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Bioengineering

के लिए वायरल नैनोकणों doi: 10.3791/4352 Published: November 16, 2012

Summary

संयंत्र वायरल नैनोकणों (VNPs) biomedicine में आवेदन के लिए प्लेटफार्मों का वादा कर रहे हैं. यहाँ, हम संयंत्र VNP प्रचार, शुद्धि, लक्षण, और bioconjugation के लिए प्रक्रियाओं का वर्णन है. अंत में, हम ट्यूमर घर वापस आना और इमेजिंग एक माउस xenograft मॉडल और प्रतिदीप्ति इमेजिंग का उपयोग करने के लिए VNPs के आवेदन दिखा.

Protocol

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1. VNP प्रचार (CPMV, BMV, PVX, और TMV)

  1. सेट इनडोर संयंत्र चैम्बर दिन के 15 घंटे (100% प्रकाश, 25 डिग्री सेल्सियस, 65% आर्द्रता) और रात के 9 घंटा (0% प्रकाश, 22 डिग्री सेल्सियस, 60% आर्द्रता) को नियंत्रित करता है.
  2. तालिका 1 में समय के अनुसार पौधों टीका लगाना.
CPMV PVX, TMV, और BMV
0 दिन: संयंत्र 3 लोबिया / बीज बर्तन. 0 दिन: संयंत्र ~ 30 एन benthamiana बीज / बर्तन. 1 बड़ा चमचा उर्वरक / 5 एल पानी के साथ सप्ताह में एक बार खाद.
14 दिन: पुन पॉट एन benthamiana 1 संयंत्र / बर्तन पर.
दिन 10: संक्रमित CPMV (5 μg/50 / μl पत्ती) के साथ यांत्रिक कारबरंडम की ठोकरें प्रकाश का उपयोग कर टीका द्वारा प्राथमिक पत्ते छोड़ देता है. दिन 28: संक्रमित तीन से चive यांत्रिक कारबरंडम की ठोकरें प्रकाश का उपयोग कर टीका द्वारा PVX, TMV, या BMV (5 μg/50 / μl पत्ती) के साथ छोड़ देता है.
20 दिन: हार्वेस्ट पत्तियों और -80 में दुकान ° सी. 42 दिन: हार्वेस्ट पत्तियों और -80 में दुकान ° सी.

बढ़ रही है, संक्रमण, और पत्तियों कटाई के लिए टेबल समय 1.

नोट: केवल CPMV प्रचार एक उदाहरण के रूप में प्रदर्शन किया है.

2. VNP शोधन (CPMV, BMV, PVX, और TMV)

नोट: सभी चरणों को बर्फ पर बाहर किया जाता है या 4 डिग्री सेल्सियस

  1. ठंड बफर के 2 संस्करणों (2 तालिका देखें) का उपयोग एक मानक ब्लेंडर में जमे हुए पत्ते की 100 ग्राम homogenize. जाली के 2-3 परतों के माध्यम से फ़िल्टर.
  2. PVX के लिए, 6.5 1 एम एचसीएल का उपयोग करने के लिए पीएच समायोजित. 0.2 (w / v) ascorbic एसिड% और 0.2% (w / v) सोडियम sulfi जोड़ेंते.
  3. 20 मिनट के लिए 5500 XG पर कच्चे तेल संयंत्र homogenate अपकेंद्रित्र. तैरनेवाला ले लीजिए.
  4. BMV लिए, परत 10 (w / v)% sucrose समाधान के 5 मिलीग्राम से अधिक 25 तैरनेवाला मिलीलीटर. 38.5% CsCl समाधान (w / v) में 3 घंटा और resuspend छर्रों के लिए 9000 XG पर अपकेंद्रित्र. 5 घंटे के लिए झटकों से मिक्स, तो 2.12 कदम के साथ जारी है.
  5. (V / v) 01:01 क्लोरोफॉर्म :1-butanol 0.7 संस्करणों जोड़कर संयंत्र सामग्री निकालें. 30-60 मिनट के लिए मिश्रण हिलाओ.
  6. 20 मिनट के लिए 5500 XG पर समाधान अपकेंद्रित्र. ऊपरी चरण जलीय ले लीजिए.
  7. 0.2 एम और 8 (w / v)% खूंटी (8000 मेगावाट) NaCl जोड़ें. TMV के लिए भी 1% (v / v) ट्राइटन X-100. कम से कम 1 घंटा के लिए हिलाओ, तो कम से कम 1 घंटे के लिए बैठते हैं.
  8. 15 मिनट के लिए 15,000 XG पर समाधान अपकेंद्रित्र. बफर के 10 मिलीलीटर में Resuspend गोली. PVX के लिए, 0.5 एम. 0.1% β mercaptoethanol और यूरिया जोड़ें
  9. 30 मिनट के लिए 8000 XG पर अपकेंद्रित्र और सतह पर तैरनेवाला इकट्ठा.
  10. 3 घंटा के लिए 160.000 XG पर तैरनेवाला ultracentrifuge. 5 मिलीलीटर बफर ओ में Resuspend गोलीvernight.
  11. एक 10-40% sucrose ढाल का उपयोग कर 10% के बराबर मात्रा में, 20%, 30%, और बफर में 40% sucrose (1 भारी) तैयार है. ढाल रात कमरे के तापमान पर संतुलन में लाना करने की अनुमति दें.
  12. Ultracentrifuge 2 घंटा (BMV लिए 24 घंटे) लिए sucrose ढाल पर गोली 100.000 XG resuspended.
  13. प्रकाश बिखरने बैंड ले लीजिए और बफर के खिलाफ dialyze.
  14. 4 में (नीचे) VNPs और दुकान विशेषताएँ डिग्री सेल्सियस लंबी अवधि के भंडारण के लिए -80 पर दुकान डिग्री सेल्सियस
CPMV और TMV 0.1 एम पोटेशियम फॉस्फेट बफर (7.0 पीएच)
38.5 मिमी 2 KH पीओ 4
61.5 मिमी कश्मीर 2 4 HPO
PVX 0.5 एम borate बफर (7.8 पीएच)
0.5 एम बोरिक एसिड
NaOH साथ पीएच समायोजित
BMV SAMA बफर (4.5 पीएच)
250 मिमी सोडियम एसीटेट
10 मिमी 2 MgCl
2 मिमी β mercaptoethanol (ताजा जोड़ने के)

तालिका 2 और बफ़र प्रत्येक VNP के लिए उनके व्यंजनों.

नोट: केवल CPMV प्रचार एक उदाहरण के रूप में प्रदर्शन किया है.

3. VNP विशेषता (CPMV, BMV, PVX, और TMV)

  1. यूवी दिखाई / स्पेक्ट्रोस्कोपी का प्रदर्शन करने के लिए निर्धारित की एकाग्रता VNPs.
    1. नमूना के 2 μl एक NanoDrop स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग के absorbance उपाय.
    2. कणों और रंजक बीयर Lambert कानून का उपयोग की एकाग्रता का निर्धारण (एक = εcl, जहां एक absorbance है, ε विलुप्त होने गुणांक है, ग एकाग्रता है, और मैं पथ लंबाई है). पथ लंबाई NanoDrop के लिए 0.1 सेमी है.
      VNP विशिष्ट विलुप्त गुणांक हैं:
      CPMV: 8.1 सेमी -1 मिलीग्राम -1 मिलीलीटर (260 एनएम पर)
      पी.वी.एक्स: 2.97 सेमी -1 मिलीग्राम -1 मिलीलीटर (260 एनएम पर)
      TMV: 3.0 सेमी -1 मिलीग्राम -1 मिलीलीटर (260 एनएम पर)
      BMV: 5.15 सेमी -1 मिलीग्राम -1 मिलीलीटर (260 एनएम पर)
  2. तेजी से आकार अपवर्जन प्रोटीन तरल क्रोमैटोग्राफी (FPLC) द्वारा कणों का विश्लेषण.
    1. एक Superose 6 स्तंभ आकार अपवर्जन और ÄKTA एक्सप्लोरर, लोड 0.1 एम पोटेशियम फॉस्फेट बफर (7.0 पीएच) के 200 μl में VNPs 50-100 ग्राम का उपयोग.
    2. 260 एनएम (न्यूक्लिक एसिड), 280 एनएम (प्रोटीन), और किसी भी जुड़े रंगों की उत्तेजना तरंग दैर्ध्य डिटेक्टरों सेट.
    3. 72 मिनट के लिए 0.5 मिलीग्राम / मिनट की एक प्रवाह दर पर चलाएँ.
    4. क्षालन प्रोफाइल और A260: A280 एनएम यह इंगित करता है कि VNP तैयारी शुद्ध है और कि कणों बरकरार है और इकट्ठा कर रहे हैं.
      निम्नलिखित A260: 280 अनुपात एक शुद्ध VNP तैयारी का संकेत मिलता है:
      CPMV: 1.8 ± 0.1
      PVX: 1.2 ± 0.1
      TMV:1.1 ± 0.1
      BMV: 1.7 ± 0.1
  3. प्रदर्शन denaturing (NuPAGE पूर्व डाली) polyacrylamide बीआईएस Tris 4-12% ढाल जेल वैद्युतकणसंचलन व्यक्ति कोट प्रोटीन के लिए तैयारी और विकार की शुद्धता का विश्लेषण.
    1. पोटेशियम फॉस्फेट बफर के 9 μl में कणों के 10 ग्राम 4x LDS नमूना बफर के 3 मिलीलीटर जोड़ें. डीसल्फाइड बॉन्ड की उच्च संख्या को कम करने BMV 4x LDS नमूना बफर और β-mercaptoethanol के 3 μl के एक अतिरिक्त 1 μl जोड़ें.
    2. 100 पर 5 मिनट के लिए गर्मी ब्लॉक में सेते डिग्री सेल्सियस
    3. एसडीएस के एक जेल पर नमूने लोड.
    4. 1x बफर चल रहा MOPS में 1 घंटे के लिए 200 वी पर नमूने चलाएँ.
    5. यूवी प्रकाश के तहत जेल दस्तावेज़ फ्लोरोसेंट कोट प्रोटीन कल्पना.
    6. गैर फ्लोरोसेंट प्रोटीन के लिए, 1 घंटा के लिए Coomassie नीले (0.25% (w / v) Coomassie अच्छे ब्लू R-250, 30 (v / v)% मेथनॉल, 10% (v / v) एसिटिक एसिड) के साथ दाग.
    7. 30% मेथनॉल, 10% एसिटिक एसिड रातोंरात के साथ Destain. चानजीई समाधान यदि आवश्यक.
    8. सफेद रोशनी के तहत जेल दस्तावेज़.
  4. संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (मंदिर) द्वारा कणों की अखंडता का विश्लेषण.
    1. 0.1-1 मिलीग्राम / डि पानी की 20 μl में मिलीलीटर नमूने पतला.
    2. Parafilm पर नमूने के 20 μl बूँदें रखें.
    3. एक मंदिर ग्रिड के साथ बूँदें कवर और 2 मिनट के लिए बैठते हैं. फिल्टर पेपर के साथ ग्रिड पर अतिरिक्त समाधान बाती.
    4. डि पानी की एक बूंद पर रखने तो सूखी wicking ग्रिड धो लें.
    5. 2% की 20 μl ड्रॉप (w / v) 2 मिनट के लिए uranyl एसीटेट पर रखने के द्वारा ग्रिड दाग. फिल्टर पेपर के साथ दाग अधिक बाती.
    6. एक बार पानी में अधिक ग्रिड धो लें.
    7. एक संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप के तहत ग्रिड को देखें.

4. VNPs के खूंटी और fluorophores, शोधन, और विशेषता के साथ रासायनिक संयुग्मन

  1. नीचे प्रतिक्रियाओं के लिए गणना के लिए, VNPs के दाढ़ जन हैं:
    CPMV: 5.6x 10 6 / छ mol
    PVX: 35 x 10 6 छ / mol
    TMV: 41 x 10 6 छ / mol
    BMV: 4.6 x 10 6 छ / mol
  2. CPMV और PVX की सतह lysines एक एक कदम N-hydroxy succinimide युग्मन प्रतिक्रिया का उपयोग करने के लिए रंग और खूंटी संयुग्मी: 2,500 Alexa Fluor 647 succinimidyl एस्टर और 4500 समकक्ष के दाढ़ समकक्ष (सभी दाढ़ ज्यादतियों VNP प्रति दाढ़ अतिरिक्त देखें) जोड़ें एन एच एस खूंटी (5,000 मेगावाट) DMSO में 0.1 एम पोटेशियम फॉस्फेट बफर में CPMV को भंग कर दिया. PVX के साथ काम कर रहे हैं, एनएचएस डाई और एनएचएस खूंटी के एक 10,000 दाढ़ अतिरिक्त जोड़ने. बफर और DMSO ऐसी है कि CPMV और PVX के अंतिम एकाग्रता 2 मिलीग्राम / एमएल और DMSO कन्टेन्ट पर प्रतिक्रिया की कुल मात्रा के 10% है मात्रा समायोजित करें. प्रतिक्रिया मिश्रण कमरा प्रकाश से सुरक्षित तापमान पर रातोंरात सेते हैं. CPMV और PVX 300 और 1270 पता lysines क्रमशः है. (पाठक पर आगे पढ़ने के लिए निम्नलिखित संदर्भ के लिए भेजा हैCPMV और PVX की रासायनिक संशोधन: 13-15).
  3. संयुग्म रंगों और diazonium युग्मन द्वारा खूंटी TMV की tyrosines तांबे (मैं) उत्प्रेरित cycloaddition azide alkyne द्वारा पीछा किया.
    1. 0.3 M-p toluenesulfonic एसिड monohydrate, 3.0 एम सोडियम नाइट्राइट की 25 μl, और 0.68 एम 4 डिग्री सेल्सियस पर acetonitrile में 1 घंटे के लिए भंग 3 ethynylaniline आसुत के 75 μl के 400 μl मिश्रण के द्वारा diazonium नमक (alkyne) तैयार करें.
    2. Borate बफर, 8.8 पीएच, 100 मिमी NaCl TMV की 1.25 मिलीग्राम (20 मिलीग्राम / एमएल स्टॉक समाधान) युक्त 3.3 मिलीलीटर जोड़ें.
    3. 3 से जोड़ने के एक alkyne ligation लिए diazonium युग्मन TMV संभाल घंटा के लिए एक बर्फ स्नान में diazonium नमक समाधान (alkyne) के 450 μl के साथ TMV प्रतिक्रिया. समाधान एक हल्के भूरे रंग में बदल जाएगा. TMV विकार 2140 उपलब्ध tyrosines है.
    4. अंतिम एक sucrose कुशन का प्रयोग कर के रूप में 4.4 चरण में वर्णित उत्पाद शुद्ध.
    5. Azide कार्यात्मक Alexa Fluor 647 और खूंटी (5,000 मेगावाट) azide usin संलग्नg (आई) तांबे उत्प्रेरित cycloaddition azide-alkyne (CuAAC). 1 मिमी 4 CuSO, 2 मिमी AMG, और कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए 2 मिमी सोडियम ascorbate के साथ कोट प्रोटीन और सेते प्रति 2 डाई और खूंटी azide के समकक्ष जोड़ें. ऐसी है कि बफर मात्रा TMV के अंतिम प्रतिक्रिया एकाग्रता 2 मिलीग्राम / एमएल समायोजित करें. (16,17 पाठक TMV की रासायनिक संशोधन पर आगे पढ़ने के लिए निम्नलिखित संदर्भ के लिए भेजा है).
  4. BMV सिस्टीन उत्परिवर्ती (cBMV) cysteines lysines और खूंटी के लिए रंगों संयुग्मी:
    1. ओरेगन ग्रीन 488 succinimidyl एस्टर की 2,000 दाढ़ समकक्ष cBMV DMSO में 0.1 एम TNKM बफर (50 मिमी Tris आधार, 50 मिमी NaCl, 10 KCl मिमी, 5 मिमी 2 MgCl, पीएच 7.4) में भंग जोड़ें. बफर और DMSO ऐसी है कि BMV की अंतिम एकाग्रता 1 मिलीग्राम / एमएल और DMSO कन्टेन्ट पर प्रतिक्रिया की कुल मात्रा के 10% है मात्रा समायोजित करें. 4 में रात भर प्रतिक्रिया मिश्रण सेते ° C प्रकाश से रक्षा की.
    2. Purify centri कणों का उपयोगके रूप में विभिन्न संगतिपूर्ण सुरों वाले पद के सदृश फिल्टर 4.4 चरण में वर्णित है.
    3. 2,000 खूंटी maleimide (2000 मेगावाट) के दाढ़ अतिरिक्त के रूप में पहले ही प्रतिक्रिया की स्थिति का उपयोग जोडें और 4 में 2 घंटे के लिए प्रतिक्रिया मिश्रण सेते हैं डिग्री सेल्सियस cBMV 180 प्रतिक्रियाशील lysines और cysteines है. (18 पाठक BMV की रासायनिक संशोधन पर आगे पढ़ने के लिए निम्नलिखित संदर्भ के लिए भेजा है).
  5. शुद्धीकरण: एक 40% (w / v) 2.5 घंटे के लिए 160.000 XG में sucrose तकिया के माध्यम से समाधान दर्रा. बफर में गोली भंग. वैकल्पिक रूप से, 10 केडीए कट ऑफ स्पिन फिल्टर का उपयोग उचित बफर के खिलाफ dialyze.
  6. विशेषता: PEGylated और fluorescently लेबल VNPs ऊपर वर्णित तरीकों का उपयोग कर विश्लेषण कर रहे हैं: / यूवी दिखाई स्पेक्ट्रोस्कोपी, एसडीएस जेल वैद्युतकणसंचलन, FPLC, और मंदिर (नहीं दिखाया गया है, तथापि, 6 और 7 आंकड़े को देखें).

5. ट्यूमर लक्ष्यीकरण और इमेजिंग एक माउस xenograft मॉडल का उपयोग

  1. संस्कृति HT-29 RPMI मध्यम में मानव पेट के कैंसर कोशिकाओं 5% सीओ 2 175 सेमी 2 सेल संस्कृति बोतल का उपयोग कर में 5% FBS, 1% पेनिसिलिन - स्ट्रेप्टोमाइसिन, और 37 में 1% एल glutamine डिग्री सेल्सियस के साथ पूरक है.
  2. कोशिकाओं को दो बार trypsin EDTA के 5 मिलीलीटर के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए incubating द्वारा बाँझ पीबीएस और फसल के साथ धो लें. RPMI मध्यम के 5 मिलीलीटर साथ trypsin निष्क्रिय. 5 मिनट के लिए 500 XG centrifuging से कोशिकाओं को इकट्ठा. 4 डिग्री सेल्सियस और resuspend 5x10 6 cells/50 μl मध्यम (कुल सेल गिनती trypan नीले और एक hemocytometer का उपयोग कर का निर्धारण) ताजा RPMI में. Matrigel की एक समान मात्रा के साथ पूर्व मिश्रण इंजेक्शन (सभी समाधान अभिकर्मकों और बाँझ रखने).
  3. खरीद छह सप्ताह पुराने एनसीआर / परमाणु परमाणु चूहों और उन्हें 2 सप्ताह के लिए एक प्रकार का पौधा जो पशुओं के चारे के काम में आता है मुक्त भोजन पर बनाए रखने के. [ध्यान दें: सभी पशु प्रक्रिया होना चाहिए IACUC मंजूरी दे दी है.] चमड़े के नीचे का इंजेक्शन द्वारा ट्यूमर xenografts प्रेरित 5x10 cells/100 6 / flanks में μl ट्यूमर (2 ट्यूमर / माउस) एक 18 1/2 बाँझ गेज का उपयोगसुई. जानवरों नियमित रूप से निगरानी. ट्यूमर के आकार का उपयोग कर कैलिपरस उपाय और ट्यूमर 20 3 मिमी (अगले 12 दिनों के भीतर) के एक औसत मात्रा के लिए विकसित करने के लिए अनुमति देते हैं. पीबीएस और VNP (n बिंदु = 3 जानवरों समूह / / समय): दो अलग - अलग समूहों के लिए बेतरतीब ढंग से चूहों निरुपित. एक 1 मिलीलीटर 28 गेज इंसुलिन सिरिंज का उपयोग, नसों में पूंछ बाँझ पीबीएस के नस इंजेक्शन 100 μl या 10 मिलीग्राम / किग्रा VNP सूत्रीकरण द्वारा प्रशासन.

नोट: टिशू कल्चर और जीवित पशुओं के साथ प्रयोगों के अध्ययनों से दिखा नहीं किया जाएगा. हाथ पर प्रदर्शन ऊतक प्रसंस्करण और डाटा अधिग्रहण करने के लिए सीमित हो जाएगा. HT 29-ट्यूमर xenograft मॉडल पर एक संदर्भ के लिए, पाठक रेफरी को संदर्भित किया जाता है 19.

तीन तकनीक VNPs के घर वापस आना ट्यूमर का मूल्यांकन करने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं:

  1. अलग अलग समय बिंदुओं (2, 24, और 72 घंटे) में बलिदान चूहों सीओ 2 का उपयोग: प्रतिदीप्ति इमेजिंग Maestro इमेजिंग सिस्टम का उपयोगगैस. Flanks पर ट्यूमर के साथ साथ और जानवरों और आबकारी सभी प्रमुख अंगों (मस्तिष्क, हृदय, फेफड़े, तिल्ली, गुर्दे और जिगर) टुकड़े करना, parafilm पर ऊतकों जगह, और प्रतिदीप्ति इमेजिंग पीले उत्तेजना और उत्सर्जन फिल्टर का उपयोग करने के लिए साधन के साथ विश्लेषण (800 ms ) जोखिम के ऊतकों में फ्लोरोसेंट संकेतों (A647 VNPs संयुग्मित लेबल से व्युत्पन्न) की उपस्थिति का पता लगाने. छवियों को सहेजें और फ्लोरोसेंट ImageJ 1.44o सॉफ्टवेयर (तीव्रता का विश्लेषण http://imagej.nih.gov/ij ). समय के साथ अन्य प्रमुख ऊतकों के साथ ट्यूमर में VNPs के तेज के पैटर्न की तुलना करें.
  2. इमेजिंग के बाद, आधे में प्रत्येक ऊतक में कटौती और अक्टूबर मिश्रित में क्रायो सेक्शनिंग और confocal विश्लेषण के लिए एक आधा एम्बेड. पूर्व तौला क्रायो शीशियों में दूसरे आधे ले लीजिए और तुरंत उन्हें तरल एन 2 का उपयोग कर फ्रीज. स्टोर -80 डिग्री सेल्सियस पर आगे की प्रक्रिया के लिए तैयार है जब तक.
  3. प्रतिदीप्ति मात्रा का ठहराव पुन:कॉर्ड वजन ऊतकों. कमरे के तापमान पर पिघलना के फ्रोजन ऊतकों और उन्हें अलग 50 मिलीलीटर फाल्कन पीबीएस के 1 मिलीलीटर युक्त ट्यूबों में जगह. एक हाथ में ऊतक homogenizer का उपयोग, पीबीएस में 2-3 मिनट के लिए ऊतकों homogenize तो microfuge ट्यूबों homogenate हस्तांतरण. गैर homogenized ऊतक को दूर करने के लिए 13,000 XG पर 10 मिनट के लिए homogenates अपकेंद्रित्र.
  4. Pipet प्रत्येक समूह (पीबीएस और VNP योगों / समय अंक) से एक साथ 384 भी काले यूवी थाली में ऊतकों से सतह पर तैरनेवाला के 100 μl. प्रतिदीप्ति तीव्रता (/ भूतपूर्व उन्हें तरंगदैर्य 600/665) एक प्लेट रीडर का उपयोग का मूल्यांकन. ऊतकों के भार प्राप्त फ्लोरोसेंट मूल्यों सामान्यकरें.
  5. Immunohistochemistry: -20 डिग्री सेल्सियस में क्रायो - सूक्ष्म तक्षणी वर्गों (10 मीटर) और स्टोर तैयार सेल (DAPI) नाभिक और endothelial सेल मार्कर (विरोधी माउस FITC लेबल CD31 एंटीबॉडी) के लिए ऊतक वर्गों दाग. बाहर कैर्री confocal माइक्रोस्कोपी विश्लेषण fluorescently लेबल VNP की नाड़ी और इंट्रा - tumoral स्थानीयकरण नक्शाहै.

नोट: इस प्रक्रिया का प्रदर्शन नहीं किया जाएगा, प्रतिनिधि डेटा 8 चित्र में दिखाया गया हैं. Immunohistochemistry और वर्णित धुंधला हो जाना तरीकों पर एक संदर्भ के लिए, पाठक रेफरी के लिए संदर्भित किया जाता है 19.

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Discussion

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इस प्रोटोकॉल VNPs के लिए vivo ट्यूमर इमेजिंग में और उनके आवेदनों की रासायनिक संशोधन के लिए एक दृष्टिकोण प्रदान करता है. यहाँ प्रस्तुत पशु प्रतिदीप्ति इमेजिंग, प्रतिदीप्ति मात्रा का ठहराव, और immunohistochemistry तकनीक biodistribution अध्ययन और ट्यूमर घर वापस आना के मूल्यांकन के लिए उपयोगी होते हैं. इन तकनीकों मूल्यवान EPR नैनोकणों के प्रभाव के माध्यम से ट्यूमर के लिए उपयोग के बारे में जानकारी प्रदान करते हैं. विभिन्न विश्लेषणात्मक तरीकों से परिणामों के संयोजन से, हम VNPs के स्थानीयकरण biodistribution के मूल्यांकन के लिए एक शक्तिशाली दृष्टिकोण मिलता है.

इससे पहले कि इन अध्ययनों लेकिन किया जा सकता है, यह एक शुद्ध वायरस तैयारी प्राप्त करने के लिए आवश्यक है. अलावा यांत्रिक टीका से, VNP प्रसार के लिए एक संभावित विकल्प agroinfiltration है, जो एक उच्च परिवर्तन और संचय दर हो सकता है. जब VNPs प्रचार, देखभाल करने के लिए टी के रूप में अलग अलग वायरस से संक्रमित पौधों रखने के लिए लिया जाना चाहिएओ पार संक्रमण से बचने के. विशेष रूप से, TMV आसानी से फैल रहा है यंत्रवत् प्रेषित. के प्रति जागरूक होने के लिए एक और महत्वपूर्ण कदम बाहर ले जा रहा बर्फ पर या 4 डिग्री सेल्सियस पर वायरस शुद्धि सभी buffers बर्फ का ठंडा किया जाना चाहिए. कम तापमान proteases और ऑक्सीकरण संयंत्र सामग्री में मौजूद एंजाइमों का एक परिणाम के रूप में VNPs लिए किसी भी क्षति को रोकने के लिए आवश्यक है.

शुद्ध VNPs की कम पैदावार के कई कारकों से उत्पन्न हो सकती है. एक संभावित कारण प्रचार के लिए इस्तेमाल किया VNPs की उम्र का हो सकता है. यह अधिक हाल ही वायरस की तैयारी का उपयोग करने के लिए बेहतर है. उदाहरण के लिए, सी टर्मिनल CPMV की कोट प्रोटीन के 24 अमीनो एसिड जीन मुंह बंद के दमन के लिए आवश्यक हैं. इस सतह उजागर क्षेत्र के विलोपन proteolysis के कारण समय पर होता है. हालांकि संरचना और CPMV की स्थिरता प्रभावित नहीं हैं, वायरस के परिणामों के विकास मंदता और देरी फैल गया. कम पैदावार का एक अन्य स्रोत VNPs की शुद्धि के दौरान नुकसान है. पर विशेष रूप सेtention खूंटी वर्षण के बाद resuspension कदम को दी जानी चाहिए. गोली के अधूरा resuspension बाद centrifugation कदम की गोली में खो VNP में नतीजा होगा.

कुल मिलाकर, यहाँ प्रस्तुत bioconjugation chemistries सीधा कर रहे हैं 14,17,18,21 लक्षण वर्णन वर्णित तरीकों कण की अखंडता को सुनिश्चित करने और विकार की हद का निर्धारण करने के लिए बहुमूल्य हैं. दाढ़ ज्यादतियों तदनुसार आवेदन और वांछित functionalization की डिग्री के आधार पर समायोजित किया जा सकता है.

जब माउस xenograft मॉडल के साथ काम कर रहे हैं, सबसे जरूरी अभ्यास सड़न रोकनेवाला तकनीक का अनुसरण कर रहा है. इसके अलावा, पूंछ नस इंजेक्शन प्रत्येक माउस के लिए एक समान नमूना खुराक सुनिश्चित करने के लिए एक महत्वपूर्ण कदम है. यह गर्म पानी में पूंछ जगह पहले नस चौड़ा करना मदद मिल सकती है. दूसरा विचार यह प्रतिदीप्ति इमेजिंग और माप के लिए autofluorescence है. आम तौर पर, ऊतक autofluorescence minimiz हैएड 600 एनएम उत्सर्जन मॅक्सिमा साथ इमेजिंग जांच के रूप में 600 इष्टतम एनएम से परे लंबी तरंगदैर्य रंजक बनाने से परे. हालांकि, सामान्य माउस आहार क्लोरोफिल युक्त अल्फला, जो भी लाल fluoresces से मिलकर. नतीजतन, यह पृष्ठभूमि संकेतों को कम करने के लिए कम से कम 2 सप्ताह के लिए एक एक प्रकार का पौधा जो पशुओं के चारे के काम में आता है मुक्त आहार पर चूहों को बनाए रखने के लिए आवश्यक है. अंत में, यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि प्रतिदीप्ति प्रतिदीप्ति इमेजिंग का उपयोग पता लगाने के विभिन्न ऊतकों के बिखरने और अवशोषण वातावरण में मतभेद की वजह से सीमित है. नतीजतन, इमेजिंग दृश्य के लिए और निगरानी biodistribution के लिए एक प्रारंभिक पद्धति के रूप में प्रयोग किया जाता है, जबकि मात्रा का ठहराव के ऊतक homogenates उपयोग किया जाता है.

मंच प्रौद्योगिकी के रूप VNPs का उपयोग करने से कुछ लाभ उनके monodispersity, biocompatibility, पैमाने पर उत्पादन के लिए क्षमता, और कई functionalization रणनीति ज़िम्मा हैं. केमिकल इंजीनियरिंग के अलावा, जेनेटिक इंजीनियरिंग यहाँ introduc साथ सचित्र हैcysteines की tion bioconjugation के लिए एक लक्ष्य के रूप में BMV. जेनेटिक इंजीनियरिंग भी पेप्टाइड्स या आत्मीयता टैग को लक्षित परिचय करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. जबकि वर्णित प्रोटोकॉल दोहरे लेबल (डाई और खूंटी) कणों का इस्तेमाल करता है, चल रहे अध्ययन अतिरिक्त functionalities (यानी चिकित्सा विज्ञान, और लक्ष्य) को शामिल करने के लिए ऊतक विशिष्टता और चिकित्सीय प्रभावकारिता बढ़ाने में देख रहे हैं. इस प्रकार, इस दृष्टिकोण भविष्य जैव चिकित्सा अनुप्रयोगों के लिए आधार देता है.

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Disclosures

ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.

Acknowledgments

यह काम NIH / NIBIB अनुदान R00 (NFS) EB009105 और EB011317 P30 (NFS), एक NIH / NIBIB प्रशिक्षण अनुदान EB007509 T32 (AMW करने के लिए), एक केस वेस्टर्न रिजर्व विश्वविद्यालय अंतःविषय एलायंस निवेश ग्रांट (NFS) द्वारा समर्थित किया गया था, और एक मामले में व्यापक कैंसर केंद्र अनुदान P30 CA043703 (NFS). हम समर्थन पर हाथ Steinmetz लैब उनके लिए स्नातक छात्र शोधकर्ताओं धन्यवाद: नादिया Ayat, केविन चेन, सौरभ (सिड) डे, ऐलिस यांग, सैम अलेक्जेंडर, क्रेग डी 'क्रूज़, स्टीफन बगुला, लॉरेन Randolph, ब्रायन तो, और पॉल Chariou .

Materials

Name Company Catalog Number Comments
VNP production
Indoor plant chamber Percival Scientific E-41L2
V. unguiculata seeds (California black-eye no. 5) Burpee 51771A
N. benthamiana seeds N. benthamiana seeds were a gift from Salk Institute. Seeds are produced through plant propagation.
Carborundum Fisher C192-500
Pro-mix BX potting soil Premier Horticulture 713400
Jack's Professional 20-10-20 Peat-Lite Fertilizer JR Peters 77860
Equipment
50.2 Ti rotor Beckman 337901
SW 32 Ti rotor Beckman 369694
Optima L-90K ultracentrifuge Beckman 365672
SLA-3000 rotor Thermo Scientific 07149
SS-34 rotor Thermo Scientific 28020
Sorvall RC-6 Plus centrifuge Thermo Scientific 46910
Polypropylene bottle Beckman 355607 For SLA-3000 rotor
Polycarbonate bottle Beckman 357002 For SS-34 rotor
Ultra-Clear tube Beckman 344058 For sucrose gradient and SW 32 Ti rotor
Polycarbonate bottle Beckman 355618 For pelleting and 50.2 Ti rotor
NanoDrop spectrophotometer Thermo Scientific NanoDrop2000c
PowerEase 500 pre-cast gel system Invitrogen EI8675EU
Superose 6 10/300 GL (24 ml) size-exclusion column GE Healthcare 17-5172-01
ÄKTA Explorer 100 Chromatograph GE Healthcare 28-4062-66
Allegra X-12R Beckman 392302 Benchtop centrifuge
Cryostat Leica CM1850
Maestro 2 Caliper Life Sciences In vivo imaging system
Tissue-Tearor Biospec Products 985370-395
Microplate reader Tecan Infinite-200
Transmission electron microscope ZEISS Libra 200FE
FluoView laser scanning confocal microscope Olympus FV1000
Chemicals and Reagents
3-ethynylaniline Sigma Aldrich 498289-5G
384 well black plate BD Biosciences 353285
4-12% Bis-Tris NuPAGE SDS gel Invitrogen NP0321BOX
4X LDS sample buffer Invitrogen NP0008
Acetic Acid Fisher A385-500
Acetonitrile Sigma Aldrich 271004-1L
Alexa Fluor 647 azide Invitrogen A10277
Alexa Fluor 647 carboxylic acid, succinimidyl ester Invitrogen A20006
Amicon Ultra-0.5 ml Centrifugal Filters Millipore UFC501096 10 kDa cut-off
Aminoguanidine hydrochloride Acros Organics 36891-0250
Boric acid Fisher A74-500
Coomassie Brilliant Blue R-250 Fisher BP101-25
CsCl Acros Organics 42285-1000
DAPI MP Biomedicals 157574
Dimethyl sulfoxide Fisher BP231-100
Filter paper Fisher 09-801K P5 grade
FITC anti-mouse CD31 BioLegend 102406
Goat serum Invitrogen 16210-064
KCl Fisher BP366-500
L-ascorbic acid sodium salt Acros Organics 35268-0050
Methanol Fisher A412P-4
MgCl2 Fisher BP214-500
Microscope slides Fisher 12-544-3
Microscope cover glass VWR 48366-277
MOPS buffer Invitrogen NP0001
mPEG-mal Nanocs PG1-ML-2k MW 2000
mPEG-N3 Nanocs PG1-AZ-5k MW 5000
mPEG-NHS Nanocs PG1-SC-5k MW 5000
NaCl Fisher BP358-212
Oregon Green 488 succinimidyl ester *6-isomer* Invitrogen O-6149
p-toluenesulfonic acid monohydrate Acros Organics 13902-0050
Permount Fisher SP15-100
Potassium phosphate dibasic Fisher BP363-1
Potassium phosphate monobasic Fisher BP362-1
Sodium acetate Fisher BP333-500
Sodium nitrite Acros Organics 42435-0050
Sodium sulfite Amresco 0628-500G
Sucrose Fisher S6-500
TEM grid Ted Pella FCF-400Cu
Tris base Fisher BP152-500
Triton X-100 EMD Chemicals TX1568-1
β-mercapt–thanol Fisher O3446I-100
Tissue Culture
Fetal bovine serum Invitrogen 12483-020
Hemocytometer Fisher 0267110
HT-29 cells ATCC HTB-38
L-glutamine Invitrogen 25030-080
PBS Cellgro 21-040-CV
Penicillin-streptomycin Invitrogen 10378-016
RPMI-1640 Invitrogen 31800-089
Tissue culture flasks Corning 431080 175 cm2
Trypan Blue Thermo Scientific SV30084.01
Trypsin, 0.05% (1X) with EDTA 4Na, liquid Invitrogen 25300-054
Animal Studies
18% Protein Rodent Diet Harlan Teklad Teklad Global 2018S Alfalfa free diet
Insulin syringe BD Biosciences 329410 28 gauge
Isoflurane Baxter AHN3637
Matrigel Matrix basement membrane BD Biosciences 356234
NCR nu/nu mice CWRU School
of Medicine Athymic Animal and Xenograft Core Facility
Sterile syringe BD Biosciences 305196 18 1/2 gauge
Tissue-Tek CRYO-OCT Compound Andwin Scientific 4583

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References

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के लिए वायरल नैनोकणों<em&gt; Vivo में</em&gt; ट्यूमर इमेजिंग
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Wen, A. M., Lee, K. L., Yildiz, I., Bruckman, M. A., Shukla, S., Steinmetz, N. F. Viral Nanoparticles for In vivo Tumor Imaging. J. Vis. Exp. (69), e4352, doi:10.3791/4352 (2012).More

Wen, A. M., Lee, K. L., Yildiz, I., Bruckman, M. A., Shukla, S., Steinmetz, N. F. Viral Nanoparticles for In vivo Tumor Imaging. J. Vis. Exp. (69), e4352, doi:10.3791/4352 (2012).

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