Summary
Pflanzen virale Nanopartikel (VNPS) sind vielversprechende Plattformen für Anwendungen in der Biomedizin. Hier beschreiben wir die Verfahren für die Anlage VNP Ausbreitung, Reinigung, Charakterisierung und Biokonjugation. Schließlich zeigen wir die Anwendung der VNPS für die Tumor-Homing und Bildgebung mit der Maus Xenograft-Modell und Fluoreszenz-Bildgebung.
Abstract
Die Verwendung von Nanomaterialien hat das Potenzial, Materialwissenschaft und Medizin zu revolutionieren. Derzeit sind eine Anzahl verschiedener Nanopartikel ist für Anwendungen in der Bildgebung und Therapie untersucht. Viral-Nanopartikel (VNPS) aus Pflanzen gewonnen werden kann als self-assembled Bionanomaterialien mit definierten Größen und Formen betrachtet werden. Pflanzenviren untersuchten im Labor gehören Steinmetz ikosaedrischen Teilchen durch Kuherbsen-Mosaikvirus (CPMV) und Brome Mosaik Virus (BMV), die beide 30 nm im Durchmesser sind, gebildet. Wir entwickeln auch stabförmigen und filamentöse Strukturen aus den folgenden Pflanzenviren abgeleitet: Tabak-Mosaik-Virus (TMV), die starre Stäbe bildet mit den Abmessungen von 300 nm von 18 nm und Potato virus X (PVX), die filamentöse Partikel 515 bilden nm Länge und 13 nm in der Breite (der Leser auf refs bezeichnet. 1 und 2 für weitere Informationen über VNPS).
in großem Maßstab in planta hergestellt werden, sind außergewöhnlich stabil und biokompatibel. Auch sind VNPS "programmierbar"-Einheiten, die speziell entwickelt werden mit gentechnischen Veränderung oder chemische Biokonjugation Methoden 3 können. Die Struktur der VNPS wird bis zu atomarer Auflösung bekannt und Modifikationen können mit räumlicher Präzision durchgeführt werden auf atomarer Ebene 4, ein Maß an Kontrolle, die nicht erreicht werden kann mit synthetischen Nanomaterialien mit aktuellen State-of-the-art Technologien werden.
In diesem Papier beschreiben wir die Ausbreitung von CPMV, PVX, TMV und BMV in Vigna ungiuculata und Nicotiana benthamiana Pflanzen. Extraktion und Reinigung Protokolle für jede VNP gegeben. Methoden zur Charakterisierung von gereinigtem und chemisch-markierten VNPS beschrieben. In dieser Studie haben wir am ch konzentrierenemical Kennzeichnung VNPS mit Fluorophoren (zB Alexa Fluor 647) und Polyethylenglykol (PEG). Die Farbstoffe erleichtern Verfolgung und Erfassung der VNPS 5-10, und PEG reduziert Immunogenität der proteinartigen Nanopartikel gleichzeitig ihre Pharmakokinetik 8,11. Wir zeigen Tumor Homing von PEGylierten VNPS mit der Maus Xenograft-Tumor-Modell. Eine Kombination von Fluoreszenz-Bildgebung von Gewebe ex vivo mit Maestro Imaging System, Fluoreszenz Quantifizierung in homogenisierten Geweben und konfokale Mikroskopie wird verwendet, um Bioverteilung studieren. VNPS werden über das retikuloendotheliale System (RES) gelöscht ist; Tumor einfindende wird passiv über das erhöhte Permeabilität und Retention (EPR) Wirkung 12 gelöst. Der VNP Nanotechnologie ist ein leistungsstarkes Plug-and-play-Technologie auf Bild und Behandlung von Seiten der Erkrankung in vivo. Wir arbeiten weiter an VNPS um Drogen Frachten und klinisch relevante Bildgebung Einheiten sowie Gewebe-spezifische Liganden zu tragenZiel molekularen Rezeptoren bei Krebs und kardiovaskuläre Erkrankungen überexprimiert.
Protocol
Ein. VNP (CPMV, BMV, PVX und TMV) Propagation
- Stellen Sie die Indoor-Anlage Kammer steuert bis 15 h Tag (100% Licht, 25 ° C, 65% Luftfeuchtigkeit) und 9 h Nacht (0% Licht, 22 ° C, 60% Luftfeuchtigkeit).
- Beimpfen Anlagen nach der Timeline in Tabelle 1.
| CPMV | PVX, TMV und BMV |
| Tag 0: Plant 3 cowpea Samen / Topf. | Tag 0: Plant ~ 30 N. benthamiana Samen / Topf. Düngen Sie einmal pro Woche mit 1 Esslöffel Dünger / 5 L Wasser. |
| Tag 14: Re-Topf N. benthamiana bei 1 Pflanze / Topf. | |
| Tag 10: Infect lässt primäre Blätter mit CPMV (5 &mgr; g/50 ul / Blatt) durch mechanische Inokulation mit einem leichten Abstauben von Carborundum. | Tag 28: Infect drei bis five Blätter mit PVX, TMV oder BMV (5 &mgr; g/50 ul / Blatt) durch mechanische Inokulation mit einem leichten Abstauben von Carborundum. |
| Tag 20: Harvest Blätter und lagern -80 ° C. | Tag 42: Harvest Blätter und lagern -80 ° C. |
Tabelle 1. Timeline für den Anbau, infizieren, und die Ernte Blätter.
Hinweis: Nur CPMV Ausbreitung wird als Beispiel gezeigt.
2. VNP (CPMV, BMV, PVX und TMV) Reinigung
Hinweis: Alle Schritte werden auf Eis oder bei 4 ° C.
- Homogenisieren 100 g gefrorene Blätter in einem Standard-Mixer mit 2 Volumina kaltem Puffer (siehe Tabelle 2). Anschließend wird durch 2-3 Schichten Gaze.
- Für PVX, pH-Wert auf 6,5 mit 1 M HCl. Hinzufügen 0,2% (w / v) Ascorbinsäure und 0,2% (w / v) Natrium Sulfite.
- Zentrifuge rohen Pflanzenextrakten Homogenat bei 5.500 xg für 20 min. Sammle Überstand.
- Für BMV, Schicht 25 ml Überstand auf 5 ml 10% (w / v) Saccharose-Lösung. Zentrifuge bei 9000 × g für 3 h und resuspendieren Pellets in 38,5% CsCl-Lösung (w / v). Mix durch Schütteln für 5 Stunden, dann mit Schritt 2,12 fortzusetzen.
- Extrahieren Pflanzenmaterials durch Zugabe von 0,7 Volumina von 1:1 (v / v) Chloroform :1-Butanol. Stir Mischung für 30-60 min.
- Zentrifuge Lösung bei 5.500 xg für 20 min. Sammeln der oberen wäßrigen Phase.
- Hinzufügen NaCl bis 0,2 M und 8% (w / v) PEG (MW 8000). Für TMV, auch die 1% (v / v) Triton X-100. Stir für mindestens 1 h, dann lassen Sie sich für mindestens 1 Stunde.
- Zentrifuge Lösung bei 15.000 × g für 15 min. Pellet in 10 ml Puffer. Für PVX, fügen Sie 0,1% β-Mercaptoethanol und Harnstoff zu 0,5 M.
- Zentrifuge bei 8.000 xg für 30 min und sammeln Überstand.
- Ultrazentrifuge Überstand bei 160.000 xg für 3 Stunden. Pellet in 5 ml Puffer overnight.
- Vorbereiten einer 10-40% Saccharosegradienten mit gleichen Volumina von 10%, 20%, 30% und 40% Saccharose in Puffer (schwerste zuerst). Lassen Sie den Gradienten über Nacht ins Gleichgewicht bei Raumtemperatur.
- Ultrazentrifuge resuspendiert Pellet über Saccharosegradienten bei 100.000 × g für 2 h (24 h bei BMV).
- Sammle Lichtstreuung Band und Dialyse gegen Puffer.
- Charakterisieren die VNPS (unten) und bei 4 ° C. Für die langfristige Lagerung bei -80 ° C lagern
| CPMV und TMV | 0,1 M Kaliumphosphatpuffer (pH 7,0) 38,5 mM KH 2 PO 4 61,5 mM K 2 HPO 4 |
| PVX | 0,5 M Boratpuffer (pH 7,8) 0,5 M Borsäure Der pH-Wert mit NaOH |
| BMV | SAMA Puffer (pH 4,5) 250 mM Natriumacetat 10 mM MgCl 2 2 mM β-Mercaptoethanol (add frisch) |
Tabelle 2. Puffer und ihre Rezepte für jeden VNP.
Hinweis: Nur CPMV Ausbreitung wird als Beispiel gezeigt.
3. VNP (CPMV, BMV, PVX und TMV) Charakterisierung
- Führen UV / VIS-Spektroskopie, die Konzentration von VNPS bestimmen.
- Messen Sie die Absorption von 2 ul Probe mit einem NanoDrop Spektralphotometer.
- Bestimmung der Konzentration von Partikeln und Farbstoffen Verwendung des Beer-Lambert-Gesetz (A = εcl, wobei A die Absorption, ε ist der Extinktionskoeffizient ist, c die Konzentration ist, und l die Weglänge). Die Weglänge beträgt 0,1 cm für den NanoDrop.
Die VNP-spezifischen Extinktionskoeffizienten sind:
CPMV: 8,1 cm -1 mg -1 ml (bei 260 nm)
PVX: 2,97 cm -1 mg -1 ml (bei 260 nm)
TMV: 3,0 cm -1 mg -1 ml (bei 260 nm)
BMV 5.15 cm -1 mg -1 ml (bei 260 nm)
- Analysieren Partikel durch Ausschluss-Fast-Protein-Flüssigchromatographie (FPLC).
- Mit einer Superose 6 Ausschluss-Säule und die ÄKTA Explorer, Last 50-100 ug VNPS in 200 ul 0,1 M Kaliumphosphatpuffer (pH 7,0).
- Detektoren eingestellt auf 260 nm (Nukleinsäure), 280 nm (Protein) und der Anregungswellenlänge etwaiger Farbstoffe beigefügt.
- Ausführen bei einer Fließgeschwindigkeit von 0,5 ml / min für 72 min.
- Das Elutionsprofil und A260: A280 nm angibt, ob der VNP Vorbereitung rein ist und ob Partikel sind intakt und montiert.
Die folgende A260: 280 Kennzahlen deuten auf eine reine VNP Zubereitung:
CPMV: 1,8 ± 0,1
PVX: 1,2 ± 0,1
TMV:1,1 ± 0,1
BMV: 1,7 ± 0,1
- Führen Denaturierung (pre-cast NuPAGE) Bis-Tris Polyacrylamid 4-12% Gradienten-Gel-Elektrophorese, um die Reinheit der Vorbereitung und Konjugation an einzelnen Hüllproteine analysieren.
- 3 ml 4x LDS-Probenpuffer bis 10 ug der Partikel in 9 ul Kaliumphosphatpuffer. Fügen Sie eine weitere 1 ul 4x LDS-Probenpuffer und 3 ul β-Mercaptoethanol BMV die hohe Zahl von Disulfidbindungen zu reduzieren.
- Inkubieren in Heizblock für 5 min bei 100 ° C.
- Legen Sie die Proben auf einem SDS-Gel.
- Führen Proben bei 200 V für 1 Stunde in 1x MOPS Laufpuffer.
- Dokumentieren Sie das Gel unter UV-Licht fluoreszierenden Hüllproteine zu visualisieren.
- Für nicht-fluoreszierendes Protein, mit Coomassie-Blau (0,25% (w / v) Coomassie-Brilliantblau R-250, 30% (v / v) Methanol, 10% (v / v) Essigsäure) für 1 Stunde zu färben.
- Entfärben mit 30% Methanol, 10% Essigsäure über Nacht. Change die Lösung, wenn erforderlich.
- Dokumentieren Sie das Gel unter weißem Licht.
- Analysieren Integrität der Teilchen durch Transmissionselektronenmikroskopie (TEM).
- Verdünnen Sie die Proben auf 0,1-1 mg / ml in 20 ul DI-Wasser.
- Platz 20 ul Tropfen der Proben auf Parafilm.
- Titelbild Tropfen mit einem TEM-Gitter und lassen Sie sich für 2 min. Wick das überschüssige Lösung auf dem Gitter mit Filterpapier.
- Waschen Sie Grid, indem auf einen Tropfen DI Wasser dann Dochtwirkung trocken.
- Fleck Gitter durch Aufstellung auf einem 20 ul Tropfen von 2% (w / v) Uranylacetat für 2 min. Wick das überschüssige Fleck mit Filterpapier.
- Waschen Sie Grid einmal mehr im Wasser.
- Beobachten Gitter unter einem Transmissions-Elektronen-Mikroskop.
4. Chemische Konjugation von VNPS mit PEG und Fluorophore, Reinigung und Charakterisierung
- Für die Berechnungen für die Reaktionen unten, sind die Molmasse der VNPS:
CPMV: 5,6x 10 6 g / mol
PVX: 35 x 10 6 g / mol
TMV: 41 x 10 6 g / mol
BMV: 4,6 x 10 6 g / mol - Konjugat Farbstoffen und PEG an die Oberfläche Lysine CPMV und PVX mit einem Ein-Schritt-N-Hydroxysuccinimid Kupplungsreaktion: In 2.500 Moläquivalenten (alle molare Überschüsse beziehen sich auf molaren Überschuss pro VNP) von Alexa Fluor 647 Succinimidylester und 4.500 Äquivalente von NHS- PEG (MW 5000) in DMSO auf CPMV gelöst in 0,1 M Kaliumphosphatpuffer. Bei der Arbeit mit PVX, fügen Sie ein 10.000 molaren Überschuß von NHS-Farbstoff und NHS-PEG. Durch Veränderung der Puffer und DMSO Volumina, so dass die Endkonzentration von CPMV und PVX 2 mg / ml und DMSO-Gehalt 10% des gesamten Reaktionsvolumens liegt. Inkubieren die Reaktionsmischung über Nacht bei Raumtemperatur vor Licht geschützt. CPMV und PVX haben 300 und 1.270 adressierbare Lysine sind. (Der Leser wird auf den folgenden Literaturhinweise am bezeichnetchemische Modifikation von CPMV und PVX: 13-15).
- Konjugat Farbstoffen und PEG Tyrosine des TMV von Diazonium Kopplung von Kupfer (I)-katalysierten Azid-Alkin-Cycloaddition gefolgt.
- Planen Diazoniumsalz (Alkin) durch Mischen von 400 ul 0,3 M p-Toluolsulfonsäure-Monohydrat, 25 ul 3,0 M Natriumnitrit und 75 ul 0,68 M destilliertem 3-Ethinylanilin in Acetonitril bei 4 ° C für 1 Stunde gelöst.
- Hinzufügen 3,3 ml Boratpuffer, pH 8,8, enthaltend 100 mM NaCl und 1,25 ml TMV (20 mg / ml Stammlösung).
- Reagieren des TMV mit 450 ul des Diazoniumsalzes (Alkin)-Lösung in einem Eisbad für 3 Stunden zum Hinzufügen eines Alkins Ligation Griff durch Diazonium Kopplung TMV. Die Lösung wird in eine hellbraune Farbe einzuschalten. TMV hat 2.140 Verfügung Tyrosine zur Konjugation.
- Reinige das Endprodukt mit einer Saccharose-Kissen wie in Schritt 4.4 beschrieben.
- Bringen Azid-funktionale Alexa Fluor 647 und PEG-Azid (MW 5.000) using Kupfer (I)-katalysierten Azid-Alkin-Cycloaddition (CuAAC). Add 2 Äquivalenten Farbstoff-und PEG-Azid pro Hüllprotein und inkubieren mit 1 mM CuSO 4, 2 mM AMG und 2 mM Natriumascorbat bei Raumtemperatur für 15 min. Passen das Puffervolumen so daß die endgültige Konzentration der Reaktion TMV 2 mg / ml beträgt. (: 16,17 Der Leser wird auf den folgenden Literaturhinweise zur chemischen Modifikation von TMV bezeichnet).
- Konjugat Farbstoffe Lysine und PEG Cysteine BMV Cystein-Mutante (cBMV):
- Hinzufügen 2000 Moläquivalenten Oregon Green 488 Succinimidylester in DMSO, um cBMV gelöst in 0,1 M TNKM Puffer (50 mM Tris-Base, 50 mM NaCl, 10 mM KCl, 5 mM MgCl 2, pH 7,4). Durch Veränderung der Puffer und DMSO Volumina, so dass die Endkonzentration von BMV 1 mg / ml und DMSO-Gehalt 10% des gesamten Reaktionsvolumens liegt. Inkubieren Sie die Reaktionsmischung über Nacht bei 4 ° C vor Licht geschützt.
- Purify Partikel mit Zentrifugenfugierten Filter wie in Schritt 4.4 beschrieben.
- Hinzufügen 2000 molaren Überschuß von PEG-Maleimid (MW 2000) unter Verwendung der gleichen Reaktionsbedingungen wie vor und inkubieren des Reaktionsgemisches für 2 Stunden bei 4 ° C. cBMV hat 180 reaktive Lysine und Cysteine. (: 18 Der Leser wird auf den folgenden Literaturhinweise zur chemischen Modifikation von BMV genannt).
- Reinigung: Übergeben der Lösung durch eine 40% (w / v) Saccharose-Kissen bei 160.000 × g für 2,5 Stunden. Wieder das Pellet in Puffer. Alternativ gegen entsprechende Puffer mit 10 kDa cut-off Spin-Filter dialysiert.
- Charakterisierung: PEGylierten und fluoreszenzmarkierten VNPS analysiert werden unter Verwendung der oben beschriebenen Verfahren: UV / Vis-Spektroskopie, SDS-Gelelektrophorese, FPLC und TEM (nicht gezeigt, aber auf die 6 und 7 beziehen).
5. Tumor-Targeting-und Imaging mit einer Maus Xenograft Modell
- Kultur menschliche HT-29-Kolonkrebszellen in RPMI Medium mit 5% FBS, 1% Penicillin-Streptomycin und 1% L-Glutamin bei 37 ° C in 5% CO 2 unter Verwendung von 175 cm 2 Zellkulturflaschen ergänzt.
- Waschen der Zellen zweimal mit sterilem PBS und Ernte durch Inkubation mit 5 ml Trypsin-EDTA bei 37 ° C für 5 min. Inaktivierung des Trypsin mit 5 ml RPMI-Medium. Collect Zellen durch Zentrifugation bei 500 × g für 5 min. bei 4 ° C und resuspendieren in frischem RPMI bei 5x10 6 Zellen/50 ul Medium (festzustellen gesamten Zellzahl mittels Trypanblau und eines Hämozytometers). Mischen mit einem gleichen Volumen von Matrigel vor der Injektion (keep alle Lösungen und Reagenzien steril).
- Beschaffen sechs Wochen alten NCR nu / nu-Mäusen und halten sie auf einer Luzerne freie Diät für 2 Wochen. [Anmerkung:. Alle tierischen Verfahren müssen IACUC genehmigt] Erbrechen Tumorxenotransplantaten durch subkutane Injektion von 5x10 6 Zellen/100 ul / Tumor in den Flanken (2 Tumoren / Maus) mit einem 18 1/2 Gauge sterilenNadel. Überwachen Sie die Tiere regelmäßig. Messen Sie die Größe des Tumors mit Bremssätteln und damit die Tumore zu einem durchschnittlichen Volumen von 20 mm 3 (innerhalb der nächsten 12 Tage) wachsen. Weisen Mäusen zu zwei verschiedenen Gruppen randomisiert: PBS und VNP (n = 3 Tiere / Gruppe / Zeitpunkt). Verwendung einer 1 ml 28 Gauge Insulinspritze durch intravenöse Injektion in die Schwanzvene 100 ul sterilem PBS oder 10 mg / kg VNP Formulierung zu verabreichen.
Hinweis: Gewebekultur Experimente und Studien mit lebenden Tieren nicht nachgewiesen werden. Hands-on-Demonstration wird die Gewebe-Verarbeitung und Datenerfassung begrenzt werden. Für einen Hinweis bei der HT-29 Xenograftmodell, wird der Leser auf ref bezeichnet. 19
Drei Techniken werden verwendet, um von einem Tumor einfindende VNPS auszuwerten:
- Fluoreszenz-Imaging mit Maestro Imaging System: Sacrifice Mäusen zu unterschiedlichen Zeitpunkten (2, 24 und 72 h) unter Verwendung von CO 2Gas. Sezieren die Tiere und Verbrauchsteuern alle wichtigen Organe (Gehirn, Herz, Lunge, Milz, Nieren und Leber) zusammen mit den Tumoren an den Flanken, legen Sie das Gewebe auf Parafilm und analysieren mit Fluoreszenz-Imaging Instrument mit gelben Anregungs-und Emissions-Filter (800 ms Exposition), um die Anwesenheit von Fluoreszenzsignalen in den Geweben (abgeleitet von A647 Label konjugiert zu den VNPS) zu detektieren. Speichern Sie die Bilder und analysieren Fluoreszenzintensitäten mit ImageJ 1.44o Software ( http://imagej.nih.gov/ij ). Vergleichen des Musters der Aufnahme der VNPS in Tumoren mit anderen wichtigen Geweben mit der Zeit.
- Nach der Bebilderung, schneiden jedes Gewebe in der Mitte und betten die eine Hälfte in OCT-Verbindung für Kryo-Schnitte und konfokale Analyse. Sammeln Sie die andere Hälfte in vorgewogenen Cryoröhrchen und sofort einfrieren mit flüssigem N 2. Lagerung bei -80 ° C bis zur weiteren Verarbeitung bereit.
- Fluoreszenz Quantifizierung: ReKord Geweben Gewichte. Eingefrorene Gewebe bei Raumtemperatur und legen Sie sie in separaten 50 ml Falcon-Röhrchen mit 1 ml PBS. Mit einem Handheld Gewebehomogenisator, Homogenisierung der Gewebe für 2-3 min in PBS übertragen dann das Homogenat zu Mikrozentrifugenröhrchen. Zentrifugation der Homogenate 10 min bei 13.000 × g, um nicht homogenisierten Gewebe zu entfernen.
- Je 100 ul des Überstands aus den Geweben aus jeder Gruppe (PBS und VNP Formulierungen / Zeitpunkten) in einer 384 well black UV Platte. Bewerten Fluoreszenzintensität (Ex / Em Wellenlängen 600/665) mit einer Platte Leser. Normalisieren der erhaltenen fluoreszierenden Werte durch die Gewebe-Gewichte.
- Immunhistochemie: Bereiten Kryo-Mikrotomschnitte (10 um) und bei -20 ° C. Fleck Gewebeschnitte für Zellkerne (DAPI) und endothelialer Zellmarker (FITC-markierte Anti-Maus-CD31-Antikörper). Durchführung Konfokalmikroskopie Analyse, um den vaskulären und intratumorale Lokalisierung von fluoreszenzmarkierten VNP abzubildens.
Hinweis: Dieses Verfahren nicht nachgewiesen werden, repräsentative Daten sind in Abbildung 8 dargestellt. Für einen Verweis auf Immunhistochemie und den beschriebenen Färbemethoden, wird der Leser auf ref bezeichnet. 19
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Discussion
Dieses Protokoll stellt einen Ansatz für die chemische Modifikation von VNPS und deren Anwendungen zur in vivo-Tumordarstellung. Die Tier-Fluoreszenz-Imaging-, Fluoreszenz-Quantifizierung und Immunhistochemie hier vorgestellten Verfahren sind nützlich für das Studium Bioverteilung und Auswertung Tumor Homing. Diese Techniken wertvolle Informationen über den Zugang der Nanopartikel an den Tumor durch die EPR-Effekt. Durch die Kombination der Ergebnisse aus den verschiedenen analytischen Methoden, erhalten wir eine leistungsfähige Methode zur Beurteilung Lokalisierung und Bioverteilung der VNPS.
Bevor jedoch diese Studien durchgeführt werden kann, ist es wichtig, eine reine Viruspräparation zu erhalten. Neben mechanischen Inokulation ist eine mögliche Alternative für VNP Ausbreitungsrichtung agroinfiltration, die eine hohe Umwandlung und Akkumulationsrate haben kann. Bei der Vermehrung der VNPS sollte darauf geachtet werden, um Pflanzen mit unterschiedlichen Viren infiziert separaten wie t halteno Vermeidung von Kreuzkontaminationen. Insbesondere wird TMV leicht verteilen und übertragen mechanisch. Ein weiterer wichtiger Schritt zu gedenken ist die Durchführung Virusreinigung auf Eis oder bei 4 ° C. Alle Puffer sollte eiskalt genutzt werden. Die untere Temperaturgrenze ist notwendig, um eine Beschädigung der VNPS durch Proteasen und oxidierenden Enzymen in der Pflanze vorhandenes Material zu verhindern.
Niedrige Erträge von gereinigtem VNPS können von mehreren Faktoren entstehen. Eine mögliche Ursache könnte das Alter der VNPS zur Vermehrung verwendet werden. Es ist vorzuziehen, neuere Virus Präparaten einzusetzen. Zum Beispiel sind die C-terminalen 24 Aminosäuren der S-Hüllproteins des CPMV, die für die Unterdrückung des Gen-Silencing. Deletion dieses oberflächenexponierten Bereich tritt im Laufe der Zeit aufgrund von Proteolyse. Obwohl die Struktur und Stabilität von CPMV nicht betroffen sind, Wachstumsretardierung und verzögerte der Virus führt zu verbreiten. Eine weitere Quelle der niedrigen Renditen ist der Verlust der VNPS während der Reinigung. InsbesondereAufmerksamkeit sollte der Aufwirbelung Schritt nach PEG-Fällung gegeben werden. Unvollständige Resuspension des Pellets würde VNP im Pellet des anschließenden Zentrifugationsschritt verloren führen.
Insgesamt sind die Biokonjugation Chemie hier vorgestellten unkompliziert. 14,17,18,21 Die Charakterisierung beschriebenen Methoden sind wertvoll für die Gewährleistung Teilchens Integrität und Bestimmung Ausmaß der Konjugation. Molare Überschüsse können entsprechend angepasst abhängig von der Anwendung und dem Grad der Funktionalisierung wünschen übrig.
Bei der Arbeit mit der Maus Xenograft-Modell ist die wichtigste Praxis nach aseptischen Bedingungen. Darüber hinaus ist die Injektion in die Schwanzvene ein kritischer Schritt, um eine gleichmäßige Dosierung Probe für jede Maus gewährleisten. Es kann helfen, den Schwanz in warmem Wasser legen vorab, um die Vene erweitern. Eine weitere Überlegung ist Autofluoreszenz für die Fluoreszenz-Bildgebung und Messungen. Generell ist Gewebeautofluoreszenz Minimierunged über 600 nm, so dass langwellige Farbstoffe mit Emissionsmaxima über 600 nm optimal als bildgebende Sonde. Jedoch bestehen normalem Maus Diäten der Chlorophyll-haltigen Alfalfa, die auch fluoresziert rot. Als ein Ergebnis ist es notwendig, die Mäuse auf einer Luzerne freie Diät für mindestens 2 Wochen aufrechtzuerhalten Hintergrundsignale reduzieren. Schließlich ist darauf hinzuweisen, dass mit Fluoreszenzdetektion Fluoreszenzabbildung aufgrund von Unterschieden in der Streuung und Absorption Umgebungen der verschiedenen Gewebe begrenzt ist. Folglich wird Bildgebung zur Visualisierung und als erste Verfahren zur Überwachung der Bioverteilung verwendet, während die Quantifizierung erfolgt über Gewebehomogenaten.
Einige Vorteile der Verwendung VNPS als Plattform-Technologie sind ihre Monodispersität, Biokompatibilität, Fähigkeit für Scale-up-Produktion und Eignung für mehrere Funktionalisierung Strategien. Neben der chemischen Technik, wird die Gentechnik hier mit der Einführung dargestellttion von Cysteinen als Ziel für Biokonjugation BMV. Gentechnik könnte auch verwendet werden, um die Einführung Targeting-Peptide oder Affinitäts-Tags werden. Während das Protokoll beschrieben nutzt doppelt markierte (Farbstoff und PEG) Partikel sind laufenden Studien auf die Einbindung zusätzlicher Funktionalitäten (dh Therapeutika und Targeting), um Gewebe Spezifität und therapeutische Wirksamkeit zu verbessern suchen. So legt dieser Ansatz die Grundlage für zukünftige biomedizinische Anwendungen.
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Disclosures
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde vom NIH / NIBIB Zuschüsse R00 EB009105 (NFS) und P30 EB011317 (NFS), ein NIH / NIBIB Ausbildungsförderung T32 EB007509 (um AMW), einem der Case Western Reserve University Interdisziplinäre Alliance Investment Grant (NFS) unterstützt, und ein Gehäuse Comprehensive Cancer Center Gewährung P30 CA043703 (NFS). Wir danken den Steinmetz Lab Bachelor-Student Forscher für ihre tatkräftige Unterstützung: Nadia Ayat, Kevin Chen, Sourav (Sid) Dey, Alice Yang, Sam Alexander, Craig D'Cruz, Stephen Hern, Lauren Randolph, Brian So, und Paul Chariou .
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| VNP production | |||
| Indoor plant chamber | Percival Scientific | E-41L2 | |
| V. unguiculata seeds (California black-eye no. 5) | Burpee | 51771A | |
| N. benthamiana seeds | N. benthamiana seeds were a gift from Salk Institute. Seeds are produced through plant propagation. | ||
| Carborundum | Fisher | C192-500 | |
| Pro-mix BX potting soil | Premier Horticulture | 713400 | |
| Jack's Professional 20-10-20 Peat-Lite Fertilizer | JR Peters | 77860 | |
| Equipment | |||
| 50.2 Ti rotor | Beckman | 337901 | |
| SW 32 Ti rotor | Beckman | 369694 | |
| Optima L-90K ultracentrifuge | Beckman | 365672 | |
| SLA-3000 rotor | Thermo Scientific | 07149 | |
| SS-34 rotor | Thermo Scientific | 28020 | |
| Sorvall RC-6 Plus centrifuge | Thermo Scientific | 46910 | |
| Polypropylene bottle | Beckman | 355607 | For SLA-3000 rotor |
| Polycarbonate bottle | Beckman | 357002 | For SS-34 rotor |
| Ultra-Clear tube | Beckman | 344058 | For sucrose gradient and SW 32 Ti rotor |
| Polycarbonate bottle | Beckman | 355618 | For pelleting and 50.2 Ti rotor |
| NanoDrop spectrophotometer | Thermo Scientific | NanoDrop2000c | |
| PowerEase 500 pre-cast gel system | Invitrogen | EI8675EU | |
| Superose 6 10/300 GL (24 ml) size-exclusion column | GE Healthcare | 17-5172-01 | |
| ÄKTA Explorer 100 Chromatograph | GE Healthcare | 28-4062-66 | |
| Allegra X-12R | Beckman | 392302 | Benchtop centrifuge |
| Cryostat | Leica | CM1850 | |
| Maestro 2 | Caliper Life Sciences | In vivo imaging system | |
| Tissue-Tearor | Biospec Products | 985370-395 | |
| Microplate reader | Tecan | Infinite-200 | |
| Transmission electron microscope | ZEISS | Libra 200FE | |
| FluoView laser scanning confocal microscope | Olympus | FV1000 | |
| Chemicals and Reagents | |||
| 3-ethynylaniline | Sigma Aldrich | 498289-5G | |
| 384 well black plate | BD Biosciences | 353285 | |
| 4-12% Bis-Tris NuPAGE SDS gel | Invitrogen | NP0321BOX | |
| 4X LDS sample buffer | Invitrogen | NP0008 | |
| Acetic Acid | Fisher | A385-500 | |
| Acetonitrile | Sigma Aldrich | 271004-1L | |
| Alexa Fluor 647 azide | Invitrogen | A10277 | |
| Alexa Fluor 647 carboxylic acid, succinimidyl ester | Invitrogen | A20006 | |
| Amicon Ultra-0.5 ml Centrifugal Filters | Millipore | UFC501096 | 10 kDa cut-off |
| Aminoguanidine hydrochloride | Acros Organics | 36891-0250 | |
| Boric acid | Fisher | A74-500 | |
| Coomassie Brilliant Blue R-250 | Fisher | BP101-25 | |
| CsCl | Acros Organics | 42285-1000 | |
| DAPI | MP Biomedicals | 157574 | |
| Dimethyl sulfoxide | Fisher | BP231-100 | |
| Filter paper | Fisher | 09-801K | P5 grade |
| FITC anti-mouse CD31 | BioLegend | 102406 | |
| Goat serum | Invitrogen | 16210-064 | |
| KCl | Fisher | BP366-500 | |
| L-ascorbic acid sodium salt | Acros Organics | 35268-0050 | |
| Methanol | Fisher | A412P-4 | |
| MgCl2 | Fisher | BP214-500 | |
| Microscope slides | Fisher | 12-544-3 | |
| Microscope cover glass | VWR | 48366-277 | |
| MOPS buffer | Invitrogen | NP0001 | |
| mPEG-mal | Nanocs | PG1-ML-2k | MW 2000 |
| mPEG-N3 | Nanocs | PG1-AZ-5k | MW 5000 |
| mPEG-NHS | Nanocs | PG1-SC-5k | MW 5000 |
| NaCl | Fisher | BP358-212 | |
| Oregon Green 488 succinimidyl ester *6-isomer* | Invitrogen | O-6149 | |
| p-toluenesulfonic acid monohydrate | Acros Organics | 13902-0050 | |
| Permount | Fisher | SP15-100 | |
| Potassium phosphate dibasic | Fisher | BP363-1 | |
| Potassium phosphate monobasic | Fisher | BP362-1 | |
| Sodium acetate | Fisher | BP333-500 | |
| Sodium nitrite | Acros Organics | 42435-0050 | |
| Sodium sulfite | Amresco | 0628-500G | |
| Sucrose | Fisher | S6-500 | |
| TEM grid | Ted Pella | FCF-400Cu | |
| Tris base | Fisher | BP152-500 | |
| Triton X-100 | EMD Chemicals | TX1568-1 | |
| β-mercapt–thanol | Fisher | O3446I-100 | |
| Tissue Culture | |||
| Fetal bovine serum | Invitrogen | 12483-020 | |
| Hemocytometer | Fisher | 0267110 | |
| HT-29 cells | ATCC | HTB-38 | |
| L-glutamine | Invitrogen | 25030-080 | |
| PBS | Cellgro | 21-040-CV | |
| Penicillin-streptomycin | Invitrogen | 10378-016 | |
| RPMI-1640 | Invitrogen | 31800-089 | |
| Tissue culture flasks | Corning | 431080 | 175 cm2 |
| Trypan Blue | Thermo Scientific | SV30084.01 | |
| Trypsin, 0.05% (1X) with EDTA 4Na, liquid | Invitrogen | 25300-054 | |
| Animal Studies | |||
| 18% Protein Rodent Diet | Harlan Teklad | Teklad Global 2018S | Alfalfa free diet |
| Insulin syringe | BD Biosciences | 329410 | 28 gauge |
| Isoflurane | Baxter | AHN3637 | |
| Matrigel Matrix basement membrane | BD Biosciences | 356234 | |
| NCR nu/nu mice | CWRU School of Medicine Athymic Animal and Xenograft Core Facility |
||
| Sterile syringe | BD Biosciences | 305196 | 18 1/2 gauge |
| Tissue-Tek CRYO-OCT Compound | Andwin Scientific | 4583 | |
References
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