvirus (BMV), der begge er 30 nm i diameter. Vi udvikler også stavformede og filamentøse strukturer afledt af følgende plantevira: tobakmosaikvirus (TMV), som danner stive stænger med dimensionerne 300 nm med 18 nm, og Potato Virus X (PVX), der danner filamentøse partikler 515 nm i længde og 13 nm i bredden (læseren henvises til ref. 1 og 2 for yderligere information om VNPs).

i planta, er usædvanligt stabilt, og biokompatible. Også VNPs er "programmerbare" enheder, som specifikt kan manipuleret ved hjælp af genetisk modificering eller kemiske bioconjugation metoder 3. Strukturen af VNPs er kendt for atomar opløsning, og modifikationer kan udføres med rumlig præcision på det atomare niveau 4, en grad af kontrol, som ikke kan opnås ved anvendelse af syntetiske nanomaterialer med aktuelle state-of-the-art teknologi.

I denne artikel beskriver vi udbredelsen af CPMV, PVX, TMV, og BMV i Vigna ungiuculata og Nicotiana benthamiana planter. Udvinding og oprensning protokoller for hver VNP er angivet. Fremgangsmåder til karakterisering af oprenset og kemisk-mærkede VNPs beskrives. I denne undersøgelse fokuserer vi på chemical mærkning af VNPs med fluoroforer (fx Alexa Fluor 647) og polyethylenglycol (PEG). Farvestofferne lette sporing og detektion af VNPs 5-10, og PEG reducerer immunogeniciteten af de proteinholdige nanopartikler og samtidig øge deres farmakokinetik 8,11. Vi demonstrere tumor homing af pegyleret VNPs bruge en mus xenograft tumor model. En kombination af fluorescensimagografi af væv ex vivo under anvendelse Maestro Imaging System, fluorescens kvantificering i homogeniserede væv, og konfokal mikroskopi anvendes til at studere biofordeling. VNPs slettes via det retikuloendoteliale system (RES) tumor homing opnås passivt via den forbedrede permeabilitet og tilbageholdelse (EPR) effekt 12. Det VNP nanoteknologi er en kraftfuld plug-and-play teknologi til billede og behandle lokaliteter af sygdom in vivo. Vi videreudvikler VNPs at bære lægemiddel laster og klinisk relevante imaging-dele, samt vævsspecifikke ligander tilmålrette molekylære receptorer overudtrykt i kræft og hjerte-karsygdomme.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. VNP (CPMV, BMV, PVX, og TMV) Propagation

  1. Indstil indendørs anlæg kammer styrer til 15 timer af dagen (100% lys, 25 ° C, 65% fugtighed) og 9 timer af natten (0% lys, 22 ° C, 60% luftfugtighed).
  2. Podes planter i henhold til tidslinjen i tabel 1.
CPMV PVX, TMV, og BMV
Dag 0: Plant 3 cowpea frø / pot. Dag 0: Plant ~ 30 N. benthamiana frø / pot. Befrugte en gang om ugen med 1 spiseskefuld gødning / 5 L vand.
Dag 14: Re-pot N. benthamiana ved 1 plante / potte.
Dag 10: Infect blade primære blade med CPMV (5 μg/50 gl / blad) ved mekanisk inokulation med en let aftørring af carborundum. Dag 28: Infect tre til five blade med PVX, TMV, eller BMV (5 μg/50 gl / blad) ved mekanisk inokulation med en let aftørring af carborundum.
Dag 20: Harvest blade og opbevar den i -80 ° C. Dag 42: Harvest blade og opbevar den i -80 ° C.

Tabel 1. Tidslinie for dyrkning, smitter, og høst blade.

Bemærk: Kun CPMV formering påvises som et eksempel.

2. VNP (CPMV, BMV, PVX, og TMV) Oprensning

Bemærk: Alle trin udføres på is eller ved 4 ° C.

  1. Homogenisere 100 g frosne blade i en standard-blender med 2 volumener kold buffer (se tabel 2). Filtreres gennem 2-3 lag ostelærred.
  2. For PVX, justering af pH til 6,5 med 1 M HCI. Tilsæt 0,2% (vægt / vol) ascorbinsyre og 0,2% (vægt / volumen) natrium-sulfite.
  3. Centrifuger rå vegetabilsk homogenatet ved 5500 x g i 20 min. Samle bundfald.
  4. For BMV,. Lag 25 ml supernatant over 5 ml 10% (vægt / volumen) saccharoseopløsning Der centrifugeres ved 9.000 x g i 3 timer og resuspender pellets i 38,5% CsCI-opløsning (w / v). Bland ved rystning i 5 timer og derefter fortsætte med trin 2,12.
  5. Uddrag plantemateriale ved tilsætning af 0,7 volumener 1:1 (v / v) chloroform :1-butanol. Omrør blandingen i 30-60 min.
  6. Centrifuger opløsningen ved 5.500 x g i 20 min. Opsaml den øvre vandige fase.
  7. Tilsættes NaCl til 0,2 M og 8% (vægt / volumen) PEG (MW 8000). For TMV, tilsættes også 1% (v / v) Triton X-100. Der omrøres i mindst 1 time, derefter lade sidde i mindst 1 time.
  8. Centrifuger opløsning ved 15.000 x g i 15 minutter. Resuspender pellet i 10 ml puffer. For PVX, tilsæt 0,1% β-mercaptoethanol og urinstof til 0,5 M.
  9. Centrifuger ved 8.000 x g i 30 minutter og samle bundfald.
  10. Ultracentrifuge supernatanten ved 160.000 x g i 3 timer. Resuspender pellet i 5 ml puffer overnight.
  11. Der fremstilles en 10-40% saccharosegradient med lige store volumener af 10%, 20%, 30% og 40% saccharose i buffer (tungeste først). Tillade gradient for at ækvilibrere natten over ved stuetemperatur.
  12. Ultracentrifuge resuspenderet pellet i løbet saccharosegradient ved 100.000 x g i 2 timer (24 timer for BMV).
  13. Collect lysspredning band og dialyseres mod puffer.
  14. Karakterisere VNPs (nedenfor) og opbevares ved 4 ° C. For langtidsopbevaring, opbevares ved -80 ° C.
CPMV og TMV 0,1 M kaliumphosphatpuffer (pH 7,0)
38,5 mM KH 2 PO 4
61,5 mM K 2 HPO 4
PVX 0,5 M boratpuffer (pH 7,8)
0,5 M borsyre
Justér pH med NaOH
BMV SAMA puffer (pH 4,5)
250 mM natriumacetat
10 mM MgCl2
2 mM β-mercaptoethanol (tilføj ferske)

Tabel 2. Puffere og deres opskrifter for hver VNP.

Bemærk: Kun CPMV formering påvises som et eksempel.

3. VNP (CPMV, BMV, PVX, og TMV) Karakterisering

  1. Udføre UV / synlig spektroskopi til bestemmelse af koncentrationen af ​​VNPs.
    1. Måles absorbansen af ​​2 pi af prøven under anvendelse af en NanoDrop spektrofotometer.
    2. Bestemme koncentrationen af ​​partikler og farvestoffer ved hjælp af Lambert-Beers lov (A = εcl, hvor A er absorbansen, ε er ekstinktionskoefficienten, c er koncentrationen, og l er vejlængden). Vejlængden er 0,1 cm til NanoDrop.
      De VNP-specifikke ekstinktionskoefficienter er:
      CPMV: 8.1 cm-1 mg -1 ml (ved 260 nm)
      PVX: 2,97 cm-1 mg -1 ml (ved 260 nm)
      TMV: 3,0 cm-1 mg -1 ml (ved 260 nm)
      BMV: 5,15 cm-1 mg -1 ml (ved 260 nm)
  2. Analysere partikler ved størrelseseksklusions-hurtig protein-væskechromatografi (FPLC).
    1. Ved anvendelse af en Superose 6 størrelse-eksklusion søjle og ÄKTA Explorer, belastning 50 til 100 ug VNPs i 200 pi 0,1 M kaliumphosphatpuffer (pH 7,0).
    2. Indstil detektorer til 260 nm (nucleinsyre), 280 nm (protein) og excitationsbølgelængden af ​​eventuelle tilknyttede farvestoffer.
    3. Udføres ved en strømningshastighed på 0,5 ml / minut i 72 min.
    4. Elueringsprofilen og A260: A280 nm angiver, om VNP præparatet er rent, og om partiklerne er intakte og samles.
      Følgende A260: 280-forhold indikerer et rent VNP præparat:
      CPMV: 1,8 ± 0,1
      PVX: 1,2 ± 0,1
      TMV:1,1 ± 0,1
      BMV: 1,7 ± ​​0,1
  3. Udføre denaturering (pre-cast NuPAGE) Bis-Tris polyacrylamid 4-12% gradient-gelelektroforese til analyse af renheden af ​​fremstilling og konjugation til enkelte kappeproteiner.
    1. Tilsæt 3 ml 4x LDS prøvebuffer til 10 ug af partiklerne i 9 pi kaliumphosphatpuffer. Tilsættes yderligere 1 ml af 4x LDS prøvebuffer og 3 pi af β-mercaptoethanol til BMV at reducere det store antal disulfidbindinger.
    2. Inkuber i varmeblok i 5 minutter ved 100 ° C.
    3. Indlæse prøver på en SDS-gel.
    4. Køre prøver ved 200 V i 1 time i 1X MOPS kører puffer.
    5. Dokumentere gelen under UV-lys for at visualisere fluorescerende kappeproteiner.
    6. For ikke-fluorescerende protein, farves med Coomassie blue (0,25% (vægt / volumen) Coomassie Brilliant Blue R-250, 30% (v / v) methanol, 10% (volumen / volumen) eddikesyre) i 1 time.
    7. Affarves med 30% methanol, 10% eddikesyre natten over. Change løsningen, hvis det kræves.
    8. Dokumentere gelen under hvidt lys.
  4. Analysere integritet partikler ved transmissionselektronmikroskopi (TEM).
    1. Fortyndes prøver til 0,1-1 mg / ml i 20 pi af DI vand.
    2. Placer 20 ul dråber af prøverne på Parafilm.
    3. Dæk dråber med en TEM gitter og lad sidde i 2 min. Væge det overskydende løsning på nettet med filtrerpapir.
    4. Vask gitter ved at placere på en dråbe af DI vand og derefter fugtspredende tør.
    5. Stain gitter ved at placere en 20 ul dråbe 2% (vægt / vol) uranylacetat i 2 min. Væge det overskydende pletten med filtrerpapir.
    6. Vask gitteret igen i vand.
    7. Overhold net i henhold til en transmissions elektron mikroskop.

4. Kemisk konjugation af VNPs med PEG og fluoroforer, oprensning og karakterisering

  1. For beregninger for de reaktioner nedenfor, er den molære masse af VNPs:
    CPMV: 5,6x 10 6 g / mol
    PVX: 35 x 10 6 g / mol
    TMV: 41 x 10 6 g / mol
    BMV: 4,6 x 10 6 g / mol
  2. Konjugere farvestoffer og PEG til overflader lysiner af CPMV og PVX under anvendelse af en ettrins-N-hydroxysuccinimid koblingsreaktion: Tilføj 2500 molækvivalenter (alle molære overskud vedrører molært overskud pr VNP) af Alexa Fluor 647 succinimidylester og 4500 ækvivalenter af NHS- PEG (molvægt 5.000) opløst i DMSO til CPMV i 0,1 M kaliumphosphatpuffer. Når du arbejder med PVX, tilføje en 10.000 moloverskud af NHS-dye og NHS-PEG. Justere puffer og DMSO volumener så at slutkoncentrationen af ​​CPMV og PVX er 2 mg / ml og DMSO indhold er 10% af det samlede reaktionsvolumen. Inkubere reaktionsblandingen natten over ved stuetemperatur, beskyttet mod lys. CPMV og PVX har 300 og 1.270 adresserbare lysiner hhv. (Læseren henvises til følgende referencer for yderligere læsning omkemisk modifikation af CPMV og PVX: 13-15).
  3. Konjugerede farvestoffer og PEG til tyrosiner af TMV ved diazonium kobling efterfulgt af kobber (I)-katalyseret azid-alkyn cycloaddition.
    1. Forbered diazoniumsalt (alkyn) ved blanding af 400 pi 0,3 M p-toluensulfonsyre-monohydrat, 25 ul 3,0 M natriumnitrit, og 75 ul 0,68 M destilleret 3-ethynylanilin opløst i acetonitril ved 4 ° C i 1 time.
    2. Tilsættes 3,3 ml boratpuffer, pH 8,8, indeholdende 100 mM NaCI til 1,25 ml af TMV (20 mg / ml stamopløsning).
    3. Omsætte TMV med 450 pi af diazoniumsaltet (alkyn) opløsning i et isbad i 3 timer for at tilføje en alkyn ligering håndtag til TMV af diazonium-kobling. Løsningen bliver til en lys brun farve. TMV har 2.140 tilgængelige tyrosiner til konjugering.
    4. Oprense slutproduktet under anvendelse af en saccharosepude som beskrevet i trin 4.4.
    5. Vedhæfte azid-funktionelle Alexa Fluor 647 og PEG-azid (molvægt 5.000) using kobber (I)-katalyseret azid-alkyn cycloaddition (CuAAC). Tilsættes 2 ækvivalenter af farvestof-og PEG-azid pr kappeprotein og inkuberes med 1 mM CuSO4, 2 mM AMG og 2 mM natriumascorbat ved stuetemperatur i 15 minutter. Juster buffervolumen således at den endelige reaktion koncentrationen af ​​TMV er 2 mg / ml. (Læseren henvises til følgende referencer for yderligere læsning om kemisk modifikation af TMV: 16,17).
  4. Konjugere farvestoffer til lysiner og PEG til cysteiner i BMV cystein-mutant (cBMV):
    1. Læg 2000 molækvivalenter Oregon Green 488 succinimidylester opløst i DMSO til cBMV i 0,1 M TNKM puffer (50 mM Tris-base, 50 mM NaCI, 10 mM KCI, 5 mM MgCl2, pH 7,4). Justere puffer og DMSO volumener, således at slutkoncentrationen af ​​BMV er 1 mg / ml og DMSO indhold er 10% af det samlede reaktionsvolumen. Inkubere reaktionsblandingen natten over ved 4 ° C beskyttet mod lys.
    2. Purify partikler under anvendelse af centrifugal filtre som beskrevet i trin 4,4.
    3. Læg 2000 molært overskud af PEG-maleimid (MW 2000) ved anvendelse af de samme reaktionsbetingelser som før og inkuberes reaktionsblandingen i 2 timer ved 4 ° C. cBMV har 180 reaktive lysiner og cysteiner. (Læseren henvises til følgende referencer for yderligere læsning om kemisk modifikation af BMV: 18).
  5. Oprensning: sendes gennem en 40% (vægt / vol) saccharosepude ved 160.000 x g i 2,5 timer. Genopløses pelletten i buffer. Alternativt kan dialyseres mod passende buffer med 10 kDa cut-off spin-filtre.
  6. Karakterisering: PEGylerede og fluorescens-mærkede VNPs analyseres ved anvendelse af de ovenfor beskrevne fremgangsmåder: UV / synlig spektroskopi, SDS-gelelektroforese, FPLC, og TEM (ikke vist, men se figur 6 og 7).

5. Tumormålretning og Imaging ved hjælp af en mus xenograft model

  1. Culture HT-29 humane coloncancer-celler i RPMI-medium suppleret med 5% FBS, 1% penicillin-streptomycin og 1% L-glutamin ved 37 ° C i 5% CO2 ved hjælp 175 cm2 cellekultur kolber.
  2. Vask cellerne to gange med sterilt PBS og høst ved inkubering med 5 ml trypsin-EDTA ved 37 ° C i 5 minutter. Inaktivere trypsinet med 5 ml RPMI-medium. Opsaml cellerne ved centrifugering ved 500 x g i 5 min. ved 4 ° C og resuspender i frisk RPMI ved 5x10 6 celler/50 pi medium (bestemmelse totale celletælling ved hjælp af trypanblåt og et hæmocytometer). Blandes med et tilsvarende volumen matrigel før injektion (holde alle opløsninger og reagenser sterilt).
  3. Tilvejebringer seks uger gamle NCR nu / nu mus og fastholde dem på en lucerne fri kost i 2 uger. [Bemærk:. Alle dyreforsøg skal IACUC godkendt] Induce tumorxenotransplantater ved subkutan injektion af 5x10 6 celler/100 gl / tumor i flankerne (2 tumorer / mus) under anvendelse af en 18 1/2 gauge sterilenål. Overvåge dyrene regelmæssigt. Måling af tumorstørrelsen anvendelse af en skydelære og tillade tumorerne vokse til en gennemsnitlig volumen på 20 mm 3 (inden for de næste 12 dage). Tildel mus til to forskellige grupper tilfældigt: PBS og VNP (n = 3 dyr / gruppe / tidspunkt). Under anvendelse af en 1 ml 28 gauge insulinsprøjte ved intravenøs haleveneinjektion 100 ul sterilt PBS eller 10 mg / kg VNP formulering administrere.

Bemærk: vævskulturer eksperimenter og undersøgelser med levende dyr ikke bliver demonstreret. Hands-on demonstration vil blive begrænset til vævsbehandling og dataopsamling. For en henvisning HT-29 tumor xenograft model, der henvises læseren til ref. 19

Tre teknikker bruges til at evaluere tumor homing af VNPs:

  1. Fluorescensimagografi ved hjælp Maestro Imaging System: Sacrifice mus på forskellige tidspunkter (2, 24 og 72 timer) under anvendelse af CO2gas. Dissekere dyr og punktafgifter alle større organer (hjerne, hjerte, lunger, milt, nyrer og lever) sammen med de tumorer på flankerne, skal du placere det væv på parafilm, og analysere med fluorescensimagografi instrument ved hjælp af gule excitation og emission filtre (800 ms eksponering) at detektere tilstedeværelsen af ​​fluorescerende signaler i vævene (afledt fra A647 label konjugeres til VNPs). Gem billederne og analysere fluorescerende intensiteter hjælp ImageJ 1.44o software ( http://imagej.nih.gov/ij ). Sammenligne mønster af optagelse af VNPs i tumorer med andre vigtige væv med tiden.
  2. Efter billeddannelse, skæres hvert væv i halve og integrere den ene halvdel i OCT-forbindelse for cryo-sektionering og konfokal analyse. Saml den anden halvdel i tarerede cryo-hætteglas og straks fryse dem ved hjælp af væske N 2. Opbevares ved -80 ° C indtil parat til yderligere behandling.
  3. Fluorescens kvantificering: Reledningen væv vægte. Optø frosne væv ved stuetemperatur og anbring dem i separate 50 ml Falcon-rør indeholdende 1 ml PBS. Ved hjælp af en håndholdt vævshomogenisator, homogenisere vævet i 2-3 minutter i PBS derefter overføre homogenatet til mikrofugerør. Centrifuger homogenaterne i 10 minutter ved 13.000 x g for at fjerne ikke-homogeniseret væv.
  4. Afpipettér 100 pi af supernatanten fra væv fra hver gruppe (PBS og VNP formuleringer / tidspunkter) i en 384 brønde sort UV plade. Evaluere fluorescensintensitet (Ex / Em bølgelængder 600/665) under anvendelse af en pladelæser. Normalisere de opnåede fluorescerende værdier fra de væv vægte.
  5. Immunhistokemi: Forbered cryo-mikrotom sektioner (10 um) og opbevares ved -20 ° C. Stain vævssnit for cellekerner (DAPI) og endothelceller markør (FITC-mærket anti-muse CD31-antistof). Udføre konfokal mikroskopi analyse til at kortlægge den vaskulære og intra-tumorale lokalisering af fluorescens-mærket VNPs.

Bemærk: Denne procedure vil ikke blive demonstreret, er repræsentative data vist i figur 8. For en reference til immunohistokemi og de ​​beskrevne farvningsfremgangsmåder, der henvises læseren til ref. 19

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Denne protokol giver en tilgang til den kemiske modifikation af VNPs og deres anvendelse til in vivo tumorafbildning. De dyr fluorescensimagografi, fluorescens kvantificering, og immunhistokemi teknikker præsenteres her, er anvendelige til at studere biodistribution og evaluering tumor homing. Disse teknikker giver værdifulde oplysninger om adgang for nanopartikler til tumoren via EPR effekt. Ved at kombinere resultaterne fra de forskellige analysemetoder, får vi en stærk fremgangsmåde til evaluering af lokalisering og biofordeling af VNPs.

Før disse undersøgelser kan udføres men det er vigtigt at opnå en ren viruspræparat. Bortset fra mekanisk inokulation, et muligt alternativ til VNP formering er agroinfiltration, som kan have en høj omdannelse og akkumulering rate. Når formering af VNPs, bør der udvises omhu for at holde planterne inficeret med forskellige vira separat som to undgå krydskontaminering. Især er TMV let sprede sig og overføres mekanisk. Et andet afgørende skridt til at være opmærksomme på foretager virus oprensning på is eller ved 4 ° C. Alle puffere bør anvendes iskold. Den lave temperatur er nødvendig for at undgå skade på de VNPs som følge af proteaser og oxiderende enzymer til stede i plantematerialet.

Lave udbytter af oprensede VNPs kan stamme fra flere faktorer. En mulig årsag kunne være en alder af de VNPs benyttes til opformering. Det foretrækkes at anvende nyere viruspræparater. For eksempel er de C-terminale 24 aminosyrer i S kappeprotein af CPMV nødvendige til undertrykkelse af gen-nedregulering. Deletion af denne overflade-eksponerede område sker med tiden på grund af proteolyse. Selvom strukturen og stabiliteten af ​​CPMV ikke påvirkes, væksthæmning og forsinket spredning af virus resultaterne. En anden kilde til lave udbytter er tab af VNPs under oprensning. Især vedtention bør gives til ophvirvling skridt efter PEG nedbør. Ufuldstændig resuspension af pelleten ville resultere i VNP tabt i pelleten af ​​den efterfølgende centrifugering.

Samlet set bioconjugation kemier præsenteres her, er ligetil. 14,17,18,21 Karakteriseringsfaktorerne beskrevne metoder er værdifulde for at sikre partikel integritet og bestemme omfanget af konjugation. Molære overskud kan justeres afhængig af anvendelsen og graden af ​​funktionalisering ønskes.

Når man arbejder med musen xenograft model er den mest afgørende praksis efter aseptisk teknik. Desuden er haleveneinjektion et kritisk trin for at sikre en ensartet prøve dosis for hver mus. Det kan hjælpe at placere halen i varmt vand på forhånd til at spile venen. En anden overvejelse er autofluorescens til fluorescensimagografi og målinger. Generelt væv autofluorescens er minimized over 600 nm, hvilket gør lange bølgelængde farvestoffer med emission maxima over 600 nm optimale som den billeddannende probe. Imidlertid normale muse kost består af klorofyl-indeholdende alfalfa, som også fluorescerer rødt. Som følge heraf er det nødvendigt at opretholde de mus på en lucerne fri diæt i mindst to uger for at reducere baggrundssignaler. Endelig skal det bemærkes, at fluorescensdetektion hjælp fluorescensimagografi er begrænset på grund af forskelle i de spredning og absorption miljøer i de forskellige væv. Følgelig er billeddannelse anvendes til visualisering og som en første fremgangsmåde til overvågning biofordeling, når kvantificeringen udføres under anvendelse af vævshomogenater.

Nogle fordele ved anvendelse VNPs som platform teknologi er deres monodispersitet, biokompatibilitet, evne til opskalering produktion og tilgængelighed for flere funktionalisering strategier. Ud over kemiingeniør, er genteknologi illustreret her med indførelsention af cysteiner at BMV som mål for bioconjugation. Genteknologi kan også anvendes til at indføre målretning peptider eller affinitetsmærker. Mens den beskrevne protokol anvender dual-mærket (farvestof og PEG) partikler, der løbende undersøgelser ser på at indføre supplerende funktionaliteter (dvs. terapi og målretning) for at forbedre vævsspecificitet og terapeutisk effekt. Således er denne fremgangsmåde lægger grunden for fremtidige biomedicinske anvendelser.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Ingen interessekonflikter erklæret.

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet af NIH / NIBIB tilskud R00 EB009105 (til NFS) og P30 EB011317 (til NFS), en NIH / NIBIB træning tilskud T32 EB007509 (til AMW), en Case Western Reserve University Interdisciplinary Alliance Investment Grant (til NFS), og en Case Omfattende Cancer Center tilskud P30 CA043703 (til NFS). Vi takker Steinmetz Lab bachelorstuderende forskere for deres hands-on support: Nadia Ayat, Kevin Chen, Sourav (Sid) Dey, Alice Yang, Sam Alexander, Craig D'Cruz, Stephen Hern, Lauren Randolph, Brian Så og Paul Chariou .

Materials

Name Company Catalog Number Comments
VNP production
Indoor plant chamber Percival Scientific E-41L2
V. unguiculata seeds (California black-eye no. 5) Burpee 51771A
N. benthamiana seeds N. benthamiana seeds were a gift from Salk Institute. Seeds are produced through plant propagation.
Carborundum Fisher C192-500
Pro-mix BX potting soil Premier Horticulture 713400
Jack's Professional 20-10-20 Peat-Lite Fertilizer JR Peters 77860
Equipment
50.2 Ti rotor Beckman 337901
SW 32 Ti rotor Beckman 369694
Optima L-90K ultracentrifuge Beckman 365672
SLA-3000 rotor Thermo Scientific 07149
SS-34 rotor Thermo Scientific 28020
Sorvall RC-6 Plus centrifuge Thermo Scientific 46910
Polypropylene bottle Beckman 355607 For SLA-3000 rotor
Polycarbonate bottle Beckman 357002 For SS-34 rotor
Ultra-Clear tube Beckman 344058 For sucrose gradient and SW 32 Ti rotor
Polycarbonate bottle Beckman 355618 For pelleting and 50.2 Ti rotor
NanoDrop spectrophotometer Thermo Scientific NanoDrop2000c
PowerEase 500 pre-cast gel system Invitrogen EI8675EU
Superose 6 10/300 GL (24 ml) size-exclusion column GE Healthcare 17-5172-01
ÄKTA Explorer 100 Chromatograph GE Healthcare 28-4062-66
Allegra X-12R Beckman 392302 Benchtop centrifuge
Cryostat Leica CM1850
Maestro 2 Caliper Life Sciences In vivo imaging system
Tissue-Tearor Biospec Products 985370-395
Microplate reader Tecan Infinite-200
Transmission electron microscope ZEISS Libra 200FE
FluoView laser scanning confocal microscope Olympus FV1000
Chemicals and Reagents
3-ethynylaniline Sigma Aldrich 498289-5G
384 well black plate BD Biosciences 353285
4-12% Bis-Tris NuPAGE SDS gel Invitrogen NP0321BOX
4X LDS sample buffer Invitrogen NP0008
Acetic Acid Fisher A385-500
Acetonitrile Sigma Aldrich 271004-1L
Alexa Fluor 647 azide Invitrogen A10277
Alexa Fluor 647 carboxylic acid, succinimidyl ester Invitrogen A20006
Amicon Ultra-0.5 ml Centrifugal Filters Millipore UFC501096 10 kDa cut-off
Aminoguanidine hydrochloride Acros Organics 36891-0250
Boric acid Fisher A74-500
Coomassie Brilliant Blue R-250 Fisher BP101-25
CsCl Acros Organics 42285-1000
DAPI MP Biomedicals 157574
Dimethyl sulfoxide Fisher BP231-100
Filter paper Fisher 09-801K P5 grade
FITC anti-mouse CD31 BioLegend 102406
Goat serum Invitrogen 16210-064
KCl Fisher BP366-500
L-ascorbic acid sodium salt Acros Organics 35268-0050
Methanol Fisher A412P-4
MgCl2 Fisher BP214-500
Microscope slides Fisher 12-544-3
Microscope cover glass VWR 48366-277
MOPS buffer Invitrogen NP0001
mPEG-mal Nanocs PG1-ML-2k MW 2000
mPEG-N3 Nanocs PG1-AZ-5k MW 5000
mPEG-NHS Nanocs PG1-SC-5k MW 5000
NaCl Fisher BP358-212
Oregon Green 488 succinimidyl ester *6-isomer* Invitrogen O-6149
p-toluenesulfonic acid monohydrate Acros Organics 13902-0050
Permount Fisher SP15-100
Potassium phosphate dibasic Fisher BP363-1
Potassium phosphate monobasic Fisher BP362-1
Sodium acetate Fisher BP333-500
Sodium nitrite Acros Organics 42435-0050
Sodium sulfite Amresco 0628-500G
Sucrose Fisher S6-500
TEM grid Ted Pella FCF-400Cu
Tris base Fisher BP152-500
Triton X-100 EMD Chemicals TX1568-1
β-mercapt–thanol Fisher O3446I-100
Tissue Culture
Fetal bovine serum Invitrogen 12483-020
Hemocytometer Fisher 0267110
HT-29 cells ATCC HTB-38
L-glutamine Invitrogen 25030-080
PBS Cellgro 21-040-CV
Penicillin-streptomycin Invitrogen 10378-016
RPMI-1640 Invitrogen 31800-089
Tissue culture flasks Corning 431080 175 cm2
Trypan Blue Thermo Scientific SV30084.01
Trypsin, 0.05% (1X) with EDTA 4Na, liquid Invitrogen 25300-054
Animal Studies
18% Protein Rodent Diet Harlan Teklad Teklad Global 2018S Alfalfa free diet
Insulin syringe BD Biosciences 329410 28 gauge
Isoflurane Baxter AHN3637
Matrigel Matrix basement membrane BD Biosciences 356234
NCR nu/nu mice CWRU School
of Medicine Athymic Animal and Xenograft Core Facility
Sterile syringe BD Biosciences 305196 18 1/2 gauge
Tissue-Tek CRYO-OCT Compound Andwin Scientific 4583

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Description of Plant Viruses [Internet]. Association of Biologists. Warwick, UK. Available from: http://dpvweb.net/ (2012).
  2. Carrillo-Tripp, M., Shepherd, C. M., Borelli, I. A., Venkataraman, S., Lander, G., Natarajan, P., Johnson, J. E., Brooks, C. L., Reddy, V. S. VIPERdb2: an enhanced and web API enabled relational database for structural virology. Nucl. Acids Res. 37, 436-442 (2009).
  3. Pokorski, J. K., Steinmetz, N. F. The art of engineering viral nanoparticles. Mol. Pharm. 8, 29-43 (2011).
  4. Steinmetz, N. F., Lin, T., Lomonossoff, G. P., Johnson, J. E. Structure-based engineering of an icosahedral virus for nanomedicine and nanotechnology. Curr. Top Microbiol. Immunol. 327, 23-58 (2009).
  5. Jung, B., Rao, A. L., Anvari, B. Optical Nano-Constructs Composed of Genome-Depleted Brome Mosaic Virus Doped with a Near Infrared Chromophore for Potential Biomedical Applications. ACS Nano. (2011).
  6. Leong, H. S., Steinmetz, N. F., Ablack, A., Destito, G., Zijlstra, A., Stuhlmann, H., Manchester, M., Lewis, J. D. Intravital imaging of embryonic and tumor neovasculature using viral nanoparticles. Nat. Protoc. 5, 1406-1417 (2010).
  7. Leopold, P. L., Ferris, B., Grinberg, I., Worgall, S., Hackett, N. R., Crystal, R. G. Fluorescent virions: dynamic tracking of the pathway of adenoviral gene transfer vectors in living cells. Hum. Gene Ther. 9, 367-378 (1998).
  8. Lewis, J. D., Destito, G., Zijlstra, A., Gonzalez, M. J., Quigley, J. P., Manchester, M., Stuhlmann, H. Viral nanoparticles as tools for intravital vascular imaging. Nat. Med. 12, 354-360 (2006).
  9. Steinmetz, N. F., Ablack, A. L., Hickey, J. L., Ablack, J., Manocha, B., Mymryk, J. S., Luyt, L. G., Lewis, J. D. Intravital imaging of human prostate cancer using viral nanoparticles targeted to gastrin-releasing Peptide receptors. Small. 7, 1664-1672 (2011).
  10. Wu, C., Barnhill, H., Liang, X., Wang, Q., Jiang, H. A new probe using hybrid virus-dye nanoparticles for near-infrared fluorescence tomography. Optics Communications. 255, 366-374 (2005).
  11. Steinmetz, N. F., Cho, C. F., Ablack, A., Lewis, J. D., Manchester, M. Cowpea mosaic virus nanoparticles target surface vimentin on cancer cells. Nanomedicine (Lond). 6, 351-364 (2011).
  12. Maeda, H., Wu, J., Sawa, T., Matsumura, Y., Hori, K. Tumor vascular permeability and the EPR effect in macromolecular therapeutics: a review. Journal of Controlled Release. 65, 271-284 (2000).
  13. Chatterji, A., Ochoa, W., Paine, M., Ratna, B. R., Johnson, J. E., Lin, T. New addresses on an addressable virus nanoblock: uniquely reactive Lys residues on cowpea mosaic virus. Chem. Biol. 11, 855-863 (2004).
  14. Steinmetz, N. F., Mertens, M. E., Taurog, R. E., Johnson, J. E., Commandeur, U., Fischer, R., Manchester, M. Potato virus X as a novel platform for potential biomedical applications. Nano Lett. 10, 305-312 (2010).
  15. Wang, Q., Lin, T., Tang, L., Johnson, J. E., Finn, M. G. Icosahedral virus particles as addressable nanoscale building blocks. Angew. Chem. Int. Ed. 41, 459-462 (2002).
  16. Bruckman, M. A., Kaur, G., Lee, L. A., Xie, F., Sepulveda, J., Breitenkamp, R., Zhang, X., Joralemon, M., Russell, T. P., Emrick, T., Wang, Q. Surface modification of tobacco mosaic virus with "click" chemistry. Chembiochem. 9, 519-523 (2008).
  17. Schlick, T. L., Ding, Z., Kovacs, E. W., Francis, M. B. Dual-surface modification of the tobacco mosaic virus. J. Am. Chem. Soc. 127, 3718-3723 (2005).
  18. Yildiz, I., Tsvetkova, I., Wen, A. M., Shukla, S., Masarapu, M. H., Dragnea, B., Steinmetz, N. F. Engineering of Brome mosaic virus for biomedical applications. RSC Advances. (2012).
  19. Brunel, F. M., Lewis, J. D., Destito, G., Steinmetz, N. F., Manchester, M., Stuhlmann, H., Dawson, P. E. Hydrazone ligation strategy to assemble multifunctional viral nanoparticles for cell imaging and tumor targeting. Nano Lett. 10, 1093-1097 (2010).
  20. Shukla, S., Ablack, A., Wen, A., Lee, K., Lewis, J., Steinmetz, N. F. Increased tumor homing and tissue penetration of the filamentous plant viral nanoparticle Potato virus X. Molecular Pharmaceutics. (2012).
  21. Chatterji, A., Ochoa, W., Shamieh, L., Salakian, S. P., Wong, S. M., Clinton, G., Ghosh, P., Lin, T., Johnson, J. E. Chemical conjugation of heterologous proteins on the surface of Cowpea mosaic virus. Bioconjug. Chem. 15, 807-813 (2004).
Virale Nanopartikler for<em&gt; In vivo</em&gt; Tumor Imaging
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wen, A. M., Lee, K. L., Yildiz, I., Bruckman, M. A., Shukla, S., Steinmetz, N. F. Viral Nanoparticles for In vivo Tumor Imaging. J. Vis. Exp. (69), e4352, doi:10.3791/4352 (2012).More

Wen, A. M., Lee, K. L., Yildiz, I., Bruckman, M. A., Shukla, S., Steinmetz, N. F. Viral Nanoparticles for In vivo Tumor Imaging. J. Vis. Exp. (69), e4352, doi:10.3791/4352 (2012).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter