Summary
植物病毒粒子（VNPs），是有前途的平台，在生物医学中的应用。在这里，我们将介绍程序植物VNP传播，净化，表征和生物标记。最后，我们的应用VNPs肿瘤归巢和成像用小鼠移植瘤模型和荧光成像。
Abstract
纳米材料的使用有可能彻底改变材料科学和医学。目前，正在调查一些不同的纳米粒子成像和治疗中的应用。来自植物的病毒粒子（VNPs）可以被视为与定义的尺寸和形状的自组装bionanomaterials。植物病毒正在调查在斯坦梅茨实验室包括二十面体由豇豆花叶病毒 （CPMV）， 雀麦花叶病毒 （BMV），这两者都是在直径为30nm的颗粒。我们也正在开发棒状，丝状的结构衍生从下列植物病毒： 烟草花叶病毒 （TMV），其形成为300nm的尺寸为18nm，和马铃薯X病毒 （PVX），形成丝状颗粒515与刚性杆在长度和宽度为13 nm的纳米（读取器被称为文献。VNPs进一步信息的1和2）。
在植物易于大规模生产，异常稳定的，和生物相容性。此外，VNPs“可编程”的单位，可专门设计使用遗传修饰或化学生物耦合方法3。原子分辨率的结构VNPs是众所周知的，并且可以进行修改与空间精度在原子水平上4，一定程度的控制不能使用合成纳米材料与当前国家的最先进的技术来实现的。
在本文中，我们描述了CPMV，PVX，TMV，和BMV， 豇豆ungiuculata和烟草植物的繁殖。 VNP对每个提取和纯化协议。纯化和化学标记VNPs表征方法描述。在这项研究中，我们专注于通道emical标签VNPs与荧光团（ 如的Alexa Fluor 647）和聚乙二醇（PEG）。该染料促进VNPs 5-10的跟踪和检测，和PEG降低免疫原性的蛋白质纳米粒子，同时增强其药动学8,11。我们展示的聚乙二醇化VNPs使用小鼠移植瘤模型的肿瘤归巢。组织体外荧光成像技术的使用Maestro成像系统，荧光定量同质化组织，和共聚焦显微镜的组合被用于研究生物分布。 VNPs通过网状内皮系统（RES）被清零;肿瘤归巢实现被动地通过增强的渗透性和保持率（EPR）效果12。 “的VNP纳米技术是强大的插件和播放技术，图像和治疗的疾病在体内网站。我们进一步发展VNPs携带药物的货物和临床相关的摄像部分，以及组织特异性的配体目标分子的受体过度表达，在癌症和心血管疾病。
Protocol
1。 VNP（CPMV，BMV，PVX和TMV）的传播
- 将室内植物室设置的控制，以每天15小时（100％光，25°C，湿度为65％）和9小时的夜间（0％光，22°C，湿度60％）。
- 根据表1中的时间线，接种植物。
| CPMV | PVX，TMV，BMV |
| 0三厂豇豆种子/罐。 | 0天：植物〜30的本生种子/锅。施肥每周一次用1汤匙的肥料/ 5升的水。 |
| 第14天：重新锅本生1株/罐。 | |
| 第10天：感染主要与CPMV（500μg/50μL/叶）叶通过机械接种使用的光尘的碳化硅离开。 | 第28天：感染到f香港专业教育学院叶TMV，PVX，或BMV（5μg/50μL/叶）通过机械接种使用的光尘的碳化硅。 |
| 第20天：收获的叶子和储存在-80°C。 | 第42天：收获的叶子和储存在-80°C。 |
表1。时间轴越来越大，感染，收获的叶子。
注意：仅CPMV传播表明作为一个例子。
2。 VNP（CPMV，BMV，PVX和TMV）净化
注：所有步骤都在冰上或4℃。
- 均质100g的冷冻用2倍体积的冷缓冲液（ 见表2）在一个标准搅拌机叶片。通过2-3层纱布过滤。
- PVX的，调整pH值至6.5，用1 M HCl。加入0.2％（w / v的）抗坏血酸和0.2％（重量/体积）硫酸钠sulfi德。
- 在5,500 xg离心20分钟，离心粗制植物匀浆。收集上清。
- 对于BMV，层25毫升上清液中超过5毫升的10％（重量/体积）蔗糖溶液。离心机在9000 XG CsCl溶液中的38.5％（W / V）为3小时，并重新悬浮颗粒。混合振荡5小时，然后继续执行步骤2.12。
- 提取植物材料，通过添加0.7体积的1:1（体积/体积）氯仿:1-丁醇。搅拌混合物30-60分钟。
- 在5,500 xg下20分钟的离心溶液。收集上层水相。
- 添加NaCl至0.2 M和8％（重量/体积）的PEG（分子量8000）。对于烟草花叶病毒，还可以添加1％（体积/体积）的Triton X-100。搅拌至少1小时，然后让参加至少1小时。
- 以15,000 xg离心15分钟的离心溶液。在10毫升的缓冲液重悬沉淀。 PVX的，0.1％β-巯基乙醇和尿素添加到0.5M
- 8000 xg离心30分钟，离心收集上清。
- 超速离心机上清液在160,000 xg离心3小时。重悬浮颗粒在5毫升缓冲Øvernight。
- 用等体积的10％，20％，30％，和40％的蔗糖缓冲液中（最重的第一）准备一个10-40％的蔗糖密度梯度。允许该梯度以在室温下平衡过夜。
- 超速在10万XG蔗糖密度梯度悬浮颗粒超过2小时（24小时BMV）。
- 收集散射光带和透析对缓冲区。
- 特性VNPs（下图），并存储在4°C。对于长期储存，储存在-80°C。
| CPMV和TMV | 0.1M磷酸钾缓冲液（pH7.0） 38.5毫米KH 2 PO 4 61.5毫米K 2 HPO 4 |
| PVX | 0.5M的硼酸盐缓冲液（pH7.8）中 0.5 M硼酸 用NaOH调节pH值 |
| BMV | SAMA缓冲液（pH4.5） 250 mM乙酸钠 的10mM的MgCl 2 2毫米β-巯基乙醇（补充新鲜） |
表2。每个VNP的缓冲器和他们的食谱。
注意：仅CPMV传播表明作为一个例子。
3。 VNP（CPMV，BMV，PVX和TMV）表征
- 执行UV /可见光谱来确定浓度的VNPs。
- 测量使用的NanoDrop分光光度计2μl的样品的吸光度。
- 确定使用Beer-Lambert定律（A =εcl，其中A为吸光度的颗粒和染料的浓度，ε是消光系数，c是浓度，和l是路径长度）。的路径长度是的NanoDrop0.1厘米。
的的VNP特定消光系数是：
CPMV：8.1厘米-1毫克-1毫升（波长为260 nm）
PVX：2.97厘米-1毫克-1毫升（在260 nm）
TMV：3.0厘米-1毫克-1毫升（波长为260 nm）
BMV：5.15厘米-1毫克-1毫升（在260 nm）
- 分析颗粒尺寸排阻快速蛋白质液相色谱（FPLC）。
- 使用的Superose 6尺寸排阻柱和ÄKTA资源管理器中，负载50-100微克VNPs在200μl的0.1M磷酸钾缓冲液（pH7.0）中。
- 设置探测器，260 nm处（核酸），280nm的（蛋白质），和附加任何染料的激发波长。
- 72分钟，在0.5毫升/分钟的流速运行。
- 流出曲线和A260：A280 nm的表示，，VNP准备是否是纯粹的粒子是否完整和组装。
A260：280比表示一个纯粹的VNP准备：
CPMV：1.8±0.1
PVX：1.2±0.1
TMV：1.1±0.1
BMV：1.7±0.1
- 执行变性（预铸的NuPAGE）的Bis-Tris聚丙烯酰胺4-12％梯度凝胶电泳分析单独的衣壳蛋白的制备和共轭的纯度。
- 将3毫升的4倍LDS样品缓冲液添加到10μg9微升磷酸钾缓冲液中的颗粒。添加一个额外的1μl的4倍LDS样品缓冲液的β-巯基乙醇和3μlBMV，以减少大量的二硫键。
- 孵育5分钟，在100℃，在热块
- 将样到SDS凝胶。
- 运行1小时，1×MOPS电泳缓冲液样品在200 V。
- 文件的凝胶在紫外光下观察荧光外壳蛋白。
- 对于非荧光蛋白，用考马斯亮蓝（0.25％（重量/体积）考马斯亮蓝R-250，30％（体积/体积）甲醇，10％（体积/体积）乙酸）处理1小时染色。
- 脱色，用30％甲醇，10％乙酸中过夜。陈GE的解决方案，如果需要的话。
- 记录在白色灯光下的凝胶。
- 分析通过透射电子显微镜（TEM）的粒子的完整性。
- 0.1-1毫克/毫升DI水在20μl稀释样品。
- 将20微升滴封口膜的样品。
- 包括滴用TEM网格，让坐2分钟。威克关闭在网格上的多余的溶液用滤纸。
- 格下降DI水，然后放置在排汗干洗净。
- 染色网格通过放置在20微升的2％（重量/体积）的下拉醋酸双氧铀，持续2分钟。威克掉多余的污点用滤纸。
- 电网再次在水中洗净。
- 透射型电子显微镜下的观察网格。
4。 PEG和荧光，纯化，表征与化学结合的VNPs
- 对于下面的反应中的计算，摩尔质量的VNPs是：
CPMV：5.6×10 6 g / mol的
PVX：35×10 6 g / mol的
TMV：41×10 6 g / mol的
BMV：4.6×10 6 g / mol的 - 染料和PEG共轭表面赖氨酸CPMV和PVX使用一个单步的N-羟基琥珀酰亚胺基碳酸酯偶联反应：加入2500摩尔当量（所有摩尔过量是指摩尔过量每VNP）的Alexa Fluor 647琥珀酰亚胺基酯和4500当量的NHS- PEG（分子量5000）溶解在DMSO中CPMV在0.1M磷酸钾缓冲液。工作时，PVX，增加了10000摩尔过量的的NHS-染料和NHS-PEG。调整使得CPMV和PVX的最终浓度为2毫克/毫升和DMSO的含量为10％的总反应体积的缓冲液和DMSO卷。孵育反应混合物在室温避光过夜。 CPMV和PVX分别有300和1270寻址赖氨酸，。 （ 进一步阅读的读者可以参考下面的参考化学修饰CPMV和PVX：13日至15日 ）。
- 其次是铜（Ⅰ）催化叠氮炔环加成反应的共轭染料和PEG对TMV的酪氨酸重氮耦合。
- 准备重氮盐（炔）通过混合400微升0.3M的p-甲苯磺酸一水合物，25微升3.0 M亚硝酸钠，和75微升68万蒸馏的3 -乙炔基苯胺溶解在乙腈中，在4℃下1小时。
- 加入3.3毫升的硼酸盐缓冲液，pH 8.8，含有100mM NaCl的烟草花叶病毒的1.25毫升（20毫克/毫升原液）。
- 起反应用450微升的重氮盐（炔）溶液在冰浴中3小时添加的炔结扎处理由重氮耦合花叶病毒烟草花叶病毒。该解决方案将变成浅棕色的颜色。 TMV 2140提供酪氨酸结合。
- 纯化的最终产物，在步骤4.4中所描述使用蔗糖座垫。
- 附加的Alexa Fluor 647叠氮化物的功能和PEG-叠氮化物（MW 5000）全光照克铜（Ⅰ）催化的叠氮化物 - 炔环加成（CuAAC）。加入2当量的染料和PEG-磷酰基叠氮化物的每外壳蛋白并孵育1 mM的CuSO 4的 ，2mM的AMG，和2mM抗坏血酸钠，在室温下15分钟。调整缓冲体积使得TMV的最终的反应浓度为2毫克/毫升。 （ 读者可以参考以下化学修饰的烟草花叶病毒的进一步阅读的参考：16,17）。
- 共轭染料到赖氨酸和PEG BMV半胱氨酸突变体（cBMV）半胱氨酸：
- 添加2000摩尔当量的在0.1M TNKM缓冲液（50mM的Tris碱，50毫摩尔NaCl，10 mM KCl中，5毫摩尔MgCl 2，pH值7.4）溶解在DMSO中cBMV俄勒冈绿488琥珀酰亚胺基酯。调整这样的BMV的最终浓度为1毫克/毫升和DMSO的含量为10％的总反应体积的缓冲液和DMSO卷。孵育反应混合物过夜，在4℃下避光保存。
- 净化颗粒离心遁走曲的过滤器，在步骤4.4所述。
- 加入2000摩尔过量的PEG-马来酰亚胺（分子量2,000）如前使用的相同的反应条件下，孵育2小时，将反应混合物在4℃下cBMV有180反应赖氨酸和半胱氨酸。 （读者可以参考下面引用的BMV化学改性的进一步阅读：18）。
- 纯化：通过该解决方案通过在160,000 xg下2.5小时的40％（重量/体积）蔗糖坐垫。重新溶解在缓冲液中的颗粒。另外，适当的缓冲液透析对10 kDa的截止离心过滤。
- 表征：分析PEG化和荧光标记的VNPs 然而，使用上述的方法：UV /可见光光谱，SDS凝胶电泳，FPLC，和透射电子显微镜（ 未示出，请参阅图6和图7）。
5。用小鼠移植瘤模型的肿瘤靶向性和成像
- 文化HT-29人结肠癌细胞的RPMI培养基中补充了5％FBS，1％青霉素-链霉素，1％L-谷氨酰胺，在37℃下在5％CO 2用175厘米2细胞培养瓶中。
- 洗细胞两次，用无菌PBS和收获，用5ml的胰蛋白酶-EDTA在37℃下孵育5分钟。用5毫升的RPMI培养基中，失活胰蛋白酶。经离心分离，在500×g离心5分钟收集细胞。在4℃下，在5×10 6 cells/50微升培养基（确定总细胞计数使用台盼蓝（trypan blue）和血细胞计数）重悬在新鲜RPMI。用等体积的基底膜混合之前注射（查看所有的解决方案和试剂保持无菌）。
- 采购六周龄NCR nu / nu小鼠和维护他们上了苜蓿饮食2周。 [注：所有动物的程序必须IACUC批准。皮下注射诱导肿瘤异种移植5×10 6 cells/100μL/肿瘤的侧面（2肿瘤/鼠标）18 1/2号无菌针。定期监视的动物。使用游标卡尺测量肿瘤的大小，使肿瘤生长的平均量为20毫米3（在接下来的12天之内）。将小鼠两个不同的组：PBS和VNP（N = 3只/组/时间点）。使用1毫升28压力表胰岛素注射器，管理由静脉尾静脉注射100微升无菌PBS或10毫克/公斤，VNP制剂。
注：组织培养实验和研究活的动物将无法得到证实。示范将被限制在组织处理和数据采集。对于一个参考对HT-29肿瘤异种移植模型上，读者被称为文献19中
三种技术被用来评估肿瘤归巢VNPs：
- 荧光成像在不同的时间点（2，24和72小时），使用CO 2 使用Maestro卡成像系统：牺牲小鼠气体。解剖动物和消费的所有主要器官（脑，心，肺，脾，肾和肝），与肿瘤的侧面，将组织石蜡，分析与使用黄色的激发和发射滤光片的荧光成像仪（800毫秒曝光）检测荧光信号的存在，在组织（来自A647标签共轭的VNPs）。保存的图像和分析荧光强度使用ImageJ：1.44o软件（ http://imagej.nih.gov/ij ）。比较VNPs在随着时间的推移与其他主要组织肿瘤摄取的图案。
- 成像后，削减每个组织中的一半，和，在OCT化合物嵌入一个半冰冻切片和激光共聚焦分析。收藏报错另一半则在预先称重的冷冻小瓶并立即冻结他们使用液N 2。储存于-80℃，直到准备好以供进一步处理。
- 荧光定量：回复脊髓组织权重。在室温下解冻冷冻的组织，并且将它们放置在单独的50毫升Falcon管中含有1ml的PBS。使用一个手持的组织匀浆，在PBS中的2-3分钟的组织均匀，然后匀浆转移到微量离心管中。离心13000×g离心10分钟，除去非均质的组织匀浆。
- 移液管加入100μl的上清液从从每个组（PBS及的VNP制剂/时间点）到384孔黑色UV板的组织。评估使用读板器的荧光强度（激发/发射波长665分之600）。规格化所获得的荧光值，由组织重量。
- 免疫组化：准备在-20℃的冷冻切片机切片（10微米），并存储染色细胞核吲哚（DAPI）和血管内皮细胞标记物（FITC-标记的抗小鼠CD31抗体）的组织切片。进行共焦显微镜分析血管瘤内的本地化的荧光标记的VNP映射第
注意：此过程将不会被证明的，有代表性的数据如图8所示。上的参考，免疫组织化学和所描述的染色方法，读者被称为文献19中
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Discussion
该协议提供了一种方法VNPs和他们的应用程序在体内肿瘤成像的化学改性。动物荧光成像，荧光定量和免疫组化技术可用于研究生物分布和评估肿瘤归巢。这些技术提供了有价值的信息，通过EPR效应的纳米粒子对肿瘤。从不同的分析方法相结合的结果，我们得到了一个强大的方法，评估的定位和生物分布的VNPs。
之前可以进行这些研究，但是，它是必不可少的，以获得纯的病毒制剂。除了从机械接种，一种可能的替代为VNP传播是的农杆菌介，可以有较高的转化和积累率。传播时，VNPs，应注意保持植株感染不同的病毒分离吨o避免交叉污染。特别是，烟草花叶病毒很容易传播和传送机械。要注意的另一个关键步骤是进行病毒纯化在冰上或4°C应使用冰冷的所有缓冲区。较低的温度下是必要的，以防止任何损害的VNPs作为蛋白酶和氧化酶，存在于植物材料的结果。
纯化的VNPs的低收益率可能出现的多种因素。一个可能的原因可能是用于传播的VNPs的年龄。它是优选使用更近期的病毒制剂。例如，C-末端24个氨基酸的S外壳蛋白CPMV所必需的基因沉默的抑制。删除该表面暴露区域发生随着时间的推移，由于水解。虽然CPMV的结构和稳定性不会受到影响，生长发育迟缓和延迟传播的病毒的结果。低收益率的另一个来源是在纯化过程中丢失的VNPs。特别是在应给予张力的再悬浮PEG沉淀后的步骤。不完全再悬浮的颗粒会导致VNP失去了在随后的离心步骤的颗粒。
总体而言，这里介绍的是简单的生物分子的化学品。，14,17,18,21的表征方法，确保颗粒的完整性和确定的共轭程度是有价值的。摩尔过量可以取决于应用程序和所需的官能化程度相应调整。
当工作与小鼠移植瘤模型中，最重要的做法，是继无菌技术。此外，尾静脉注射的剂量为每只小鼠，以确保均匀的样品是一个关键步骤。它可以帮助的尾部放置在温水中，预先静脉扩张。另一个要考虑的是自体荧光的荧光成像和测量。一般情况下，组织的自发荧光是最小化超过600纳米，长波长超过600纳米，最佳的成像探针染料的发射峰。然而，正常小鼠的饮食包括叶绿素含紫花苜蓿，也发出荧光红色。其结果是，它是必要的，以保持至少2周小鼠苜蓿免费饮食，以减少背景信号。最后，应该指出的是，使用荧光成像的荧光检测是有限的，由于不同的各种组织中的散射和吸收环境。因此，成像，用于可视化和作为初始用于监测生物分布的方法，而使用组织匀浆进行定量。
VNPs的平台技术优势的单分散性，生物相容性，为规模化生产的能力，并顺从多个功能化的战略。除了化学工程，基因工程与此处说明的是引入重刑的半胱氨酸到BMV作为生物标记的目标。基因工程也可用于引入针对肽或亲和标签。虽然协议利用双标记（染料和PEG）颗粒，正在进行的研究正在寻找将额外的功能（ 例如 ，治疗和目标），以提高组织的特异性和疗效。因此，这种方法为未来医学领域的应用奠定了基础。
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Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
这项工作是由NIH / NIBIB的补助R00 EB009105（NFS）和P30 EB011317（NFS），NIH / NIBIB的培训津贴T32 EB007509（AMW），一个凯斯西储大学跨学科联盟投资补助（NFS）的支持，案例综合癌症中心授予P30 CA043703（NFS）。我们感谢斯坦梅茨实验室本科学生，研究人员对他们的实际支持：纳迪亚阿亚特Sourav（SID），凯文·陈，戴伊，杨蕙如山姆亚历山大，克雷格·德克鲁兹，斯蒂芬·亨·劳伦兰多夫，布赖恩所以，保罗Chariou 。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| VNP production | |||
| Indoor plant chamber | Percival Scientific | E-41L2 | |
| V. unguiculata seeds (California black-eye no. 5) | Burpee | 51771A | |
| N. benthamiana seeds | N. benthamiana seeds were a gift from Salk Institute. Seeds are produced through plant propagation. | ||
| Carborundum | Fisher | C192-500 | |
| Pro-mix BX potting soil | Premier Horticulture | 713400 | |
| Jack's Professional 20-10-20 Peat-Lite Fertilizer | JR Peters | 77860 | |
| Equipment | |||
| 50.2 Ti rotor | Beckman | 337901 | |
| SW 32 Ti rotor | Beckman | 369694 | |
| Optima L-90K ultracentrifuge | Beckman | 365672 | |
| SLA-3000 rotor | Thermo Scientific | 07149 | |
| SS-34 rotor | Thermo Scientific | 28020 | |
| Sorvall RC-6 Plus centrifuge | Thermo Scientific | 46910 | |
| Polypropylene bottle | Beckman | 355607 | For SLA-3000 rotor |
| Polycarbonate bottle | Beckman | 357002 | For SS-34 rotor |
| Ultra-Clear tube | Beckman | 344058 | For sucrose gradient and SW 32 Ti rotor |
| Polycarbonate bottle | Beckman | 355618 | For pelleting and 50.2 Ti rotor |
| NanoDrop spectrophotometer | Thermo Scientific | NanoDrop2000c | |
| PowerEase 500 pre-cast gel system | Invitrogen | EI8675EU | |
| Superose 6 10/300 GL (24 ml) size-exclusion column | GE Healthcare | 17-5172-01 | |
| ÄKTA Explorer 100 Chromatograph | GE Healthcare | 28-4062-66 | |
| Allegra X-12R | Beckman | 392302 | Benchtop centrifuge |
| Cryostat | Leica | CM1850 | |
| Maestro 2 | Caliper Life Sciences | In vivo imaging system | |
| Tissue-Tearor | Biospec Products | 985370-395 | |
| Microplate reader | Tecan | Infinite-200 | |
| Transmission electron microscope | ZEISS | Libra 200FE | |
| FluoView laser scanning confocal microscope | Olympus | FV1000 | |
| Chemicals and Reagents | |||
| 3-ethynylaniline | Sigma Aldrich | 498289-5G | |
| 384 well black plate | BD Biosciences | 353285 | |
| 4-12% Bis-Tris NuPAGE SDS gel | Invitrogen | NP0321BOX | |
| 4X LDS sample buffer | Invitrogen | NP0008 | |
| Acetic Acid | Fisher | A385-500 | |
| Acetonitrile | Sigma Aldrich | 271004-1L | |
| Alexa Fluor 647 azide | Invitrogen | A10277 | |
| Alexa Fluor 647 carboxylic acid, succinimidyl ester | Invitrogen | A20006 | |
| Amicon Ultra-0.5 ml Centrifugal Filters | Millipore | UFC501096 | 10 kDa cut-off |
| Aminoguanidine hydrochloride | Acros Organics | 36891-0250 | |
| Boric acid | Fisher | A74-500 | |
| Coomassie Brilliant Blue R-250 | Fisher | BP101-25 | |
| CsCl | Acros Organics | 42285-1000 | |
| DAPI | MP Biomedicals | 157574 | |
| Dimethyl sulfoxide | Fisher | BP231-100 | |
| Filter paper | Fisher | 09-801K | P5 grade |
| FITC anti-mouse CD31 | BioLegend | 102406 | |
| Goat serum | Invitrogen | 16210-064 | |
| KCl | Fisher | BP366-500 | |
| L-ascorbic acid sodium salt | Acros Organics | 35268-0050 | |
| Methanol | Fisher | A412P-4 | |
| MgCl2 | Fisher | BP214-500 | |
| Microscope slides | Fisher | 12-544-3 | |
| Microscope cover glass | VWR | 48366-277 | |
| MOPS buffer | Invitrogen | NP0001 | |
| mPEG-mal | Nanocs | PG1-ML-2k | MW 2000 |
| mPEG-N3 | Nanocs | PG1-AZ-5k | MW 5000 |
| mPEG-NHS | Nanocs | PG1-SC-5k | MW 5000 |
| NaCl | Fisher | BP358-212 | |
| Oregon Green 488 succinimidyl ester *6-isomer* | Invitrogen | O-6149 | |
| p-toluenesulfonic acid monohydrate | Acros Organics | 13902-0050 | |
| Permount | Fisher | SP15-100 | |
| Potassium phosphate dibasic | Fisher | BP363-1 | |
| Potassium phosphate monobasic | Fisher | BP362-1 | |
| Sodium acetate | Fisher | BP333-500 | |
| Sodium nitrite | Acros Organics | 42435-0050 | |
| Sodium sulfite | Amresco | 0628-500G | |
| Sucrose | Fisher | S6-500 | |
| TEM grid | Ted Pella | FCF-400Cu | |
| Tris base | Fisher | BP152-500 | |
| Triton X-100 | EMD Chemicals | TX1568-1 | |
| β-mercapt–thanol | Fisher | O3446I-100 | |
| Tissue Culture | |||
| Fetal bovine serum | Invitrogen | 12483-020 | |
| Hemocytometer | Fisher | 0267110 | |
| HT-29 cells | ATCC | HTB-38 | |
| L-glutamine | Invitrogen | 25030-080 | |
| PBS | Cellgro | 21-040-CV | |
| Penicillin-streptomycin | Invitrogen | 10378-016 | |
| RPMI-1640 | Invitrogen | 31800-089 | |
| Tissue culture flasks | Corning | 431080 | 175 cm2 |
| Trypan Blue | Thermo Scientific | SV30084.01 | |
| Trypsin, 0.05% (1X) with EDTA 4Na, liquid | Invitrogen | 25300-054 | |
| Animal Studies | |||
| 18% Protein Rodent Diet | Harlan Teklad | Teklad Global 2018S | Alfalfa free diet |
| Insulin syringe | BD Biosciences | 329410 | 28 gauge |
| Isoflurane | Baxter | AHN3637 | |
| Matrigel Matrix basement membrane | BD Biosciences | 356234 | |
| NCR nu/nu mice | CWRU School of Medicine Athymic Animal and Xenograft Core Facility |
||
| Sterile syringe | BD Biosciences | 305196 | 18 1/2 gauge |
| Tissue-Tek CRYO-OCT Compound | Andwin Scientific | 4583 | |
References
- Description of Plant Viruses [Internet]. , Association of Biologists. Warwick, UK. Available from: http://dpvweb.net/ (2012).
- Carrillo-Tripp, M., Shepherd, C. M., Borelli, I. A., Venkataraman, S., Lander, G., Natarajan, P., Johnson, J. E., Brooks, C. L., Reddy, V. S. VIPERdb2: an enhanced and web API enabled relational database for structural virology. Nucl. Acids Res. 37, 436-442 (2009).
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