Summary
要了解免疫反应和行为之间的联系，我们描述了一种方法来测量运动的行为中
Abstract
甲之间复杂的相互作用的免疫反应和主机行为已经描述了在很宽的范围内的物种。过量的睡眠，特别是，已知作为响应于在哺乳动物中1感染发生，最近也被描述在果蝇 2。人们普遍接受，睡眠在感染的主机是有益的，并且是很重要的一个强有力的免疫系统3,4的维护。然而，支持这一假说的实验证据表明，是有限的4，和多余的睡眠期间的免疫应答的功能尚不清楚。我们使用了多学科的方法来解决这个复杂的问题，果蝇果蝇的简单遗传模型系统，进行研究。我们使用标准的分析测量在果蝇的自发行为，睡眠，并演示了如何使用该法是衡量行为的苍蝇infecteD与细菌的致病性菌株的。该试剂盒也可以用于监测感染的持续时间期间在个别蝇的生存。免疫功能的其他措施包括清除感染，并是在果蝇的天然免疫反应的核心，一个关键的转录因子NFκB的激活能力的苍蝇。生存结果，并在感染细菌清除感染性和耐受性的指标。抵抗是指苍蝇清除感染的能力，而容差定义为主机的能力的限制感染造成的损害，从而尽管有很高水平的系统5内的病原体生存。在感染过程中的实时的NFκB活动的监测提供了洞察生存在感染过程中的分子机制。利用果蝇在这些简单的分析，有利于睡眠的遗传和分子生物学分析和免疫反应，这两个复杂的系统如何往复影响。
Protocol
该协议使用的设置（ 图1）获得4个不同的读数收集苍蝇的细菌感染。这些输出包括：1）睡眠/唤醒的行为; 2）生存结果; 3）细菌负荷在飞; 4）实时测量体内的的NFκB记者活动。结合，也可在果蝇的遗传工具，这些测量提供机械洞察分子免疫功能和行为之间的联系。
1。测量运动及睡眠苍蝇
- 已安装用于测量运动及睡觉的苍蝇，其中包括果蝇活动监测的的系统（DAM2，Trikinetics），孵化器，黑暗的房间，并编写的动物实验和活动管，以前6。同样的方法用在这里，有一些小的修改。
- 活动管清洗再利用，通过在去离子水的热板上煮沸。少量的洗涤剂中加入第一煮沸，管以及漂洗和煮沸两次以上。如果是用来堵塞的管纱，用于活动管（含食品，蜡，苍蝇和纱线），可清洗，恕不另行清除的纱。
- 在此之前启动一个实验，后期蛹上演的地方文化苍蝇孵化器为三到四天，以适应实验的照明和其他环境条件。光：暗或不变的条件下，已被广泛用于衡量睡眠行为。在这个例子中，苍蝇驯化恒定的光，消除影响生物钟的免疫反应和行为2,7,8。如在图1A中描述的6，记录前至少三天的感染。
2。感染与致病性细菌的苍蝇
- 这里所描述的协议是特定为 S。 粘质沙雷氏菌 ，这是很容易的成长和维护。协议的长期存储和培养条件的其他细菌物种会有所不同。S.粘质沙雷氏菌在15％至50％的甘油在-80℃下存储要准备长期储存，混合2卷1体积的高压灭菌50％的甘油过夜培养的菌液（OD 600 = 0.5 - 1.0）在1.5ml离心管中。这将导致在最终的甘油浓度为17％。存储管在-80℃下为了制备一个短期中使用的细菌源，刮去无菌200μl的移液管尖，冷冻的股票的LB琼脂平板上进行三通条纹。下孵育过夜，37＆D例如，C分离菌落。该板在4℃下存放
排定感染的前一天，从LB琼脂平板挑取单个菌落，无菌200μl的移液管尖和淹没的前端到含有5毫升LB培养基中培养管中。培养细菌过夜，或最多16小时的孵化器内振动筛，在37℃和250 rpm，直到它达到在指数生长期。的浓度进行测定，用分光光度计在OD 600。在这个阶段的浓度范围从0.5至1。如果浓度过高，继代培养的细菌和生长另一个几个小时，以得到一个最佳浓度。火源附近执行的程序。向培养基中加入某些细菌的抗生素耐药性菌株的设计和生长，并选择适当的抗生素，S.粘质沙雷氏菌 （ATCC＃8100）是对抗生素有抗药性，因此，生长在不含抗生素的无菌介质中。为了验证无菌技术，做一个模拟的丘尔再没有细菌作为对照。
感染苍蝇的解决方案包含细菌（稀释至OD 600 = 0.1）和1％的食用色素（亮蓝FCF），在PBS中。准备感染溶液和1％在PBS中的蓝色的食品着色中使用的LB培养基中加入等当量的溶液的喷射控制。在冰上的存储解决方案。 - 准备玻璃针注射苍蝇。拉玻璃毛细管（OD = 1毫米，ID = 0.58毫米，WPI）以精尖，用微量拉出器（成茂）。在解剖显微镜下，用细钳子折断的针的前端，使该开口大到足以填满与注射流体用注射器通过施加抽吸，但足够小，以尽量减少在注射过程中损坏对苍蝇。打破了头，烙铁头尺寸应该大约为40-50微米。玻璃针与管的长度为连接到一个3毫升的塑料注射器。手动施加正压或s注射介质的流动的控制，减税与注射器。避免污染的橡胶管，注射器装置与注射流体被用于感染和控制注射。
- 麻醉苍蝇，把它们在CO 2焊垫。 CO 2通过一个密封的容器中的水加湿垫和减少静电，可以操纵的苍蝇复杂的焊盘上。注入苍蝇进入该地区的背胸盾片以上的玻璃针戳。成飞注射介质通过验证由食品着色 - 苍蝇变成蓝色作为食品着色通过系统传播。细菌，苍蝇接受的剂量可以量化为第3节所述，在下面。一些实验性的设计，包括接收，对照组注射PBS和食用色素，但没有细菌的苍蝇无菌损伤。
3。确定细菌负荷
方法之一evaluatin克的抗细菌感染的免疫应答是确定的细菌负荷感染后。D。果蝇是一个很好的模型，以确定此参数，因为整个飞可以匀浆估算总细菌数在个别。此协议的背后的基本原理是，如Luria液体培养基（LB）上的陪替氏培养皿的琼脂（LB平板）在固体培养基上生长时，一个单一的细菌形成可见的区别的菌落。因此，通过均质化感染苍蝇在LB液体培养基中，生成的匀浆物的系列稀释液，并传播到LB平板稀释的匀浆，感染苍蝇的细菌细胞的数量可以被确定。应该用来验证，没有与其他细菌物种的污染，感染的对照组注射PBS和食用色素，但没有细菌的苍蝇。不应该有任何在此条件下的LB琼脂平板上的菌落。
- 高压灭菌，将用于此的所有材料程序，然后再进行实际的同质化步骤。这包括200微升吸头切剪刀，LB培养基，用于同质化和杵。准备板，通过蒸压LB /琼脂培养基浇成10厘米的无菌培养皿中至少有1天前均质苍蝇。
- 麻醉和收集苍蝇的1.5 ml微量离心管和存储管上的冰。
- 附近的火焰，以防止污染进行同质化。尤其是当包含苍蝇的控制同质化，无感染，建议使用的细菌菌株，如S.粘质沙雷氏菌 ，这是不对抗生素有抗药性。均质的最小的2组10苍蝇每实验条件。的数目来确定用于每匀浆苍蝇由实验者。有些团体已使用每一个飞匀浆，这是有用的，以评估细菌负荷变化之间的苍蝇8，而另一些则使用3-10苍蝇每匀浆比较不同基因型或实验条件9-12。
- 加入400μlLB培养基中，每个离心管中含有苍蝇，并用一个小电机和杵（Kontes）的同质化。
- 使用灭菌切割枪头，串行1:10 1.5微升的微量离心管中，含有180微升的LB培养基中加入20μl匀浆的LB /细菌培养基稀释匀浆。切吸头飞的碎片和防止堵塞，确保适当的音量被转移。
- 稀释因子是凭经验确定，取决于基因型的飞，所使用的细菌菌株，和实验条件。对于野生型果蝇感染S.粘质沙雷氏菌 ，使用稀释液1:10 2或1:10 3苍蝇匀浆感染后立即，和苍蝇匀浆稀释1:10 4或1:10 5 24小时后感染。
- 加入100μlLB /细菌培养基从话筒rocentrifuge，管中含有的最终稀释度和传播介质上使用玻璃球（VWR）的LB平板上，以确保均匀分布。
- 丢弃到100％的乙醇溶液的玻璃球。放置的LB板中，在37℃培养箱中培养过夜。
- 作为一个可选步骤，使用可见光的成像系统，以获得图像的LB平板上（电泳凝胶成像8900的Alpha Innotech公司）。计数的菌落的数量无论是在板本身或从Photoshop软件（Adobe Photoshop CS3中）使用的计数工具板的图像。
- 计算的数目的菌落形成单位每飞使用下面的公式：[π/（N * D * v时）] * V，其中n = LB平板上生长的菌落数; N =苍蝇的数目汇集在一微量离心管中，D =稀释因子;和v =溶液的体积分散到每块板; V =初始体积的匀浆。
4。评价睡眠和感染后的生存期
- 为测量细菌负荷的苍蝇，没有收获，持续监测行为再过7-10天。生存的持续时间由基因型的苍蝇，环境条件的影响，并用于感染的细菌种类。
- 〜10天之后，终止实验，下载和处理行为数据，如前面描述的6。 Insomniac2定制软件，它是基于在Matlab中，用来分析睡眠参数。重要的是要消除死苍蝇从行为分析。通常情况下，这限制了分析，在感染后的第一天之内，取决于感染的类型和苍蝇的基因型。在测定中的死亡表示由所有活动计数达到零的时间。为了便于分析求生存，Drosonex，自定义编写的软件在Microsoft Visual C + + 6.0，用于处理从的Trikinetics DAM系统的原始数据文件。软件Excel文件，每个飞的存活时间（小时），编译报告活动DAT一个从所有的显示器到一个单一的电子表格，报告的百分比飞存活时间的推移由用户设定。 Excel文件的设计融入其他统计软件包进行进一步的分析。
5。使用荧光素酶报告基因在感染过程中，测量NFκB活动
苍蝇在本实验中使用转基因κB-luc的产生Kuo 等人所描述的，2010年2。简言之，κB-luc的记者包含8个重复的NFκB的结合序列，启动子插入荧光素酶的开放阅读框的上游。
- 调整苍蝇在1.2节中描述的实验的照明条件。在这个例子中，1-4日龄κB-luc的苍蝇都装在小瓶含5％蔗糖，2％琼脂食物的媒介，并放置在恒定的光（LL）2天达到同年龄的其他果蝇在感染过程中。
- 准备一个96孔微孔板苍蝇。在各孔中的食物介质含有2层，（ 图2）;顶端层中含有荧光素，荧光素酶的基板。加入300微升的5％的蔗糖，2％琼脂溶液，向每个孔中，并允许固化。接下来，添加50微升的顶层每个孔中含有5％的蔗糖，1％琼脂，和2mM萤光素（金生物技术公司）。在文献中用于测量的记者活动在果蝇中有各种不同的荧光素浓度，并已低至100μM13。所需的浓度可以凭经验确定。在分配食品层之间，用细网布，以促进干燥，同时保持无菌覆盖板。板应彻底干燥，长达一小时，以防止苍蝇停留在冷凝水滴。由于萤光素是光敏感，避免露出光板超过必要的。
- 应用透明的粘合剂膜（上密封-A，Perkin Elmer公司制），以一个96孔的微孔板上和多孔的2的孔，每孔的量使用的微细针。这些孔将不仅使空气交换，每孔，而且还提供了一种以个人为基础麻醉苍蝇。使用锋利的刀片和直边，引进削减各列之间。这将提供一个简单的方法，8个一组的加载/卸载苍蝇的一次。
要加载到微孔板的苍蝇，从孵化器和麻醉苍蝇在CO 2焊垫取出小瓶。负载过得一个 - 酮，每个孔中的柱列。如果飞在不经意间被卡住的粘接密封，独自离开苍蝇，因为他们往往能够释放自己没有干预。微孔板的孵化器，LL为8-24小时，以适应新的环境和消耗的萤光素底物。 - 培养细菌，S.粘质沙雷氏菌 ，以及感染如上所述制备溶液。
- 麻醉吨他通过使用微量吸移管连接到一个低压CO 2行的小费苍蝇。将直接上面的为每个孔的通风孔的微量吸移管前端。注意，以确保CO 2压力是足够高，麻醉的苍蝇，但低到足以避免损伤对苍蝇。在八组，单独传送每个飞的CO 2焊盘，并感染如上所述。感染后，返回到原来的每个飞和重新密封微孔板。
- 测量发光（TOPCOUNT-NXT的发光及闪烁计数器; Perkin-Elmer公司）。的TOPCOUNT发光计数器包含堆叠盒板，它允许编程和自动读数连续递增任何长度的时间（通常长达五天）。此功能并不适用于所有的仪器和数据收集与其他仪器进行实验，因此可能不那么频繁。发光计数器装在一个RO嗡与受控的温度和照明时刻表。当加载到堆叠带板，堆叠板之间的苍蝇清晰的空白板，以确保苍蝇接收光。计划光度计，根据制造商的规格，收集读数，每隔一小时至少24小时。在此示例中，检测器被编程，读取各孔，持续10秒，并表达的结果作为每秒的计数（任意单位）。这个值是平均每口井在3个读数。导出到电子表格中的数据文件和执行标准的分析，图表发光的结果。
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Representative Results
- 感染促进睡眠。在这个例子中，广交会-S（CS）的野生型苍蝇和突变果蝇缺乏NFκB基因，Relish的 （ 相对E20）14，装入两个DAM2活动监视器（每组32为每个基因型）和感染如上所述。苍蝇保持在恒定的光，消除影响生物钟的行为和感染2,7,8。 相对E20的突变体isogenized CS如前所述，11。这两组的苍蝇感染S.粘质沙雷氏菌 ，其结果如图3中所示。在某些情况下，一个附加的处理的对照组是很有用的，用于差分从感染2的效果的处理的效果。处理的对照组的暴露于相同的环境变化作为受感染的组，其中包括从孵化器和麻醉状态的时间相同的持续时间中的去除，但它们不接收注射剂。然而，在这个例子中，它是明确的， 相对E20突变体的经验较少的睡眠比CS控制苍蝇感染后（ 图3A）。如前所述6，有其他行为的参数，可以测量从DAMS测定。这些可能包括单位时间内的总活动数（ 图3B）。在这个例子中，感染后镜，睡眠活动的变化。我们还报告活动率，或活动计数每醒着的分钟（ 图3C）。此参数是在果蝇的运动能力的指标之一。在这种情况下，唤醒活动率不改变在任一基因型在感染过程中，这表明，在睡眠中的活性或增加的减少是不运动能力降低的结果。
- 图4A示出的速率在 感染后的生存。与以前的研究结果14,15一致， 相对E20突变体中的迅速屈服于fection相比，野生型苍蝇。大多数果蝇幸存下来的无菌注射（ 图4B），这表明果蝇屈服于感染，而不是由于注射的伤害。由于所津津乐道突变这么快就去世了，只有CS苍蝇被用来证明细菌感染后的负载（ 图5）。图5表明，S.沙雷氏菌增殖在飞24小时后感染。
- 萤光素酶报告基因活性描绘跨越时间在四个单独的苍蝇（ 图6）中的测定。数据点之间的大的变化和个人蝇可以归因于井内走动苍蝇。虽然该信号是来自于所有的组织内的飞，预期不会，每一个组织会放出相同量的信号，和到检测器的可见性的组织会随动态移动。在这个例子中，苍蝇感染和比较处理的对照组。苍蝇死被排除从分析图7A中的苍蝇在一组。死苍蝇，通过目测来确定。在这些苍蝇，有急剧下降的荧光素酶的信号，以及在信号变化减少，表明动态是不动的。κB-luc的报告基因活性稳步上升感染后（ 图7A）和无菌损伤（ 图7B ）。记者的活动高峰，约12小时后损伤和感染后。预计修改κB-luc的活性在感染过程中遗传和/或行为操作的苍蝇。例如，我们前面介绍的2κB-luc的活性，诱导主要是抑制相对E20突变体在感染过程中，具体到NFκBκB-luc的记者。
图1。概述测量在果蝇的免疫反应的主要步骤的流程图，（A）的步骤顺序概述用于测量睡眠，存活和感染过程中的细菌负荷，（B）的步骤顺序是概述用于测量的NFκB依赖在感染过程中的荧光素酶报告基因活性。实验可以持续1-5天，这取决于使用的细菌种类的杀伤力。
图2。的个人微孔板示意图。苍蝇被放置在不透明介质和覆盖如图所示的96孔板中。因为苍蝇会被单独处理被感染的，重要的是吨Ø每块板的苍蝇数目限制的金额可以合理管理在给定的时间内，根据实验的情况下。
图3。苍蝇感染S.的行为反应沙雷氏菌 （A）。 平均值±SEM％的时间，苍蝇略去的睡眠和（B）的平均数±SEM总活性计数绘制在S一起前，感染后4小时1天递增沙雷氏菌 。 （C）平均±SEM活动计数每清醒分钟前（BL =基准）和S.感染后粘质沙雷氏菌绘制，增量为8小时。报告行为的野生型CS果蝇存活至少24小时后感染，免疫缺陷相对E20飞THA吨存活了至少8小时后感染。 N = 13，CS和相对E20。 * = P <0.01和P <0.05，学生的 T -测试。
图4。 （A）代表Kaplan-Meier生存曲线绘制野生型CS和免疫缺陷相对E20苍蝇的感染S. 感染和未感染的果蝇的生存结果。 沙雷氏菌 。 = 8.13x 10 -13，秩和检验记录。 CS和N，N = 31 = 32 相对E20苍蝇。 （B）代表Kaplan-Meier生存曲线（A）报告，，除了苍蝇收到无菌注射液体介质中无细菌的损伤。几乎所有的苍蝇无菌伤害中幸存下来，直到实验结束（伤后60小时）。 P> 0.97，日志ŕANK测试，N = 32为CS 和 Rel E20苍蝇。
图5。与S.苍蝇感染的细菌负荷的量化沙雷氏菌 。（A）的代表细菌培养从CS苍蝇感染S.沙雷氏菌 ，收获后立即感染（左图），或24小时后，感染（右图）。以下各图所示稀释的因素。在这个例子中，10的苍蝇为每个组在400μl溶液匀浆。加入100μl的最终稀释度伸长到每块板。左侧板包含29个菌落形成单位（cfu）。要计算CFU /飞，分29个菌落形成单位[10苍蝇* 0.001（稀释倍数）×100微升蔓延到板（卷），相等于29，然后乘以初始体积为400μL= 11,600。对于这个特殊的板，我们有一个平均1.16×10 4CFU /飞。右侧面板中包含257的殖民地。使用相同的公式，我们发现，平均1.03×10 6 CFU /飞。 （B）计算CFU /飞后，每块板在每个实验条件下，生成箱须图，如图所示。在这个例子中，第25，第50（中位数）和第75百分位的底部，中部和顶部的盒子。误差棒表示标准偏差在三个独立的实验。 * P <0.01学生的t检验。
图6。在个别苍蝇感染S.NFκB依赖的荧光素酶报告粘质沙雷氏菌的原始数据的代表性例子示出个别的未受感染的苍蝇（处理控制;左图）和受感染的苍蝇（右面板）。一个基线阅读（0）收集感染前或处理所有其他时间点收集的后苍蝇治疗。注意规模中的感染和处理的控制条件的苍蝇之间在y轴的差异。可能是由于大的变化的信号在每个飞飞微孔内的移动。
图7。感染S.沙雷氏菌或伤害，注射用无菌增加κB-luc的记者生活苍蝇的活动。平均±SEM荧光素酶活性（任意单位）绘制每4小时（A）的所有苍蝇感染或受伤的无菌注射剂（B）和存活达至24在测定中。重复测量的单因素方差分析表明，记者的活动在受感染的显着增加（P <0.05），受伤（损伤; P <0.01），处理CON控制（HC，P <0.01），组相对于他们的基线（'0'; Tukey的事后）。 （插入，A组）：从HC组的数据绘制在不同的层面。在HC组的记者活动小而显着增加，苍蝇可能遇到的轻度压力或增加觉醒处理转移到微孔板和麻醉相当于从被感染的苍蝇。感染者和受伤的群体表现出较强的诱导κB-luc的活性明显高于HC组在指定的时间点。* = P <0 .05; ** P <0 .01;学生的 T -测试;（A）N = 20 HC和13例感染;（B）N = 15 HC和n = 14伤。
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Discussion
该协议概述的方法来研究如何行为，特别是睡眠，是与免疫反应参数。这些参数包括细菌量，存活的结果，和NFκB活性在体内荧光素酶报告。这些参数提供了一只苍蝇可以对抗感染的信息。细菌和生存结果是涉及一个简单的测量果蝇的免疫反应参数。 相对E20突变体，缺乏NFκB转录因子，是中央的免疫反应，屈服于迅速细菌感染。遗传性或其他操作的行为也可能影响这些免疫反应参数，可能是通过影响NFκB活动的本身。例如，睡眠剥夺前增加感染的津津有味的mRNA的表达，并降低CFU /飞相对于非剥夺控制11。牡丹TS的时钟基因， 期 7和永恒的 8，另据报道，在感染的存活率减少，以及细菌清除8。使用这种方法的进一步研究，预计可提供机械洞察行为可能会如何影响免疫功能。
我们在这里描述的注入/感染过程被修改从先前由吴等人 16所述方法。本程序是简单的和廉价的。然而，一个缺点是，手动控制的注射量与使用的染料，作为一个指标是粗的，并可以有助于变异。其他团体使用，使一个微量注射器一个不断注入量17，或有刺的苍蝇用针蘸细菌培养18。然而，这里介绍的方法已成功地检测在整个实验条件下的细菌清除11,19 </ SUP>。
通常在感染过程中的苍蝇生存定量计算剩余的苍蝇在规律的时间间隔。这里我们使用Trikinetics的DAM系统监控的死亡时间在个别苍蝇，表示停止活动。我们已经验证了结果所确定的自发活动的生存活动中的苍蝇在感染过程中管（未出版）通过目视检查确定是一样的。该方法也被用于先前测量寿命20,21。然而，重要的是要注意在DAM系统的生存，评价是有限的，在孤立的苍蝇，预计从这种状态中所获得的结果是从那些在分组的条件不同。早期的研究表明，当主机处于生存与隔离条件22组的差异。最近的研究还证实，成群的苍蝇的寿命更长比在孤立苍蝇20。
以前使用了荧光素酶报告基因活性，在生活蝇（例如，参考文献23）的时钟基因的表达进行分析。在这些情况下，以及其他的技术方面的考虑是必要的，特别是荧光素衬底耗尽发生在数天的运行试验。相反，这里描述的检测不限于受感染的苍蝇的生存，在感染后的24小时以上涉及一个简单的测量。一个重复测量的方差分析是足够的，以评估在每个组从基线的变化。统计方法来分析一昼夜振荡的荧光素酶记者，随着正常化的步骤，纠正为底物消耗的充分讨论，其他地方24。在任何一种情况下，测量实时记者在个别苍蝇的活动是一种更有效的方法，用于提取有关其时间动态比站ndard生化和免疫组织化学检测。
然而，监测荧光素酶报告基因活性在体内的一个潜在的缺点是，它是依赖于苍蝇吃萤光素衬底。厌食症已与感染的苍蝇，和喂养也不同类型的感染或基因型间25。为了规避关注摄入衬底，苍蝇可以被解剖到单独的身体部位或组织的感染后，如前所述，26和报告基因活性，可以测量在培养。或者，从荧光素酶测定的结果也可以使用一个标准的检测，即不依赖于馈送验证。例如，定量PCR是一种常用的方法来测量的抗微生物肽（AMP）的mRNA的表达水平。放大器是已知的NFκB的目标，因此表明它的活跃程度。
代表DAT一个NFκB随着免疫的挑战和随后的睡眠增加2重述以前的工作。但是，我们提醒读者，睡眠，在Trikinetics DAM系统的指示停止活动至少连续五个分27。测量睡在飞的录像也依赖于闲置28。感染期间在果蝇此睡眠定义可能是有问题的，因为它也被称为免疫挑战的动物将成为不活泼的不睡觉29长时间。为了克服这个问题，检测的措施感官的反应是必要的，以验证苍蝇是睡着了。研究者已经确定苍蝇感官刺激，如铅笔抽头30，刷涂木棒31，或加热的管27的一端的活动管的反应速度。在所有的情况下，睡眠过得不那么敏感（测量值响应延迟或按百分比比清醒苍蝇，苍蝇响应为一组）。我们发现，感染的果蝇都在睡觉确实减少感官刺激到6-8小时后感染（千人国和JA·威廉姆斯，未发表的观察）。尽管有技术上的限制，Trikinetics的DAM系统提供一个高吞吐量的优势，在果蝇睡眠和免疫功能的遗传和分子之间的联系，探索未来的研究将是有益的。
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Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
这项工作是由美国国家科学基金会的支持下授予＃IOS-1025627，由美国国立卫生研究院资助项目＃1R21NS078582-01 JAW
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Incubators | Percival Scientific, Inc. | I30BLLC8 I36VLC8 |
Any incubator capable of running programmed light/temperature schedules is appropriate. |
| Drosophila Activitiy Monitors | Trikinetics Inc., Waltham, MA | DAM2 | As described elsewhere6, this system requires a computer interface, software, and other accessories. |
| Pyrex Glass Tubes | Trikinetics Inc., Waltham, MA | PGT-5x65 | |
| Microplate scintillation and luminescence counter | Perkin Elmer | TopCount NXT 12 detector |
Any microplate reader capable of detecting luminescence can be used for this type of reporter assay. TopCount contains multiple detectors and an automated stacker; it is capable of being programmed to read continuously from multiple plates. |
| FluorChem 8900 | Alpha Innotech | Imaging of bacterial cultures is optional; any digital imaging system with visual light capability is sufficient. | |
| Micropipette Puller | Tritech Research, Inc. | Narishige PC-10 | |
| Supplies | |||
| Borosilicate Glass Capillaries | World Precision Instrument Inc. | 1B100F-4 | |
| 3 ml Syringe | Fisher Scientific | BD 305482 | |
| Syringe Needles | Fisher Scientific | BD 305196 | 18 G - cut off the tip of the needle to prevent damage to the tubing. |
| Silicone Tubing, i.d. (0.030") o.d. (0.065") Wall Thickness (0.018") | VWR | 60985-706 | Used for attaching glass capillary needles to a syringe |
| 3 Way Stopcock | American Pharmaseal Company | K75 | |
| Kontes Pellet Pestle Cordless Motor | Fisher Scientific | K749540-0000 | |
| Kontes Pellet Pestle | Fisher Scientific | K749521-1590 | |
| Glass balls 3mm | VWR | 26396-630 | |
| Microplate Microlite 1+ | Thermo Scientific | 7571 | Select 96-well plates that are appropriate for luminescence - they must be opaque. |
| TopSeal-A:96-well Microplates | PerkinElmer | 6005185 | Microplate Press-On Adhesive Sealing Film |
| D-Luciferin, Potassium Salt | Gold BioTechnology, Inc. | LUCNA | |
| Software | |||
| Insomniac2 | Available upon request to the authors | custom; written by Lesley Ashmore, Ph.D. (Westminster College) | Matlab based software that has been used routinely for analysis of sleep2,6,11 |
| Drosonex | Available upon request to the authors | custom; written by Thomas Coradetti (Sidewalk Software) | A PC MSVC6 program used for survival analysis from raw data files collected with the Trikinetics system |
| Photoshop CS3 | Adobe | Useful for obtaining numbers of cfu/plate from digital images (optional) | |
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