Summary
כדי להבין את קשר בין התגובה החיסונית ובהתנהגות, שאנו מתארים שיטה למדידת התנהגות רצוניים ב
Abstract
יחסי גומלין מורכבים בין התגובה החיסונית והתנהגות מארח כבר תאר במגוון רחב של מינים. עודף שינה, בפרט, ידועה להתרחש כתגובה לזיהום ביונקים 1 ויש גם לאחרונה תוארה בדרוזופילה melanogaster 2. הדעה מקובלת היא, שהשינה מועילה למארח במהלך זיהום ושזה חשוב לשמירה על מערכת חיסונית חזקה 3,4. עם זאת, ראיות ניסיוניות שתומכות בהשערה זו הן מוגבלת 4, ותפקיד השינה עודפת במהלך תגובה חיסונית עדיין לא ברור. יש לנו להשתמש בגישה רבה תחומית לטיפול בבעיה מורכבת זו, ובצעו מחקרים במערכת הפשוטה הגנטית המודל, פריזבוב דרוזופילה melanogaster. אנו משתמשים בבדיקה סטנדרטית למדידת התנהגות ושינה של תנועה בזבובים, ולהדגים כיצד בדיקה זו משמשת למדידת התנהגות בזבובים infecteד עם זן הפתוגני של חיידקים. בדיקה זו היא גם שימושית עבור ניטור משך ההישרדות בזבובים בודדים במהלך זיהום. צעדים נוספים של תפקוד מערכת חיסון כוללים את היכולת של זבובים כדי לנקות דלקת וההפעלה של NFκB, גורם שעתוק מפתח שהוא מרכזי בתגובה החיסונית המולדת בדרוזופילה. שניהם תוצאת הישרדות ופינוי במהלך זיהום חיידקים ביחד הם אינדיקטורים של התנגדות וסובלנות לזיהום. התנגדות מתייחסת ליכולת של זבובים כדי לנקות זיהום, תוך סובלנות מוגדרת כיכולתו של המארח כדי להגביל את הניזק מזיהום ובכך לשרוד למרות רמות גבוהות של הפתוגן בתוך המערכת 5. ניטור בזמן אמת של פעילות NFκB במהלך הזיהום מספק תובנה מנגנון מולקולרי של הישרדות במהלך זיהום. השימוש בדרוזופילה במבחנים הפשוטים הללו מאפשר הניתוח הגנטי ומולקולרי של שינהואת התגובה החיסונית ואיך שתי מערכות מורכבות אלה מושפעים הדדיים.
Protocol
פרוטוקול זה משתמש בשני מערכים (איור 1) לרכוש 4 קריאות שונות שנאספו מהזבובים החשופים לזיהום חיידקים. פלטים אלה כוללים 1) שינה / התנהגות בעקבות, 2) תוצאות הישרדות; 3) עומס חיידקים בזבוב; ו4) מדידה בזמן אמת של הפעילות העיתונאית NFκB in vivo. בשילוב עם כלים הגנטיים הזמינות בדרוזופילה, מדידות אלה מספקים תובנה מכניסטית לקישור המולקולרי בין תפקוד חיסוני והתנהגות.
1. פעילות מדידה של תנועה ושינה בזבובים
- ההתקנה משמשת למדידת פעילות של תנועה ולישון בזבובים, הכולל את מערכת תסיסנית פעילות הניטור (DAM2, Trikinetics), חממות, חדר חשוך, והכנה של חיות ניסוי וצינורות פעילות, שתוארה בעבר 6. אותה הגישה משמשת כאן, עם כמה שינויים קלים.
- צינורות פעילות מנוקים לשימוש מחדש על ידי הרתחה על פלטה חשמלית במים מיוננים. כמות קטנה של חומר הניקוי הוסיפה לרתיחה הראשונה, צינורות היטב שטפו והרתיחו עוד פעמים. אם חוט משמש לחבר את הצינור, צינורות ששמשו לפעילות (המכיל מזון, שעווה, זבוב וחוט) ניתן לנקות ללא הסרה מוקדמת של החוט.
- לפני שיתחילו בניסוי, המכילות תרבויות מקום מאוחר גלמי זבובים מבוימים בחממות לשלושה עד ארבעה ימים להסתגל לתאורה ניסיונית ותנאים סביבתיים אחרים. אור: תנאי חושך או קבוע היה בשימוש נפוץ למדידת התנהגות שינה. בדוגמה זו, זבובים התאקלמו לאור קבוע כדי למנוע ההשפעה של שעון היממה על התגובה וההתנהגות 2,7,8 החיסוניות. כפי שמתואר באיור 1 א ' 6, ושיא למינימום של שלושה ימים שקדמו לזיהום.
2. להדביק זבובים עם זנים פתוגניים של חיידקים
- הפרוטוקול המתואר כאן הוא ספציפי לס marcescens, שהם קלים לגידול ולהתמיד. פרוטוקולים לתנאי תרבות אחסון לטווח ארוך ולמיני חיידקים אחרים ישתנו. ס marcescens מאוחסנים בגליצרול 15-50% ב-80 ° C. כדי להתכונן לאחסון לטווח ארוך, לערבב 2 כרכים של תרבות חיידקי הלילה (OD 600 = 0.5-1.0) לנפח 1 של גליצרול 50% autoclaved ב1.5 צינורות microcentrifuge מ"ל. זה יגרום לריכוז גליצרול סופי של 17%. אחסנו בצינורות -80 ° C. כדי להתכונן לטווח קצר בשימוש מקור לחיידקים, לגרד את המנייה קפואה עם קצה פיפטה סטרילי 200 μl ולבצע רצף משולש בצלחת אגר LB. דגירת צלחת הלילה ב 37 & dלדוגמה: C כדי לקבל מושבות מבודדות. אחסן את הצלחת ב 4 ° C.
יום אחד לפני הזיהום שנקבע, לאסוף מושבה אחת מהצלחת אגרה LB עם טיפ סטרילי 200 μl פיפטה ולהטביע את הקצה לתוך צינור תרבות המכיל מדיום LB מ"ל 5. חיידקים לגדול בין הלילה, או עד 16 שעות בתוך אינקובטור שייקר על 37 מעלות צלזיוס ו 250 סל"ד עד שהוא מגיע שלב הצמיחה מעריכית. למדוד את הריכוז בספקטרופוטומטר בOD 600. הריכוז בשלב זה נע בין 0.5-1. אם הריכוז גבוה מדי, תת תרבות החיידקים ולגדול לכמה שעות נוספות כדי לקבל ריכוז אופטימלי. בצע את ההליך בקרבת מקור אש. חלק מזני חיידקים מהונדסים לעמידות לאנטיביוטיקה וגדלים ונבחרו לאנטיביוטיקה מתאימה הוסיף למדיום. ס marcescens (ATCC # 8100) אינו עמיד לאנטיביוטיקה ולכן גדל במדיום סטרילי ללא אנטיביוטיקה. כדי לוודא טכניקה סטרילית, לעשות cultu מדומהמחדש ללא חיידקים כשליטה.
הפתרון להדביק זבובים מכיל חיידקים (בדילול לOD 600 = 0.1) וצבעי מאכל% 1 (Brilliant Blue FCF) ב PBS. הכן את פתרון לבקרת הזרקה על ידי הוספת כמות שווה של מדיום LB בשימוש בפתרון דלקת וצבע מאכל כחול 1% בPBS. אחסן פתרונות על קרח. - הכן את מחטי זכוכית להזרקה את הזבובים. משוך זכוכית נימים (OD = 1 מ"מ, id = 0.58 מ"מ, WPI) לקצה עדין באמצעות micropipette חולץ (Narishige). תחת מיקרוסקופ לנתח, להשתמש במלקחיים עדינים לשבור את קצה המחט כך שהפתיחה היא גדולה מספיק כדי להתמלא בנוזל הזרקה באמצעות החלת שאיבה עם מזרק, אך קטנה מספיק כדי למזער את הניזק לזבוב במהלך תהליך ההזרקה. אחרי ששבר את הקצה, את גודל הטיפ צריך להיות בסביבות 40-50 מיקרומטר. מחט הזכוכית מחוברת למזרק פלסטיק 3 סמ"ק עם אורך של צינור. הזרימה בינונית הזרקה נשלטת באופן ידני תוך הפעלת לחץ חיובי או שלuction עם המזרק. למנוע זיהום צינור הגומי עם נוזל בהזרקה, כמנגנון המזרק משמש גם דלקת וזריקות בקרה.
- הרדם זבובים על ידי לשים אותם על משטח CO 2. CO 2 עובר דרך מכל אטום של מים כדי ללחלח את הפנקס וכדי להפחית חשמל סטטי, שיכול לסבך מניפולציה של זבובים על הכרית. הזרק זבובים על ידי החדרת מחט הזכוכית אל האזור מעל scutellum של בית החזה הגבה. פטירתו של מדיום הזרקה אל תוך החנות מאומתת על ידי צבע המאכל - זבובים הופכים כחולים כצבע המאכל מתפשט באמצעות המערכת. המינון של חיידקים שזבובים יקבלו ניתן לכמת כמתואר בסעיף 3 להלן. החלק מהעיצובים ניסיוניים כוללים קבוצת ביקורת שמקבלת פציעה האספטי ידי הזרקת זבובים עם צביעת PBS ומזון אך ללא חיידקים.
3. לקבוע את העומס בקטריאלי
גישה אחת לevaluatinגרם לתגובה החיסונית נגד זיהום חיידקים היא לקבוע את הזיהום שלאחר עומס החיידקים. ד melanogaster הוא מודל מצוין כדי לקבוע פרמטר זה, מאחר שניתן homogenized כל הזבוב להעריך את מספרי החיידקים כלל בתוך פרט. הרציונל מאחורי פרוטוקול זה הוא שכאשר גדל על מדיום מוצק כמו מרק וריא (LB) אגר בצלחת פטרי (צלחת LB), חיידק בודד יוצר מושבה להבחין גלויה. לכן, על ידי מאחד זבובים נגועים בנוזל LB, שהניב דילולים סידוריים של homogenate, ומתפשט homogenate המדולל על צלחות LB, מספר התאים חיידקיים מדביק זבוב ניתן לקבוע. קבוצת ביקורת של זבובים הוזרקו צביעת PBS ומזון אך ללא חיידקים יש להשתמש כדי לוודא שהזיהום לא היה מזוהם במיני חיידקים אחרים. לא אמור להיות מושבות על הצלחת אגרה LB במצב זה.
- כל חומרי חיטוי שישמשו לכךהליך לפני ביצוע צעד homogenization בפועל. זה כולל 200 טיפי פיפטה μl לגזור במספריים, מדיה LB, ועליים משמשים לתפעול. הכן את הצלחות על ידי שפיכה בינונית autoclaved LB / אגר ל10 סנטימטרי צלחות פטרי סטרילית לפחות היום 1 לפני מאחד זבובים.
- הרדם ולאסוף זבובים ב1.5 צינורות microcentrifuge מ"ל וצינורות חנות על קרח.
- לבצע הומוגניזציה ליד להבה על מנת למנוע זיהום. הומוגניזציה שליטה המכילה זבובים ללא זיהום מומלצת במיוחד בעת שימוש זן חיידקים כגון ס marcescens, שאינם עמידים לאנטיביוטיקה. הומוגני מינימום של 2 קבוצות של 10 זבובים בכל תנאי ניסוי לכל. מספר הזבובים המשמשים לhomogenate נקבע על ידי הנסיין. חלק מהקבוצות השתמשו בזבוב אחד לhomogenate, שהיא שימושית להערכת וריאציה בעומס חיידקים בין זבובים בודדים 8, בעוד שאחרים השתמשו 3-10 זבובים לhomogenateכדי להשוות בין הגנוטיפ או תנאי ניסוי 9-12.
- הוסף מדיום LB 400 μl לכל צינור המכיל microcentrifuge זבובים והומוגני באמצעות מנוע קטן ועלי (Kontes).
- באמצעות טיפי פיפטה לחתוך מעוקרים, סידורי לדלל 1:10 homogenate ידי הוספת LB / בינוני הומוגני μl 20 חיידקים לצינור microcentrifuge μl 1.5 המכיל מדיום LB 180 μl. חיתוך טיפי פיפטה מונע חסימה מפסולת זבוב ומבטיח כי נפח מתאים מועבר.
- גורם דילול נקבע באופן אמפירי ותלוי בגנוטיפ של הזבוב, זן החיידקים בשימוש, ותנאי ניסוי. לסוג פראי זבובים נגועים בס marcescens, השתמש דילולים של 1:10 2 או 3 01:10 לזבובי מעוורים מייד לאחר פגיעה, ודילולים של 1:10 4 או 5 01:10 לזבובים homogenized 24 שעות לאחר פגיעה.
- הוסף LB 100 μl / בינוני חיידקים מהמיקרופוןצינורות rocentrifuge המכילים דילול הסופי ולהפיץ את המדיום בצלחת LB באמצעות כדורי זכוכית (VWR) כדי להבטיח חלוקה שווה.
- השלך את כדורי הזכוכית לתוך 100% פתרון EtOH. מקם את צלחות LB ב37 מעלות צלזיוס חממה בן לילה.
- כצעד אופציונלי, השתמש במערכת הדמיה חזותי עם אור כדי להשיג תמונה של צלחות ליברות (FluorChem 8900; אלפא Innotech). לספור את המספרים של שני מושבות על הצלחת עצמו או מהתמונה של צלחת שימוש בכלי סומך על פוטושופ תוכנה (Adobe Photoshop CS3).
- לחשב את מספר המושבה להרכיב יחידות ללטוס באמצעות נוסחה: [n / (N * D * V)] * V; כאשר n = מספר מושבות גדלו על צלחת LB; N = מספר הזבובים נקווה ב1 צינור microcentrifuge: D = גורם דילול; וv = נפח של פתרון להתפשט על כל צלחת; V = נפח ראשוני של homogenate.
4. הערך שינה ומשך הישרדות לאחר זיהום
- עבורזבובים שלא נקטפו למדידת עומס חיידקים, להמשיך ולעקוב אחר התנהגות של 7-10 ימים נוספים. משך הישרדות מושפע גנוטיפ של תנאי הטיסה, הסביבתיים, ומיני חיידקים המשמשים לזיהום.
- לאחר ~ 10 ימים, לסיים את הניסוי, להוריד ולעבד את נתוני התנהגות כפי שתוארו בעבר 6. תוכנת Insomniac2 המותאמת אישית, המבוססת בMatlab, משמשת לניתוח פרמטרי שינה. זה חשוב כדי למנוע זבובים מתים מהניתוח התנהגותי. בדרך כלל, זה מגביל את הניתוח עד למרחק של היום הראשון לאחר הדבקה, תלוי בסוג של זיהום וגנוטיפ לטוס. המוות בassay מסומן על ידי הזמן כל סעיפי הפעילות שהגיעו לאפס. כדי להקל על ניתוח של הישרדות, Drosonex, תוכנה מותאמת אישית שנכתבה ב-Microsoft Visual C + + 6.0, משמש לעיבוד קבצי נתונים גולמיים ממערכת DAM Trikinetics. דיווחי התוכנה כקבצי Excel, משך הישרדותו של כל זבוב (בשעות), הידור הפעילות datמכל המסכים לגיליון אלקטרוני אחת, ומדווח על אחוזי הזבובים ששרדו לאורך הזמן כפי שנקבע על ידי המשתמש. את קבצי Excel נועדו להשתלב בחבילות תוכנה סטטיסטיות אחרות לניתוח נוסף.
5. מדידת פעילות NFκB במהלך זיהום השימוש Assay כתב לוציפראז
המהונדס κB לוק זבובים השתמש בassay זה נוצר בעבר כמתואר בקואו et al., 2010 2. בקצרה, כתב κB לוק מכיל 8 חזרות של רצף מחייב NFκB שהוכנסו לאמרגן במעלה זרם של מסגרת קריאה פתוחה לוציפראז.
- התאם זבובים לתנאי תאורה ניסיוניים כמפורטים בסעיף 1.2. בדוגמה זו, 1-4 זבובים ישנים היום κB לוק הם שוכנו בבקבוקונים המכילים סוכרוז 5%, 2% מצע אגר מזון והניח באור קבוע (LL) עבור 2 ימים כדי להגיע לאותו גיל כמו זבובים אחרים במהלך זיהום.
- הכן microplate 96 היטב לזבובים. כל באר מכיל 2 שכבות של מזון בינוני (איור 2); השכבה העליונה מכילה luciferin, המצע של לוציפראז. הוסף 300 μl של סוכרוז 5%, 2% לכל פתרון אגר היטב ולאפשר לביסוס. לאחר מכן, להוסיף שכבה עליונה 50 μl לכל סוכרוז גם מכיל 5%, 1% אגר, והמ"מ luciferin 2 (הזהב ביוטכנולוגיה, Inc). ריכוזי luciferin משמשים לפעילות כתב מדידה בדרוזופילה ומגוונים בספרות, ולא היו נמוך כמו 100 מיקרומטר 13. הריכוז הנדרשים ניתן לקבוע באופן אמפירי. בין מהחלק את שכבות מזון, לכסות את הצלחת עם בד רשת דקה כדי להקל על הייבוש, תוך שמירה על סטריליות. הצלחת צריכה להיות מותרת להתייבש היטב, עד לשעה אחת, כדי למנוע מזבובים להיתקע בטיפי עיבוי. בגלל luciferin הוא רגיש לאור, להימנע מלחשוף את הצלחות להדליק יותר מנחוץ.
- החל סרט דבק שקוף (למעלהחותם-; פרקין אלמר) לצלחת 96-microwell היטב ולנקב באמצעות מחט עדינה בכמות של 2 חורים לטובים. חורים אלה לא רק לאפשר חילופי אוויר לכל אחד, אבל גם יספקו את הדרך להרדים זבובים על בסיס פרטני. באמצעות סכין חד וקצה ישר, להציג חתך בין כל עמודה. זה יספק דרך קלה לטעון / לפרוק זבובים בקבוצות של 8 בכל פעם.
כדי לטעון זבובים לתוך צלחת microwell, הסר את הצלוחיות מזבובים להרדים חממה ועל משטח CO 2. עומס זבובים אחד על אחד לכל עמודה אחר עמודה היטב. צריך לטוס בטעות נתקע לחותם הדבק, השאר את הזבוב לבד כפי שהם לעתים קרובות מסוגלים לשחרר את עצמם ללא התערבות. להחזיר את צלחת microwell לחממה בLL עבור 8-24 שעות כדי להסתגל לסביבה החדשה ולצרוך את מצע luciferin. - חיידקי תרבות, S. marcescens, ולהכין פתרון לזיהום כפי שתואר לעיל.
- לא לטשטשהוא טס באמצעות טיפ micropipette המצורף לקו 2 CO בלחץ נמוך. הנח את קצה micropipette ישירות מעל פתחי האוורור שנעשו לכל באר. קח זהירות כדי להבטיח שלחץ CO 2 הוא גבוה מספיק כדי לטשטש את הזבוב, אך נמוך מספיק כדי למנוע פגיעה בזבוב. בקבוצה של שמונה, באופן אישי להעביר כל זבוב ל2 משטח CO, ולהדביק כמתואר לעיל. לאחר הדבקה, תחזור בכל הזבוב למקורי וגם reseal microplate.
- הארת מידה (הארת TopCount-NXT ומונה נצנץ; פרקין אלמר-). דלפק ההארה TopCount מכיל קלטת לערום לצלחות, מה שמאפשר לקריאה מתוכנתת ואוטומטית רציפים במרווחים רצויים לכל אורך הזמן (בדרך כלל עד חמישה ימים). תכונה זו אינה זמינה בכל המכשירים, ואיסוף נתונים לניסויים שבוצעו עם מכשירים אחרים ולכן עשוי להיות פחות תכוף. דלפק ההארה שוכן בroאום עם טמפרטורה מבוקרת ולוח זמנים של תאורה. בעת טעינת צלחות לקלטת לערום, לערום את הצלחות המכילות את הזבובים בין צלחות ריקות ברורות כדי להבטיח שזבובים יקבלו אור. תכנית luminometer לפי מפרט היצרן לאסוף קריאה בכל שעה למינימום של 24 שעות. בדוגמה זו, הגלאים מתוכנתים לקרוא כל טוב עבור 10 שניות ולבטא את התוצאה כספירות (יחידות שרירותיות) לשנייה. ערך זה בממוצע על פני 3 קריאות לטובות. לייצא את קבצי נתונים לגיליון אלקטרוני ולבצע ניתוח סטנדרטי, גרפים את התוצאות של הארה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
- זיהום מקדם שינה. בדוגמה זו, קנטון-S (CS) זבובי בר וזבובי סוג מוטציה חסרת גן NFκB, ממרח (REL E20) 14, הוטענו לשני צגי DAM2 פעילות (n = 32 לכל גנוטיפ) ונדבק כמתוארים לעיל. זבובים הוחזקו באור קבוע כדי למנוע ההשפעה של השעון הביולוגי על התנהגות וזיהום 2,7,8. מוטציות E20 REL היו isogenized לCS כפי שתוארו לעיל 11. שתי הקבוצות של זבובים היו נגועות בס marcescens ותוצאותיו מתוארים באיור 3. במקרים מסוימים, קבוצת ביקורת טופלה שימושית נוספת להפרדת השפעות של טיפול מהשפעות של זיהום 2. קבוצות ביקורת שטופלו נחשפות לאותם שינויים סביבתיים כקבוצות הנגועות, הכולל הסרה מחממות והרדמה לאותו משך הזמן אבל הם לא יקבלו זריקה. עם זאת, בדוגמה זו, ברור שREL E20 מוטנטים חווים פחות שינה מאשר CS השליטה עפה לאחר הדבקה (איור 3 א). כפי שתואר לעיל 6, יש פרמטרי התנהגות אחרים שניתן למדוד מassay הסכרים. אלה עשויים לכלול סעיפי פעילות הכוללים לכל יחידה זמן (איור 3 ב '). בדוגמה זו, השינוי בפעילות, לאחר מראות זיהום ששינה. כמו כן, אנו מדווחים על קצב פעילות, או פעילות ספירות לדקת עירות (האיור 3C). פרמטר זה הוא אינדיקטור אחד מהיכולת של תנועה בזבובים. במקרה זה, שיעורי פעילות מתעוררים לא משתנים באחת גנוטיפ במהלך זיהום, אשר טוען כי הירידה בפעילות או עלייה בשינה היא לא תוצאה של היכולת של תנועה מופחתת.
- האיור 4 א מתאר את שיעור ההישרדות לאחר הדבקה. עולה בקנה אחד עם ממצאים קודמים 14,15, Rel E20 מוטציות במהירות נכנע לfection בהשוואה לזבובים מסוג ברים. רוב הזבובים שרד הזרקת שליטת aseptic (איור 4 ב), המציין כי זבובים נכנע לזיהום ולא לפגיעה בגוף עקב ההזרקה. בגלל המוטציות להתענג מתו כל כך מהר, רק זבובי CS שמשו להפגין עומס חיידקים לאחר הדבקה (איור 5). איור 5 מראה שS. marcescens ממשיך להתרבות ב24 שעות לטוס לאחר הדבקה.
- פעילות הכתב לוציפראז מתוארת לאורך הזמן בבדיקה בארבעה זבובים בודדים (איור 6). וריאציה גדולה בין נקודתי נתונים וזבובים בודדים ניתן לייחס את הזבובים מסתובבים בפנים הבארות. למרות האות נגזרת מכל הרקמות בתוך הזבוב, הוא לא ציפה שכל רקמה הייתה פולטת אותה הכמות של אות, ואת הנראות של הרקמות לגלאי תשתנינה כמהלכי הזבוב. בדוגמה זו, זבובים נדבקו והשוואה עם קבוצת ביקורת טופלה. זבובים שמתו הוצאו מניתוח על פני קבוצה של זבובים המוצגים באיור 7 א. זבובים מתים נקבעים על ידי בדיקה חזותית. בזבובים אלה, יש ירידה חדה באות לוציפראז, כמו גם ירידה בוריאצית אות, המציין כי הזבוב לא זז. פעילות כתב κB לוק בהתמדה עולה לאחר הדבקה (איור 7 א) ופציעת aseptic (איור 7 ב ). פסגות פעילות הכתב סביב 12 לאחר פציעה ושעות לאחר פגיעה. מניפולציות גנטיות והן / או בהתנהגות של זבובים צפויים לשנות פעילות כתב κB לוק במהלך זיהום. לדוגמה, תארנו בעבר 2 כי האינדוקציה של פעילות העיתונאית κB לוק הייתה בעיקר נחלשה במהלך הזיהום בREL E20 מוטנטים, המציין הכתב הזה κB לוק הוא ספציפי לNFκB.
gether.within עמודים = "תמיד"> 
איור 1. תרשים זרימה המתאר את השלבים העיקריים של מדידת התגובות החיסוניות בדרוזופילה () הרצף של צעדים מתוארים לשנת מדידה, להישרדות, ולעומס חיידקים בזיהום;. (ב) הרצף של צעדים מתואר למדידת NFκB תלוי פעילות הכתב לוציפראז במהלך זיהום. ניסויים יכולים להמשיך בכל מקום בין 1-5 ימים, תלויים בקטלניות ממיני חיידקים בשימוש.
איור 2. סכמטי של microplate פרט היטב. זבובים ממוקמים באטום, 96 גם צלחות המכילות בינוני וכיסה כפי שמוצג. בגלל יטופלו בנפרד זבובים שיהיו נגועים, זה לא חשובo להגביל את מספר הזבובים לצלחת לסכום שניתן לניהול סביר בתוך פרק זמן נתון, בהתאם לנסיבות הניסיוניות.
איור 3. תגובת התנהגות של זבובים נגועות בס marcescens. () ממוצע ± SEM אחוזי זמן שטס שינה בילתה ו( B) Mean ± SEM ספירות פעילות כלל הם זממו במרווחים של 4 hr ליום 1 לפני ולאחר ההדבקה עם ס marcescens. (ג) Mean ± SEM ספירות פעילות לדקת עירות לפני (BL = בסיסי) ולאחר ההדבקה עם ס marcescens זמם במרווחים של 8 שעות. התנהגות היא דיווח לזבובי CS פראי מסוג ששרדו לזיהום של לפחות 24 שעתי הודעה, ועבור Rel E20 החיסוני לקוי זבובי thaלא שרד לזיהום שלאחר שעות לפחות 8. n = 13 עבור CS ועבור Rel E20. ** = P <0.01 ו* = p <0.05, t של הסטודנט - מבחן.
איור 4. תוצאות הישרדות של זבובים נגועים ולא נדבקו. () עקומות מייצגות קפלן, מאייר הישרדות הם זממו לשניהם CS פראי מהסוג E20 וזבובי REL חיסון לקויים שהיו נגועים בס marcescens. p = 8.13x 10 -13, היכנס מבחן דרגה. n = 31 עבור CS וn = 32 לזבובי E20 rel. (ב) עקומות מייצגות קפלן, מאייר הישרדות מדווחות כב(), למעט זבובים קבלו פציעה האספטי באמצעות הזרקת תקשורת הנוזלית ללא חיידקים. כמעט כל הזבובים שרדו פציעה האספטי עד תום הניסויים (60 שעות לאחר פציעה). p> 0.97, היומן rank מבחן, n = 32 עבור CS וREL E20 זבובים.
איור 5. כימות של עומס חיידקים בזבובים שנדבקו בס marcescens. () תרבות חיידקי נציגה CS זבובים נגועים בס marcescens שנקטפו מייד לאחר הדבקה (פנל שמאלי), או 24 שעות לאחר הדבקה (פנל מימין). גורמי דילול מצוינים מתחת לכל דמות. בדוגמה זו, 10 זבובים homogenized בפתרון μl 400 עבור כל קבוצה. 100 μl של הדילול הסופי להתפשט על כל צלחת. הצלחת השמאלית מכילה 29 יחידות להרכיב מושבה (CFU). כדי לחשב CFU / לעוף, תחלק 29 CFU ידי זבובים [10 * 0.001 (גורם דילול) * 100 μl (התפשטות נפח לצלחת)], אשר שווה 29, ותכפיל את הנפח הראשוני של 400 μl = 11600. לצלחת המסוימת הזה, יש לנו ממוצע של 1.16 x 10 4CFU / זבוב. הצלחת הימנית מכילה 257 מושבות. שימוש באותה הנוסחא, אנו מוצאים ממוצעים של 1.03 x 10 6 CFU / זבוב. (ב) לאחר חישוב CFU / לטוס מכל צלחת בכל תנאי ניסוי, ליצור חלקות וקופסות שפם כפי שמוצג. בדוגמה זו, אחוזון 25, 50 (חציון) ו75 מוצגים כתחתון, האמצעי והעליון של התיבה. ברי שגיאה מייצגים סטיית התקן על פני שלושה ניסויים עצמאיים. ** P <0.01 תלמיד מבחן t של.
איור 6. פעילות NFκB תלויה לוציפראז כתב בזבובים בודדים שנדבקו בס Marcescens. דוגמאות מייצגות של נתונים גולמיים מוצגות לזבובים בודדים נגועים (שליטת מטופלות; לוחות שמאל) וזבובים נגועים (פנלים נכונים). קריאה בסיסית (זמן '0 ') נאספה מייד לפני זיהום או טיפול; כל שארנקודתי זמן נאספו לאחר זבובים טופלו. שים לב להבדלים בהיקף בצירי y בין זבובים בתנאי הביקורת הנגועה וטפלו. וריאציה גדולה של האות בתוך כל זבוב ניתן לייחס לתנועה של הזבוב בתוך microwell.
איור 7. זיהום בס marcescens או פגיעה עם הזרקה האספטי מגביר את הפעילות עיתונאית κB לוק בחי זבובים. Mean ± פעילות לוציפראז SEM (יחידות שרירותיות) זממה כל 4 שעות בכל הזבובים שנדבקו () או נפגעה על ידי הזרקת חומרים אספטיים (ב ') ושרדה עד עד 24 בבדיקה. ANOVA חד כיווני עם צעדים חוזרים ונשנים מצביע על כך שהפעילות גדלה באופן משמעותי בכתב נגוע (p <0.05), נפגעה (inj, p <0.01), ונגדם טפלוטרולופ (HC; p <0.01) בהשוואה לקבוצות הבסיסיות שלהם (זמן '0 '; Tukey של הפוסט הוק). (הוספה, פנל): נתונים מקבוצת HC משורטטים בקנה מידה שונה. העלייה הקטנה אך משמעותית בפעילות עיתונאית בג"ץ הקבוצה עולה כי זבובים אולי חוו לחץ קל או גדלו ערות מהטיפול (העברה מצלחת microwell ושווה הערך להרדמת זבובים נגועים). שתי הקבוצות נגועות ופצועות הראו זירוזים חזקים של פעילות העיתונאית κB לוק שהיו גבוהים באופן משמעותי מזה בקבוצת הבג"צ בנקודתי זמן מצוין * = p <0 0.05; ** = p <0 0.01;. לא של התלמיד - בדיקה; ל() n = 20 HC ו n = 13 זיהום; ל( B) n = 15 HC ו n = 14 פציעה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
פרוטוקול זה מתאר את גישתו לחקור כיצד התנהגות, במיוחד לישון, קשורה לפרמטרי תגובה חיסוניות. פרמטרים אלה כוללים עומס חיידקים, תוצאות הישרדות, ופעילות NFκB כפי שנמדד על ידי עיתונאי לוציפראז in vivo. יחד פרמטרים אלה מספקים מידע על אופן שגם זבוב יכול להילחם בזיהום. עומס חיידקים ותוצאה הם הישרדות פרמטרי תגובה חיסוניים הכרוכים במדידה פשוטה בדרוזופילה. REL E20 מוטציות, אשר חסרה פקטור NFκB שעתוק שהוא מרכזי בתגובה החיסונית, נכנע במהירות לזיהום חיידקים. מניפולציות גנטיות או אחרות של התנהגות יכולות להשפיע גם על פרמטרי תגובה חיסוניים אלה, ככל הנראה על ידי המשפיע על פעילות NFκB עצמו. לדוגמה, מניעת שינה לפני עליית זיהום הביטוי של mRNA ממרח, ומפחית CFU / לטוס ביחס לבקרות שאינן מקופחות-11. MutanTS של הגנים של השעון, תקופת 7 ונצחי 8, דווח גם כדי להפחית הישרדות במהלך זיהום כמו גם פינוי חיידקים 8. מחקרים נוספים המשתמשים בגישה זו צפויים לספק תובנה מכניסטית לתוך כיצד התנהגות יכולה להשפיע על תפקוד מערכת חיסוני.
הליך ההזרקה / זיהום שאנו מתארים כאן הוא שונים משיטה שתוארה בעבר על ידי הוו ואח' 16. הליך זה הוא פשוט וזול. עם זאת, חסרון הוא שהשליטה הידנית של נפח הזרקה עם השימוש בצבע כמדד גס ויכול לתרום לשונות. קבוצות אחרות לא השתמשו microinjector לאפשר נפח הזרקה מתמדת 17, או שדקרו זבובים עם מחט טבולה בתרבות חיידקים 18. עם זאת, השיטה שהוצגה כאן הייתה מוצלחת באיתור שינויים בסילוק חיידקים על פני תנאי ניסוי 11,19 </ Sup>.
הישרדות של זבובים במהלך ההדבקה היא לכמת בדרך כלל על ידי לספור את הזבובים שנותרו במרווחי זמן קבוע. כאן אנו משתמשים במערכת DAM Trikinetics לפקח על זמן המוות בזבובים בודדים, אשר צוינו על ידי הפסקת הפעילות. אנחנו וידאנו שתוצאת ההישרדות כפי שנקבע ע"י פעילות של תנועה היא זהה לזה שנקבע על ידי בדיקה ויזואלית של זבובים בצינורות הפעילות במהלך הדבקה (לא פורסם). שיטה זו שמשה גם בעבר למדידה אורך חיים 20,21. עם זאת, חשוב לציין כי ההערכה של הישרדות במערכת DAM מוגבל לזה בזבובים מבודדים, ושתוצאות הנגזרות ממצב זה צפויים להיות שונה מאלה בתנאים מקובצים. מחקרים מוקדמים הראו הבדלים בהישרדות, כאשר המארח הוא להציב בקבוצות לעומת תנאים מבודדים 22. העבודה האחרונה גם אשרה כי תוחלת חיים בקבוצות של זבובים ארוכהמזה שבזבובים בודדים 20.
פעילות הכתב לוציפראז כבר שמש בעבר לניתוח של ביטוי גני שעון בחי זבובים (לדוגמה, 23 ref). במקרים אלה, שיקולים טכניים אחרים הם הכרחיים, במיוחד הדלדול של מצע luciferin אשר מתרחש על פני כמה ימים של ריצת assay. לעומת זאת, הבדיקה שתוארה כאן מוגבלת להישרדות של זבובים נגועים ומעורבת מדידה פשוטה מעל 24 שעות לאחר הדבקה. ANOVA צעדים חזר היה מספיק כדי להעריך את שינויים מנקודת ההתחלה בתוך כל קבוצה. גישות סטטיסטיות לניתוח תנודת יממה של כתבי וציפראז, יחד עם צעדי נורמליזציה לתקן לדלדול מצע הם דנו באופן מלא במקום אחר 24. בכל מקרה, מדידת פעילות עיתונאית בזמן אמת בזבובים בודדים היא שיטה יעילה יותר לחילוץ מידע על הדינמיקה הזמנית מאשר staמבחנים ביוכימיים וimmunohistochemical ndard.
עם זאת, חסרון פוטנציאלי לניטור פעילות כתב לוציפראז in vivo הוא שזה תלוי באכילת זבובי מצע luciferin. אנורקסיה כבר קשורה לזיהום בזבובים, והאכלה עשויה גם להשתנות עם הסוג של זיהום או בין גנוטיפים 25. כדי לעקוף את החשש מפני בליעה של המצע, זבובים יכולים להיות גזורים לחלקי גוף שונים או ברקמות בעקבות זיהום, ופעילות כתבת ניתן למדוד בתרבות כפי שתואר לעיל 26. לחלופין, תוצאות מבדיקת לוציפראז ניתן גם אומתה באמצעות בדיקה סטנדרטית שאינו מסתמך על האכלה. לדוגמה, כמותית PCR כבר גישה נפוצה למדידת רמות ביטוי של mRNA מיקרוביאלית פפטיד (AMP). מגברים הם מטרות ידועות של NFκB, ולכן מצביעים על רמת פעילות שלה.
הנציג datמתואר כאן לסכם עבודה קודמת שהראתה כי NFκB עולה עם אתגר חיסוני ועלייה שלאחר מכן בשינה 2. עם זאת, קוראים מוזהרים שהשינה במערכת DAM Trikinetics מסומנת על ידי חוסר פעילות למשך התקופה מינימאלית של חמש דקות רצופות 27. מדידה של שינה באוויר על ידי צילום וידאו גם מסתמכת על חוסר פעילות 28. הגדרת השינה בזבובים פוטנציאלי עלולה להיות בעייתית בזיהום, כי הוא ידוע גם שבעלי החיים אתגרו חיסוניים יהיו פעילים במשך תקופות ארוכות ללא שינה 29. כדי להתגבר על בעיה זו, מבחנים שההיענות חושית מידה דרושה כדי לוודא שזבובים הם אכן ישן. חוקרים קבעו את ההיענות של זבובים לגירויים חושיים, כמו עיפרון רז 30, שמברישים את צינורות פעילות עם מקל עץ 31, או חימום קצה אחד של צינור 27. בכל המקרים, זבובי שינה מגיבים פחות (נמדדאו על ידי או על ידי השהית תגובת אחוזי זבובים מגיבים כקבוצה) מזבובים ערים. אנחנו גילינו שזבובים נגועים ששינה הם אכן מגיבים פחות לגירויים חושיים עד 6-8 שעות לאחר פגיעה (TH. קואו וJA וויליאמס, תצפית לא פורסם). למרות המגבלות הטכניות, מערכת DAM Trikinetics מספקת יתרון תפוקה גבוהה שיהיה שימושי למחקרים עתידיים בזבובים הבוחנים קשר גנטי ומולקולרי בין שינה לתפקוד מערכת חיסון.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
אין ניגודי האינטרסים הכריזו.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי הקרן הלאומי למדע במסגרת מענק # IOS-1025627 ועל ידי המכון הלאומי לבריאות במסגרת המענק # 1R21NS078582-01 ללסת
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Incubators | Percival Scientific, Inc. | I30BLLC8 I36VLC8 |
Any incubator capable of running programmed light/temperature schedules is appropriate. |
| Drosophila Activitiy Monitors | Trikinetics Inc., Waltham, MA | DAM2 | As described elsewhere6, this system requires a computer interface, software, and other accessories. |
| Pyrex Glass Tubes | Trikinetics Inc., Waltham, MA | PGT-5x65 | |
| Microplate scintillation and luminescence counter | Perkin Elmer | TopCount NXT 12 detector |
Any microplate reader capable of detecting luminescence can be used for this type of reporter assay. TopCount contains multiple detectors and an automated stacker; it is capable of being programmed to read continuously from multiple plates. |
| FluorChem 8900 | Alpha Innotech | Imaging of bacterial cultures is optional; any digital imaging system with visual light capability is sufficient. | |
| Micropipette Puller | Tritech Research, Inc. | Narishige PC-10 | |
| Supplies | |||
| Borosilicate Glass Capillaries | World Precision Instrument Inc. | 1B100F-4 | |
| 3 ml Syringe | Fisher Scientific | BD 305482 | |
| Syringe Needles | Fisher Scientific | BD 305196 | 18 G - cut off the tip of the needle to prevent damage to the tubing. |
| Silicone Tubing, i.d. (0.030") o.d. (0.065") Wall Thickness (0.018") | VWR | 60985-706 | Used for attaching glass capillary needles to a syringe |
| 3 Way Stopcock | American Pharmaseal Company | K75 | |
| Kontes Pellet Pestle Cordless Motor | Fisher Scientific | K749540-0000 | |
| Kontes Pellet Pestle | Fisher Scientific | K749521-1590 | |
| Glass balls 3mm | VWR | 26396-630 | |
| Microplate Microlite 1+ | Thermo Scientific | 7571 | Select 96-well plates that are appropriate for luminescence - they must be opaque. |
| TopSeal-A:96-well Microplates | PerkinElmer | 6005185 | Microplate Press-On Adhesive Sealing Film |
| D-Luciferin, Potassium Salt | Gold BioTechnology, Inc. | LUCNA | |
| Software | |||
| Insomniac2 | Available upon request to the authors | custom; written by Lesley Ashmore, Ph.D. (Westminster College) | Matlab based software that has been used routinely for analysis of sleep2,6,11 |
| Drosonex | Available upon request to the authors | custom; written by Thomas Coradetti (Sidewalk Software) | A PC MSVC6 program used for survival analysis from raw data files collected with the Trikinetics system |
| Photoshop CS3 | Adobe | Useful for obtaining numbers of cfu/plate from digital images (optional) | |
References
- Majde, J. A., Krueger, J. M. Links between the innate immune system and sleep. J. Allergy Clin. Immunol. 116, 1188-1198 (2005).
- Kuo, T. H., Pike, D. H., Beizaeipour, Z., Williams, J. A. Sleep triggered by an immune response in Drosophila is regulated by the circadian clock and requires the NFkappaB Relish. BMC Neurosci. 11, 1471-2202 (2010).
- Preston, B. T., Capellini, I., McNamara, P., Barton, R. A., Nunn, C. L. Parasite resistance and the adaptive significance of sleep. BMC Evol Biol. 9, 7 (2009).
- Imeri, L., Opp, M. R. How (and why) the immune system makes us sleep. Nat. Rev. Neurosci. 10, 199-210 (2009).
- Ayres, J. S., Schneider, D. S. A Signaling Protease Required for Melanization in Drosophila Affects Resistance and Tolerance of Infections. PLoS Biol. 6, e305 (2008).
- Chiu, J. C., Low, K. H., Pike, D. H., Yildirim, E., Edery, I. Assaying Locomotor Activity to Study Circadian Rhythms and Sleep Parameters in Drosophila. J. Vis. Exp. (43), e2157 (2010).
- Lee, J. E., Edery, I. Circadian Regulation in the Ability of Drosophila to Combat Pathogenic Infections. Curr. Biol. 18, 195-199 (2008).
- Stone, E. F., et al. The circadian clock protein timeless regulates phagocytosis of bacteria in Drosophila. PLoS Pathog. 8, e1002445 (2012).
- Hill-Burns, E. M., Clark, A. G. X-linked variation in immune response in Drosophila melanogaster. Genetics. 183, 1477-1491 (2009).
- Short, S. M., Lazzaro, B. P. Female and male genetic contributions to post-mating immune defence in female Drosophila melanogaster. Proc. Biol. Sci. 277, 3649-3657 (2010).
- Williams, J. A., Sathyanarayanan, S., Hendricks, J. C., Sehgal, A. Interaction between sleep and the immune response in Drosophila: a role for the NFkappaB relish. Sleep. 30, 389-400 (2007).
- Ramsden, S., Cheung, Y. Y., Seroude, L. Functional analysis of the Drosophila immune response during aging. Aging Cell. 7, 225-236 (2008).
- Williams, J. A., Su, H. S., Bernards, A., Field, J., Sehgal, A. A circadian output in Drosophila mediated by neurofibromatosis-1 and Ras/MAPK. Science. 293, 2251-2256 (2001).
- Hedengren, M., et al. Relish, a central factor in the control of humoral but not cellular immunity in Drosophila. Mol. Cell. 4, 827-837 (1999).
- Leulier, F., Rodriguez, A., Khush, R. S., Abrams, J. M., Lemaitre, B. The Drosophila caspase Dredd is required to resist gram-negative bacterial infection. EMBO Rep. 1, 353-358 (2000).
- Wu, L. P., Choe, K. -M., Lu, Y., Anderson, K. V. Drosophila Immunity: Genes on the Third Chromosome Required for the Response to Bacterial Infection. Genetics. 159, 189-199 (2001).
- Dionne, M. S., Ghori, N., Schneider, D. S. Drosophila melanogaster is a genetically tractable model host for Mycobacterium marinum. Infect. Immun. 71, 3540-3550 (2003).
- Romeo, Y., Lemaitre, B. Drosophila immunity: methods for monitoring the activity of Toll and Imd signaling pathways. Methods Mol. Biol. 415, 379-394 (2008).
- Lu, Y., Wu, L. P., Anderson, K. V. The antibacterial arm of the Drosophila innate immune response requires an I{kappa}B kinase. Genes Dev. 15, 104-110 (2001).
- Koh, K., Evans, J. M., Hendricks, J. C., Sehgal, A. A Drosophila model for age-associated changes in sleep:wake cycles. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 103, 13843-13847 (2006).
- Bushey, D., Hughes, K. A., Tononi, G., Cirelli, C. Sleep, aging, and lifespan in Drosophila. BMC Neurosci. 11, 1471-2202 (2010).
- Allee, W. C. The social life of animals. , W.W. Norton & Company, Inc. (1938).
- Stanewsky, R., Jamison, C. F., Plautz, J. D., Kay, S. A., Hall, J. C. Multiple circadian-regulated elements contribute to cycling period gene expression in Drosophila. Embo. J. 16, 5006-5018 (1997).
- Levine, J. D., Funes, P., Dowse, H. B., Hall, J. C. Signal analysis of behavioral and molecular cycles. BMC Neurosci. 3, 1 (2002).
- Ayres, J. S., Schneider, D. S. The role of anorexia in resistance and tolerance to infections in Drosophila. PLoS Biol. 7, e1000150 (2009).
- Plautz, J. D., Kaneko, M., Hall, J. C., Kay, S. A. Independent photoreceptive circadian clocks throughout Drosophila. Science. 278, 1632-1635 (1997).
- Huber, R., et al. Sleep homeostasis in Drosophila melanogaster. Sleep. 27, 628-639 (2004).
- Zimmerman, J. E., Raizen, D. M., Maycock, M. H., Maislin, G., Pack, A. I. A video method to study Drosophila sleep. Sleep. 31, 1587-1598 (2008).
- Toth, L. A., Rehg, J. E., Webster, R. G. Strain differences in sleep and other pathophysiological sequelae of influenza virus infection in naive and immunized mice. J. Neuroimmunol. 58, 89-99 (1995).
- Hendricks, J. C., et al. Rest in Drosophila is a sleep-like state. Neuron. 25, 129-138 (2000).
- Wu, M. N., Koh, K., Yue, Z., Joiner, W. J., Sehgal, A. A genetic screen for sleep and circadian mutants reveals mechanisms underlying regulation of sleep in Drosophila. Sleep. 31, 465-472 (2008).
