Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Bioengineering

Virala Nanopartiklar för doi: 10.3791/4352 Published: November 16, 2012

Summary

Växtviral nanopartiklar (VNPs) är lovande plattformar för tillämpningar inom biomedicin. Här beskriver vi förfaranden för växt VNP förökning, rening, karakterisering och biokonjugering. Slutligen visar vi att tillämpa VNPs för tumör målsökande och avbildning med en modell mus xenotransplantat och fluorescens avbildning.

Abstract

Användningen av nanomaterial har potential att revolutionera materialvetenskap och medicin. För närvarande är ett antal olika nanopartiklar utreds för applikationer inom diagnostik och behandling. Virala nanopartiklar (VNPs) från växter kan betraktas som själv-monterade bionanomaterials med definierade storlekar och former. Växtvirus undersökta i Steinmetz labbet inkluderar ikosaedriska partiklar bildade av Cowpea mosaikvirus (CPMV) och Brome mosaikvirus (BMV), som båda är 30 nm i diameter. Vi utvecklar också stavformade och fintrådiga strukturer som härrör från följande växtvirus: Tobak (TMV), som utgör styva stavar med måtten 300 nm med 18 nm och potatis-virus X (PVX), som bildar filamentösa partiklar 515 nm i längd och 13 nm i bredd (hänvisas läsaren till ref. 1 och 2 för ytterligare information om VNPs).

i planta, är exceptionellt stabila och biokompatibla. Även VNPs är "programmerbara" enheter, som kan utvecklats särskilt med genetisk modifiering eller kemiska biokonjugering 3. Strukturen för VNPs är känt för atomär upplösning och modifieringar kan utföras med rumslig precision på atomär nivå 4, en nivå av kontroll som inte kan uppnås med syntetiska nanomaterial med nuvarande state-of-the-art-teknik.

I detta dokument beskriver vi spridning av CPMV, PVX, TMV och BMV i Vigna ungiuculata och Nicotiana benthamiana växter. Extraktion och rening protokoll för varje VNP ges. Metoder för karakterisering av renade och kemiskt märkta VNPs beskrivs. I denna studie fokuserar vi på chemical märkning av VNPs med fluoroforer (t.ex. Alexa Fluor 647) och polyetylenglykol (PEG). Färgämnena underlättar spårning och detektering av VNPs 5-10, och PEG minskar immunogeniciteten av proteinhaltiga nanopartiklar och samtidigt förbättra sina farmakokinetik 8,11. Vi visar tumör homing av PEGylerade VNPs med hjälp av en musmodell xenograft tumör. En kombination av fluorescens avbildning av vävnader ex vivo med användning av Maestro Imaging System, fluorescens kvantifiering homogeniserade vävnader, och konfokal mikroskopi används för att studera biodistribution. VNPs rensas via det retikuloendoteliala systemet (RES); tumör målsökande uppnås passivt genom den förbättrade permeabiliteten och behålla (EPR) effekt 12. Den VNP nanoteknik är en kraftfull plug-and-play-teknik för att bild och behandla områden av sjukdom in vivo. Vi vidareutvecklar VNPs att bära narkotika last och kliniskt relevanta grupperingar avbildning samt vävnadsspecifika ligander tillrikta molekylära receptorer överuttryckta i cancer och hjärt-kärlsjukdomar.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. SRb (CPMV, BMV, PVX och TMV) förökning

  1. Ställ inomhus anläggning kammaren kontroller till 15 timmar på dagen (100% ljus, 25 ° C, 65% luftfuktighet) och 9 timmar av natten (0% ljus, 22 ° C, 60% luftfuktighet).
  2. Inokulera växter enligt tidslinjen i tabell 1.
CPMV PVX, TMV, och BMV
Dag 0: Plantera 3 cowpea frön / kruka. Dag 0: Plantera ~ 30 N. benthamiana frön / kruka. Gödsla en gång i veckan med 1 matsked gödselmedel / 5 L vatten.
Dag 14: Re-pot N. benthamiana vid 1 anläggning / kruka.
Dag 10: Infect blad primära blad med CPMV (5 μg/50 ul / löv) genom mekanisk inokulering med en lätt damning av karborundum. Dag 28: Infect tre till fIve blad med PVX, TMV eller BMV (5 μg/50 ul / löv) genom mekanisk inokulering med en lätt damning av karborundum.
Dag 20: Harvest blad och förvara i -80 ° C. Dag 42: Harvest blad och förvara i -80 ° C.

Tabell 1. Tidslinje för odling, infektera, och skörda blad.

Obs: Endast CPMV utbredning visas som ett exempel.

2. SRb (CPMV, BMV, PVX och TMV) Rening

Obs: Alla steg utförs på is eller vid 4 ° C.

  1. Homogenisera 100 g frysta blad i en vanlig bländare med 2 volymer kall buffert (se tabell 2). Filtrera genom 2-3 skikt av ostduk.
  2. För PVX, justera pH till 6,5 med användning av 1 M HCl. Tillsätt 0,2% (vikt / volym) askorbinsyra och 0,2% (vikt / volym) natrium sulfite.
  3. Centrifugera homogenat rå anläggningen vid 5.500 xg under 20 minuter. Supernatanten.
  4. För BMV, skikt 25 ml supematant över 5 ml 10% (vikt / volym) sackaroslösning. Centrifugera vid 9.000 xg under 3 tim och återsuspendera pellets i 38,5% CsCl-lösning (vikt / volym). Blanda genom att skaka i 5 h och sedan fortsätta med steg 2,12.
  5. Extrahera växtmaterial genom att tillsätta 0,7 volymer av 1:1 (volym / volym) kloroform :1-butanol. Rör blandningen under 30-60 min.
  6. Centrifugera lösningen vid 5.500 xg under 20 minuter. Samla den övre vattenfasen.
  7. Lägg NaCl till 0,2 M och 8% (vikt / volym) PEG (molekylvikt 8.000). För TMV, också lägga 1% (volym / volym) Triton X-100. Rör om i minst 1 timme, låt stå under minst 1 timme.
  8. Centrifugera lösningen vid 15.000 xg under 15 minuter. Återsuspendera pelleten i 10 ml buffert. För PVX, tillsätt 0,1% β-merkaptoetanol och urea till 0,5 M.
  9. Centrifugera vid 8.000 xg i 30 min och supernatanten.
  10. Ultracentrifug supernatanten vid 160.000 xg under 3 timmar. Återsuspendera pelleten i 5 ml buffert Overnight.
  11. Bered en 10-40% sackarosgradient användning av lika volymer av 10%, 20%, 30%, och 40% sackaros i buffert (tyngsta först). Låt gradienten ekvilibrera över natten vid rumstemperatur.
  12. Ultracentrifug återsuspenderas pellets över sackarosgradient vid 100.000 xg under 2 timmar (24 timmar för BMV).
  13. Samla ljusspridande band och dialysera mot buffert.
  14. Karakterisera VNPs (nedan) och förvara vid 4 ° C. För långtidsförvaring, förvara vid -80 ° C.
CPMV och TMV 0,1 M kaliumfosfatbuffert (pH 7,0)
38,5 mM KH 2 PO 4
61,5 mM K 2 HPO 4
PVX 0,5 M boratbuffert (pH 7,8)
0,5 M borsyra
Justera pH-värdet med NaOH
BMV SAMA buffert (pH 4,5)
250 mM natriumacetat
10 mM MgClj 2
2 mM β-merkaptoetanol (tillsätt färsk)

Tabell 2. Buffertar och deras recept för varje VNP.

Obs: Endast CPMV utbredning visas som ett exempel.

3. SRb (CPMV, BMV, PVX och TMV) Karakterisering

  1. Utför UV / synligt spektroskopi för att bestämma koncentrationen av VNPs.
    1. Mät absorbansen hos 2 il prov med användning av en spektrofotometer NanoDrop.
    2. Bestäm koncentrationen av partiklar och färgämnen använder Beer-Lambert lagen (A = εcl, där A är absorbansen, ε är extinktionskoefficienten, c är koncentrationen, och L är våglängden). Den ljuspassagelängden 0,1 cm för NanoDrop.
      De VNP-specifika extinktionskoefficienter är:
      CPMV: 8,1 cm -1 -1 mg ml (vid 260 nm)
      PVX: 2,97 cm -1 -1 mg ml (vid 260 nm)
      TMV: 3,0 cm -1 -1 mg ml (vid 260 nm)
      BMV: 5,15 cm -1 -1 mg ml (vid 260 nm)
  2. Analysera partiklar genom size exclusion snabb protein vätskekromatografi (FPLC).
    1. Användning av en Superose 6 size exclusion-kolonn och ÄKTA Explorer belastning 50-100 pg VNPs i 200 pl 0,1 M kaliumfosfatbuffert (pH 7,0).
    2. Ställ detektorer till 260 nm (nukleinsyra), 280 nm (protein), och excitationsvåglängden hos alla bifogade färgämnen.
    3. Kördes vid en flödeshastighet av 0,5 ml / min under 72 minuter.
    4. Elueringsprofilen och A260: A280 nm visar om VNP preparatet är ren och om partiklarna är intakta och monteras.
      Följande A260: 280 förhållanden indikerar en ren VNP beredning:
      CPMV: 1,8 ± 0,1
      PVX: 1,2 ± 0,1
      TMV:1,1 ± 0,1
      BMV: 1,7 ± ​​0,1
  3. Utför denaturerande (förgjutna NuPAGE) Bis-Tris polyakrylamid 4-12% gradientgelelektrofores att analysera renheten i sina förberedelser och konjugering till enskilda höljesproteiner.
    1. Tillsätt 3 ml 4x LDS provbuffert till 10 pg av partiklarna i 9 il kaliumfosfatbuffert. Tillsätt ytterligare 1 pl 4x LDS provbuffert och 3 pl av β-merkaptoetanol för att BMV att minska det höga antalet disulfidbindningar.
    2. Inkubera i värmeblock under 5 min vid 100 ° C.
    3. Fyll prover på en SDS-gel.
    4. Köra prover vid 200 V under 1 timme i 1x MOPS löpbufferten.
    5. Dokumentera gelen under UV-ljus för att synliggöra fluorescerande höljeproteiner.
    6. För icke-fluorescerande protein, färgas med Coomassie-blått (0,25% (vikt / volym) Coomassie Brilliant Blue R-250, 30% (volym / volym) metanol, 10% (volym / volym) ättiksyra) under 1 timme.
    7. Avfärga med 30% metanol, 10% ättiksyra över natten. ChanGE lösningen om så erfordras.
    8. Dokumentera gelén under vitt ljus.
  4. Analysera integriteten av partiklar genom transmissionselektronmikroskopi (TEM).
    1. Späd prover till 0,1-1 mg / ml i 20 pl avjoniserat vatten.
    2. Placera 20 | il droppar av proverna på parafilm.
    3. Täck droppar med TEM-galler och låt sitta i 2 minuter. Veke av överskott lösningen på gallret med filterpapper.
    4. Tvätta nätet genom att placera en droppe avjonat vatten och sedan suga torr.
    5. Stain rutnät genom att placera på en 20 | il droppe av 2% (vikt / volym) uranylacetat under 2 min. Wick bort överskottet fläcken med filterpapper.
    6. Tvätta nätet en gång i vatten.
    7. Observera nät enligt ett transmissionselektronmikroskop.

4. Kemisk Konjugering av VNPs med PEG och fluoroforer, rening och karakterisering

  1. För beräkningar för reaktionerna nedan, den molära massan av VNPs är:
    CPMV: 5,6x 10 6 g / mol
    PVX: 35 x 10 6 g / mol
    TMV: 41 x 10 6 g / mol
    BMV: 4,6 x 10 6 g / mol
  2. Konjugat färgämnen och PEG till ytan lysiner i CPMV och PVX med en enstegs-N-hydroxisuccinimid kopplingsreaktion: Lägg 2.500 molekvivalenter (alla molära överskott avser molärt överskott per SRb) av Alexa Fluor 647 succinimidylester och 4.500 ekvivalenter NHS- PEG (molekylvikt 5.000) upplöstes i DMSO till CPMV i 0,1 M kaliumfosfatbuffert. När du arbetar med PVX, lägg till en 10.000 molöverskott av NHS-dye och NHS-PEG. Justera buffert och DMSO volymer så att den slutliga koncentrationen av CPMV och PVX är 2 mg / ml och DMSO innehållet är 10% av den totala reaktionsvolymen. Inkubera reaktionsblandningen över natten vid rumstemperatur skyddad från ljus. CPMV och PVX har 300 och 1.270 adresserbara lysiner, respektive. (Läsaren hänvisas till följande referenser för vidare läsning omkemisk modifiering av CPMV och PVX: 13-15).
  3. Conjugate färgämnen och PEG till tyrosiner i TMV by diazonium koppling följt av koppar (I)-katalyserad azid-alkyn cykloaddition.
    1. Förbered diazoniumsalt (alkyn) genom att blanda 400 pl 0,3 M p-toluensulfonsyramonohydrat, 25 | il 3,0 M natriumnitrit, och 75 | il av 0,68 M destillerad 3-etynylanilin upplöst i acetonitril vid 4 ° C under 1 timme.
    2. Lägg 3,3 ml boratbuffert, pH 8,8, innehållande 100 mM NaCl till 1,25 ml av TMV (20 mg / ml stamlösning).
    3. Reagera TMV med 450 pl av diazoniumsaltet (alkyn) lösning i ett isbad under 3 h för att lägga till en alkyn ligering handtag att TMV genom diazo-koppling. Lösningen kommer att förvandlas till en Ijusbrun färg. TMV har 2.140 tillgängliga tyrosiner för konjugering.
    4. Rena den slutliga produkten med en sackaros-kudde såsom beskrivs i steg 4,4.
    5. Fäst azid-funktionell Alexa Fluor 647 och PEG-azid (MW 5.000) using koppar (I)-katalyserad azid-alkyn cykloaddition (CuAAC). Tillsätt 2 ekvivalenter färgämne-och PEG-azid per höljesprotein och inkubera med 1 mM CuSO 4, 2 mM AMG, och 2 mM natriumaskorbat vid rumstemperatur under 15 minuter. Justera volymen buffert så att den slutliga reaktionen koncentrationen av TMV är 2 mg / ml. (Läsaren hänvisas till följande referenser för vidare läsning om kemisk modifiering av TMV: 16,17).
  4. Konjugat färgämnen till lysiner och PEG till cysteiner av BMV Cysteinmutant (cBMV):
    1. Lägg 2.000 molära ekvivalenter av Oregon Green 488 succinimidylester löst i DMSO till cBMV i 0,1 M tonkm buffert (50 mM Tris-bas, 50 mM NaCl, 10 mM KCI, 5 mM MgClj 2, pH 7,4). Justera buffert och DMSO volymer så att den slutliga koncentrationen av BMV är 1 mg / ml och DMSO innehållet är 10% av den totala reaktionsvolymen. Inkubera reaktionsblandningen över natten vid 4 ° C, skyddat från ljus.
    2. Renodla partiklar med centrifufugal filter som beskrivs i steg 4,4.
    3. Lägg 2.000 molärt överskott av PEG-maleimid (MW 2.000) med användning av samma reaktionsbetingelser som tidigare och inkubera reaktionsblandningen under 2 h vid 4 ° C. cBMV har 180 reaktiva lysiner och cysteiner. (Läsaren hänvisas till följande referenser för vidare läsning om kemisk modifiering av BMV: 18).
  5. Rening: Passera lösningen genom en 40% (vikt / volym) sukroskudde vid 160.000 xg under 2,5 timmar. Återupplösa pelleten i buffert. Alternativt dialysera mot lämplig buffert med 10 kDa cut-off spin filter.
  6. Karaktärisering: PEGylerade och fluorescensmärkt VNPs analyseras med användning av ovan beskrivna metoder: UV / synlig spektroskopi, SDS-gelelektrofores, FPLC, och TEM (ej visad, men se fig. 6 och 7).

5. Tumörmålsökning och avbildning med en modell mus xenograft

  1. Kultur HT-29 human koloncancer-celler i RPMI-medium kompletterat med 5% FBS, 1% penicillin-streptomycin och 1% L-glutamin vid 37 ° C i 5% CO 2 med användning 175 cm 2 cellodlingsflaskor.
  2. Tvätta cellerna två gånger med steril PBS och skörd genom inkubering med 5 ml trypsin-EDTA vid 37 ° C under 5 minuter. Inaktivera trypsinet med 5 ml RPMI-medium. Samla cellerna genom centrifugering vid 500 xg under 5 minuter. vid 4 ° C och återsuspendera i färskt RPMI vid 5x10 celler/50 6 il medium (bestämma totala cellantalet med trypanblått och en hemocytometer). Blanda med en lika stor volym av Matrigel före injektion (hålla alla lösningar och reagens steril).
  3. Upphandlar sex veckor gamla NCR nu / nu möss och behålla dem på en alfalfa fri kost i 2 veckor. [Anmärkning:. Samtliga djurförsök måste IACUC godkänd] Framkalla tumörxenografter genom subkutan injektion av 5x10 6 celler/100 ul / tumör i flankerna (2 tumörer / mus) med hjälp av en 18 1/2 gauge sterilnål. Övervaka djuren regelbundet. Mät tumörstorlek med skjutmått och låta tumörerna att växa till en genomsnittlig volym av 20 mm 3 (inom de närmaste 12 dagarna). Tilldela möss till två olika grupper slumpmässigt: PBS och VNP (n = 3 djur / grupp / tidpunkt). Med användning av en 1 ml 28 gauge spruta, administrera genom intravenös injektion i svansvenen 100 pl sterilt PBS eller 10 mg / kg VNP formulering.

Obs: Vävnadsodlingsplattor experiment och studier med levande djur kommer inte att visas. Hands-on demonstration kommer att begränsas till vävnad bearbetning och datainsamling. För en referens på HT-29 tumör xenotransplantatmodell, hänvisas till ref. 19

Tre tekniker används för att utvärdera tumör homing av VNPs:

  1. Fluorescens avbildning med Maestro Imaging System: Sacrifice möss vid olika tidpunkter (2, 24, och 72 timmar) med CO 2gas. Dissekera djur och punktskatter alla större organ (hjärna, hjärta, lungor, mjälte, njurar och lever) tillsammans med tumörerna på flankerna, placera vävnaderna på parafilm och analysera med fluorescens avbildning instrument med gul excitation och filter utsläpp (800 ms exponering) för att detektera närvaron av fluorescerande signaler i vävnaderna (härrörande från A647 konjugerad till VNPs). Spara bilderna och analysera fluorescensintensiteter med ImageJ 1.44o programvara ( http://imagej.nih.gov/ij ). Jämför mönstret upptaget av VNPs i tumörer med andra viktiga vävnader med tiden.
  2. Efter avbildning, skär varje vävnad i halv och bädda en halv i oktober förening för kryo-snittning och konfokala analys. Samla den andra hälften i förvägda Cryo-flaskor och omedelbart frysa dem med flytande N 2. Lagra vid -80 ° C tills redo för ytterligare bearbetning.
  3. Fluorescens kvantifiering: Record vävnader vikter. Tina frysta vävnader vid rumstemperatur och placera dem i separata 50 ml Falcon-rör innehållande 1 ml PBS. Med hjälp av en handhållen vävnadshomogenisator, homogenisera vävnaderna för 2-3 minuter i PBS och sedan överföra homogenatet till mikrofugrör. Centrifugera homogenaten under 10 min vid 13.000 xg för att avlägsna icke-homogeniserad vävnad.
  4. Pipettera 100 | il av supernatanten från vävnaderna från varje grupp (PBS och VNP formuleringar / poäng tid) till en 384 väl svart UV-platta. Utvärdera fluorescensintensitet (EX / Em våglängderna 600/665) med en plattläsare. Normalisera de erhållna fluorescerande värdena av vävnad vikter.
  5. Immunohistokemi: Förbered kryo-mikrotomen sektioner (10 um) och förvara vid -20 ° C. Stain vävnadssnitt för cellkärnor (DAPI) och endotelial cellmarkör (FITC-märkt anti-mus-CD31-antikropp). Utför konfokalmikroskopi analys för att kartlägga det vaskulära och intratumoral lokalisering av fluorescensmärkt VNPs..

Obs: Denna procedur kommer inte att visas, är representativa uppgifter som visas i figur 8. För hänvisning när immunohistokemi och de beskrivna metoderna färgning hänvisas till ref. 19

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Detta protokoll ger en strategi för kemisk modifiering av VNPs och deras tillämpningar för in vivo tumöravbildning. Djuret fluorescens avbildning, fluorescens kvantifiering och immunohistokemi tekniker som presenteras här är användbara för att studera biodistribution och utvärdera tumör homing. Dessa tekniker ger värdefull information om tillgång av nanopartiklar till tumören via EPR effekten. Genom att kombinera resultaten från de olika analysmetoder, får vi en kraftfull metod för att utvärdera lokalisering och biodistributionen av VNPs.

Innan dessa studier kan utföras är emellertid nödvändigt att erhålla en ren virusberedning. Bortsett från mekanisk ympning, är ett möjligt alternativ för VNP förökning agroinfiltration, vilket kan ha en hög omvandling och ackumulering takt. När förökningsmaterial av VNPs, bör man hålla växter infekterade med olika virus separat som to undvika korskontaminering. I synnerhet, är TMV lätt sprids och överförs mekaniskt. En annan avgörande steg att vara uppmärksam på utför virus rening på is eller vid 4 ° C. Alla buffertar ska användas iskall. Den lägre temperaturen är nödvändig för att förhindra skador på VNPs följd av proteaser och oxiderande enzymer närvarande i växtmaterialet.

Låga utbyten av renade VNPs kan uppstå från flera faktorer. En möjlig orsak kan vara ålder VNPs används för förökning. Det är föredraget att använda nyare virusberedningar. Till exempel, de C-terminala 24 aminosyrorna av S-höljesproteinet av CPMV är nödvändiga för undertryckande av geners. Deletion av denna yta-exponerade området sker över tiden på grund av proteolys. Även om strukturen och stabiliteten av CPMV inte påverkas, tillväxthämning och fördröjd spridning av viruset resultaten. En annan källa till låg avkastning är förlust av VNPs under rening. Särskilt påmärksamhet bör ges på resuspension steget efter PEG-fällning. Ofullständig återsuspension av pelleten skulle resultera i SRb förlorade i pelleten av det efterföljande centrifugeringssteget.

Totalt sett biokonjugering kemiska presenteras här är enkel. 14,17,18,21 De karakterisering beskrivna metoderna är värdefulla för att säkerställa partikel integritet och bestämma omfattningen av konjugering. Molära överskott kan justeras beroende på tillämpningen och graden av funktionalisering önskas.

När du arbetar med musen xenotransplantatmodell, är den viktigaste praxis efter aseptisk teknik. Dessutom är svansveninjektion ett kritiskt steg för att säkerställa en enhetlig dos prov för varje mus. Det kan hjälpa till att placera svansen i varmt vatten i förväg för att dilatera venen. En annan faktor är autofluorescens för fluorescens avbildning och mätning. Generellt är vävnad autofluorescens minimized efter 600 nm, vilket gör långa våglängder färgämnen med emissionsmaxima över 600 nm optimala som avbildningssonden. Emellertid normala mus diet består av klorofyll-innehållande alfalfa, som också fluorescerar rött. Som ett resultat, är det nödvändigt att behålla de möss på ett alfalfa diet under minst 2 veckor för att reducera bakgrundssignaler. Slutligen bör det noteras att fluorescensdetektering använder fluorescensavbildning är begränsad på grund av skillnader i spridningen och absorptionen miljöerna i olika vävnader. Följaktligen avbildning används för visualisering och som ett första metod för övervakning biodistribution, medan kvantifiering utförs med användning vävnadshomogenat.

Några fördelar med att använda VNPs som plattform tekniken är deras monodispersitet, biokompatibilitet, kapacitet för uppskalning produktion och mottaglighet för flera funktionalisering strategier. Förutom kemiteknik, är genteknik illustreras här med införandetning av cysteiner att BMV som ett mål för biokonjugering. Genetisk ingenjörskonst skulle också kunna användas för att införa målsökande peptider eller taggar affinitet. Medan protokollet som beskrivs använder dubbla märkta (färgämne och PEG) partiklar, pågående studier tittar på införliva ytterligare funktioner (dvs. läkemedel och inriktning) för att öka vävnadsspecificitet och terapeutisk effekt. Således fastställs i denna strategi grunden för framtida biomedicinska tillämpningar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Inga intressekonflikter deklareras.

Acknowledgments

Detta arbete stöddes av NIH / NIBIB bidrag R00 EB009105 (till NFS) och P30 EB011317 (till NFS), en NIH / NIBIB utbildningsstipendium T32 EB007509 (till AMW), en Case Western Reserve University Interdisciplinary Alliance investeringsbidrag (till NFS), och ett fall Comprehensive Cancer Center bidrag P30 CA043703 (till NFS). Vi tackar Steinmetz Lab doktorand forskare för deras praktiska stöd: Nadia Ayat, Kevin Chen, Sourav (Sid) Dey, Alice Yang, Sam Alexander, Craig D'Cruz, Stephen Hern, Lauren Randolph, Brian Så och Paul Chariou .

Materials

Name Company Catalog Number Comments
VNP production
Indoor plant chamber Percival Scientific E-41L2
V. unguiculata seeds (California black-eye no. 5) Burpee 51771A
N. benthamiana seeds N. benthamiana seeds were a gift from Salk Institute. Seeds are produced through plant propagation.
Carborundum Fisher C192-500
Pro-mix BX potting soil Premier Horticulture 713400
Jack's Professional 20-10-20 Peat-Lite Fertilizer JR Peters 77860
Equipment
50.2 Ti rotor Beckman 337901
SW 32 Ti rotor Beckman 369694
Optima L-90K ultracentrifuge Beckman 365672
SLA-3000 rotor Thermo Scientific 07149
SS-34 rotor Thermo Scientific 28020
Sorvall RC-6 Plus centrifuge Thermo Scientific 46910
Polypropylene bottle Beckman 355607 For SLA-3000 rotor
Polycarbonate bottle Beckman 357002 For SS-34 rotor
Ultra-Clear tube Beckman 344058 For sucrose gradient and SW 32 Ti rotor
Polycarbonate bottle Beckman 355618 For pelleting and 50.2 Ti rotor
NanoDrop spectrophotometer Thermo Scientific NanoDrop2000c
PowerEase 500 pre-cast gel system Invitrogen EI8675EU
Superose 6 10/300 GL (24 ml) size-exclusion column GE Healthcare 17-5172-01
ÄKTA Explorer 100 Chromatograph GE Healthcare 28-4062-66
Allegra X-12R Beckman 392302 Benchtop centrifuge
Cryostat Leica CM1850
Maestro 2 Caliper Life Sciences In vivo imaging system
Tissue-Tearor Biospec Products 985370-395
Microplate reader Tecan Infinite-200
Transmission electron microscope ZEISS Libra 200FE
FluoView laser scanning confocal microscope Olympus FV1000
Chemicals and Reagents
3-ethynylaniline Sigma Aldrich 498289-5G
384 well black plate BD Biosciences 353285
4-12% Bis-Tris NuPAGE SDS gel Invitrogen NP0321BOX
4X LDS sample buffer Invitrogen NP0008
Acetic Acid Fisher A385-500
Acetonitrile Sigma Aldrich 271004-1L
Alexa Fluor 647 azide Invitrogen A10277
Alexa Fluor 647 carboxylic acid, succinimidyl ester Invitrogen A20006
Amicon Ultra-0.5 ml Centrifugal Filters Millipore UFC501096 10 kDa cut-off
Aminoguanidine hydrochloride Acros Organics 36891-0250
Boric acid Fisher A74-500
Coomassie Brilliant Blue R-250 Fisher BP101-25
CsCl Acros Organics 42285-1000
DAPI MP Biomedicals 157574
Dimethyl sulfoxide Fisher BP231-100
Filter paper Fisher 09-801K P5 grade
FITC anti-mouse CD31 BioLegend 102406
Goat serum Invitrogen 16210-064
KCl Fisher BP366-500
L-ascorbic acid sodium salt Acros Organics 35268-0050
Methanol Fisher A412P-4
MgCl2 Fisher BP214-500
Microscope slides Fisher 12-544-3
Microscope cover glass VWR 48366-277
MOPS buffer Invitrogen NP0001
mPEG-mal Nanocs PG1-ML-2k MW 2000
mPEG-N3 Nanocs PG1-AZ-5k MW 5000
mPEG-NHS Nanocs PG1-SC-5k MW 5000
NaCl Fisher BP358-212
Oregon Green 488 succinimidyl ester *6-isomer* Invitrogen O-6149
p-toluenesulfonic acid monohydrate Acros Organics 13902-0050
Permount Fisher SP15-100
Potassium phosphate dibasic Fisher BP363-1
Potassium phosphate monobasic Fisher BP362-1
Sodium acetate Fisher BP333-500
Sodium nitrite Acros Organics 42435-0050
Sodium sulfite Amresco 0628-500G
Sucrose Fisher S6-500
TEM grid Ted Pella FCF-400Cu
Tris base Fisher BP152-500
Triton X-100 EMD Chemicals TX1568-1
β-mercapt–thanol Fisher O3446I-100
Tissue Culture
Fetal bovine serum Invitrogen 12483-020
Hemocytometer Fisher 0267110
HT-29 cells ATCC HTB-38
L-glutamine Invitrogen 25030-080
PBS Cellgro 21-040-CV
Penicillin-streptomycin Invitrogen 10378-016
RPMI-1640 Invitrogen 31800-089
Tissue culture flasks Corning 431080 175 cm2
Trypan Blue Thermo Scientific SV30084.01
Trypsin, 0.05% (1X) with EDTA 4Na, liquid Invitrogen 25300-054
Animal Studies
18% Protein Rodent Diet Harlan Teklad Teklad Global 2018S Alfalfa free diet
Insulin syringe BD Biosciences 329410 28 gauge
Isoflurane Baxter AHN3637
Matrigel Matrix basement membrane BD Biosciences 356234
NCR nu/nu mice CWRU School
of Medicine Athymic Animal and Xenograft Core Facility
Sterile syringe BD Biosciences 305196 18 1/2 gauge
Tissue-Tek CRYO-OCT Compound Andwin Scientific 4583

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Description of Plant Viruses [Internet]. Association of Biologists. Warwick, UK. Available from: http://dpvweb.net/ (2012).
  2. Carrillo-Tripp, M., Shepherd, C. M., Borelli, I. A., Venkataraman, S., Lander, G., Natarajan, P., Johnson, J. E., Brooks, C. L., Reddy, V. S. VIPERdb2: an enhanced and web API enabled relational database for structural virology. Nucl. Acids Res. 37, 436-442 (2009).
  3. Pokorski, J. K., Steinmetz, N. F. The art of engineering viral nanoparticles. Mol. Pharm. 8, 29-43 (2011).
  4. Steinmetz, N. F., Lin, T., Lomonossoff, G. P., Johnson, J. E. Structure-based engineering of an icosahedral virus for nanomedicine and nanotechnology. Curr. Top Microbiol. Immunol. 327, 23-58 (2009).
  5. Jung, B., Rao, A. L., Anvari, B. Optical Nano-Constructs Composed of Genome-Depleted Brome Mosaic Virus Doped with a Near Infrared Chromophore for Potential Biomedical Applications. ACS Nano. (2011).
  6. Leong, H. S., Steinmetz, N. F., Ablack, A., Destito, G., Zijlstra, A., Stuhlmann, H., Manchester, M., Lewis, J. D. Intravital imaging of embryonic and tumor neovasculature using viral nanoparticles. Nat. Protoc. 5, 1406-1417 (2010).
  7. Leopold, P. L., Ferris, B., Grinberg, I., Worgall, S., Hackett, N. R., Crystal, R. G. Fluorescent virions: dynamic tracking of the pathway of adenoviral gene transfer vectors in living cells. Hum. Gene Ther. 9, 367-378 (1998).
  8. Lewis, J. D., Destito, G., Zijlstra, A., Gonzalez, M. J., Quigley, J. P., Manchester, M., Stuhlmann, H. Viral nanoparticles as tools for intravital vascular imaging. Nat. Med. 12, 354-360 (2006).
  9. Steinmetz, N. F., Ablack, A. L., Hickey, J. L., Ablack, J., Manocha, B., Mymryk, J. S., Luyt, L. G., Lewis, J. D. Intravital imaging of human prostate cancer using viral nanoparticles targeted to gastrin-releasing Peptide receptors. Small. 7, 1664-1672 (2011).
  10. Wu, C., Barnhill, H., Liang, X., Wang, Q., Jiang, H. A new probe using hybrid virus-dye nanoparticles for near-infrared fluorescence tomography. Optics Communications. 255, 366-374 (2005).
  11. Steinmetz, N. F., Cho, C. F., Ablack, A., Lewis, J. D., Manchester, M. Cowpea mosaic virus nanoparticles target surface vimentin on cancer cells. Nanomedicine (Lond). 6, 351-364 (2011).
  12. Maeda, H., Wu, J., Sawa, T., Matsumura, Y., Hori, K. Tumor vascular permeability and the EPR effect in macromolecular therapeutics: a review. Journal of Controlled Release. 65, 271-284 (2000).
  13. Chatterji, A., Ochoa, W., Paine, M., Ratna, B. R., Johnson, J. E., Lin, T. New addresses on an addressable virus nanoblock: uniquely reactive Lys residues on cowpea mosaic virus. Chem. Biol. 11, 855-863 (2004).
  14. Steinmetz, N. F., Mertens, M. E., Taurog, R. E., Johnson, J. E., Commandeur, U., Fischer, R., Manchester, M. Potato virus X as a novel platform for potential biomedical applications. Nano Lett. 10, 305-312 (2010).
  15. Wang, Q., Lin, T., Tang, L., Johnson, J. E., Finn, M. G. Icosahedral virus particles as addressable nanoscale building blocks. Angew. Chem. Int. Ed. 41, 459-462 (2002).
  16. Bruckman, M. A., Kaur, G., Lee, L. A., Xie, F., Sepulveda, J., Breitenkamp, R., Zhang, X., Joralemon, M., Russell, T. P., Emrick, T., Wang, Q. Surface modification of tobacco mosaic virus with "click" chemistry. Chembiochem. 9, 519-523 (2008).
  17. Schlick, T. L., Ding, Z., Kovacs, E. W., Francis, M. B. Dual-surface modification of the tobacco mosaic virus. J. Am. Chem. Soc. 127, 3718-3723 (2005).
  18. Yildiz, I., Tsvetkova, I., Wen, A. M., Shukla, S., Masarapu, M. H., Dragnea, B., Steinmetz, N. F. Engineering of Brome mosaic virus for biomedical applications. RSC Advances. (2012).
  19. Brunel, F. M., Lewis, J. D., Destito, G., Steinmetz, N. F., Manchester, M., Stuhlmann, H., Dawson, P. E. Hydrazone ligation strategy to assemble multifunctional viral nanoparticles for cell imaging and tumor targeting. Nano Lett. 10, 1093-1097 (2010).
  20. Shukla, S., Ablack, A., Wen, A., Lee, K., Lewis, J., Steinmetz, N. F. Increased tumor homing and tissue penetration of the filamentous plant viral nanoparticle Potato virus X. Molecular Pharmaceutics. (2012).
  21. Chatterji, A., Ochoa, W., Shamieh, L., Salakian, S. P., Wong, S. M., Clinton, G., Ghosh, P., Lin, T., Johnson, J. E. Chemical conjugation of heterologous proteins on the surface of Cowpea mosaic virus. Bioconjug. Chem. 15, 807-813 (2004).
Virala Nanopartiklar för<em&gt; In vivo</em&gt; Tumöravbildning
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wen, A. M., Lee, K. L., Yildiz, I., Bruckman, M. A., Shukla, S., Steinmetz, N. F. Viral Nanoparticles for In vivo Tumor Imaging. J. Vis. Exp. (69), e4352, doi:10.3791/4352 (2012).More

Wen, A. M., Lee, K. L., Yildiz, I., Bruckman, M. A., Shukla, S., Steinmetz, N. F. Viral Nanoparticles for In vivo Tumor Imaging. J. Vis. Exp. (69), e4352, doi:10.3791/4352 (2012).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter