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Immunology and Infection

प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया और नींद में मात्रात्मक मापन Published: December 4, 2012 doi: 10.3791/4355

Summary

प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया और व्यवहार के बीच की कड़ी को समझने के लिए, हम में हरकत व्यवहार को मापने के लिए एक विधि का वर्णन

Protocol

इस प्रोटोकॉल दो setups का उपयोग करता है (1 चित्रा) के लिए चार अलग अलग एक जीवाणु संक्रमण के अधीन मक्खियों से एकत्र readouts हासिल कर सकते हैं. इन outputs शामिल हैं 1) नींद / जगा व्यवहार, 2) अस्तित्व परिणाम, 3) मक्खी में जीवाणु लोड, और 4) vivo में NFκB संवाददाता गतिविधि की वास्तविक समय माप. आनुवंशिक उपकरण है कि ड्रोसोफिला में उपलब्ध हैं के साथ संयोजन में, इन मापों प्रतिरक्षा समारोह और व्यवहार के बीच आणविक लिंक में यंत्रवत अंतर्दृष्टि प्रदान करते हैं.

1. उपाय लोकोमोटर और मक्खियों में गतिविधि नींद

  1. सेटअप हरकत गतिविधि को मापने के लिए और मक्खियों में सो, जो ड्रोसोफिला गतिविधि की निगरानी प्रणाली (DAM2, Trikinetics), इन्क्यूबेटरों, अंधेरे कमरे, और जानवरों और प्रयोगात्मक गतिविधि ट्यूब की तैयारी भी शामिल है के लिए इस्तेमाल किया, 6 पहले वर्णित किया गया है. एक ही दृष्टिकोण का यहां इस्तेमाल किया है, कुछ मामूली संशोधनों के साथ.
    1. गतिविधि ट्यूबों फिर से उपयोग के लिए de-ionized पानी में एक गर्म थाली पर उबलते द्वारा साफ कर रहे हैं. द्रव्य की एक छोटी राशि पहले उबाल के लिए जोड़ा जाता है, ट्यूब अच्छी तरह से rinsed कर रहे हैं और दो बार से अधिक उबला हुआ. यदि धागे को ट्यूब प्लग करने के लिए प्रयोग किया जाता है, गतिविधि ट्यूबों (भोजन, मोम, मक्खी, और यार्न युक्त) यार्न की पूर्व हटाने के बिना साफ किया जा सकता है.
  2. एक प्रयोग शुरू करने से पहले, जगह देर से पोटा संबंधी युक्त संस्कृतियों तीन से चार दिन के लिए इन्क्यूबेटरों में मक्खियों मंचन प्रयोगात्मक प्रकाश और अन्य पर्यावरणीय स्थितियों के लिए अनुकूल है. लाइट: काले या लगातार शर्तों आमतौर पर किया गया है सो व्यवहार को मापने के लिए इस्तेमाल किया. इस उदाहरण में, मक्खियों लगातार प्रकाश के लिए प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया और 2,7,8 व्यवहार पर circadian घड़ी के प्रभाव को खत्म करने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं. जैसा कि चित्र 1 ए में वर्णित 6 पर नज़र रखता है, और रिकॉर्ड पहले वर्णित संक्रमण के लिए.

2. जीवाणुओं की एक रोगजनक तनाव के साथ मक्खियों संक्रमित

  1. यहाँ वर्णित प्रोटोकॉल एस के लिए विशिष्ट है marcescens, जो विकसित करने के लिए और बनाए रखने के लिए आसान कर रहे हैं. अन्य बैक्टीरियल प्रजातियों के लिए लंबी अवधि के भंडारण और संस्कृति की स्थिति के लिए प्रोटोकॉल एस अलग अलग होंगे. marcescens 15-50% ग्लिसरॉल में -80 डिग्री सेल्सियस पर जमा हो जाती है 1.5 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूबों में autoclaved 50% ग्लिसरॉल की मात्रा 1 - लंबी अवधि के भंडारण के लिए तैयार करने के लिए रातोंरात जीवाणु संस्कृति के 2 संस्करणों (1.0 आयुध डिपो 600 = 0.5) का मिश्रण. यह 17% की एक अंतिम ग्लिसरॉल एकाग्रता में परिणाम देगा. -80 में ट्यूबों स्टोर डिग्री सेल्सियस बैक्टीरिया के स्रोत के उपयोग में एक अल्पकालिक तैयार करने के लिए, एक बाँझ 200 μl विंदुक टिप के साथ जमे हुए शेयर परिमार्जन और एक लेग अगर प्लेट पर एक लकीर तीन तरह प्रदर्शन. 37 और घ में थाली रातोंरात सेतेजैसे, सी के लिए अलग - अलग कालोनियों मिलता है. 4 डिग्री सेल्सियस पर थाली स्टोर
    अनुसूचित संक्रमण से पहले एक दिन, लेग अगर थाली के से एक बाँझ 200 μl विंदुक और एक संस्कृति 5 मिलीग्राम लेग मध्यम युक्त ट्यूब में डूब टिप टिप के साथ एक एकल कॉलोनी उठाओ. बैक्टीरिया रातोंरात हो जाना, या 37 में 16 घंटे के लिए एक मशीन हिलनेवाला के अंदर डिग्री सेल्सियस और 250 rpm जब तक यह घातीय विकास के चरण में पहुंचता है. 600 आयुध डिपो में एक स्पेक्ट्रोफोटोमीटर के साथ एकाग्रता उपाय. इस चरण में एकाग्रता 0.5 से 1 तक के बीच है. यदि एकाग्रता बहुत अधिक है, बैक्टीरिया subculture और एक और कई घंटे के लिए विकसित करने के लिए एक इष्टतम एकाग्रता प्राप्त करने के लिए. एक लौ स्रोत के पास कार्यविधि. कुछ जीवाणु उपभेदों एंटीबायोटिक प्रतिरोध के लिए इंजीनियर हैं मध्यम और बड़े हो रहे हैं और उचित एंटीबायोटिक के लिए चयनित करने के लिए जोड़ा एस. marcescens (# ATCC +८,१००) एंटीबायोटिक प्रतिरोधी नहीं हैं और इसलिए एंटीबायोटिक बिना बाँझ माध्यम में हो. बाँझ तकनीक को सत्यापित करने के लिए, एक नकली cultuएक नियंत्रण के रूप में बैक्टीरिया के बिना कर रहे हैं.
    समाधान के लिए मक्खियों को संक्रमित (600 आयुध डिपो 0.1 = पतला) बैक्टीरिया और 1% पीबीएस में खाना रंग (अच्छे ब्लू FCF) शामिल हैं. लेग संक्रमण और पीबीएस में 1% नीले खाद्य रंग समाधान में इस्तेमाल मध्यम के बराबर राशि जोड़कर इंजेक्शन नियंत्रण के लिए एक समाधान तैयार. बर्फ पर समाधान की दुकान.
  2. मक्खियों को इंजेक्शन लगाने के लिए तैयार कांच सुइयों. एक ठीक टिप का उपयोग कर एक micropipette डांड़ी (Narishige) कांच capillaries (आयुध डिपो = 1 मिमी, id = 0.58 मिमी, थोक मूल्य सूचकांक) खींचो. एक विदारक माइक्रोस्कोप के तहत ठीक संदंश का उपयोग करने के लिए सुई की नोक तोड़ इतना है कि उद्घाटन के काफी बड़े के लिए एक सिरिंज के साथ चूषण लागू करने के द्वारा इंजेक्शन तरल पदार्थ के साथ भरने के लिए, लेकिन काफी छोटे इंजेक्शन प्रक्रिया के दौरान उड़ान भरने के लिए क्षति को कम से कम है. टिप तोड़ने के बाद, टिप आकार 40-50 सुक्ष्ममापी के आसपास होना चाहिए. गिलास सुई टयूबिंग की लंबाई के साथ एक 3 सीसी प्लास्टिक सिरिंज से जुड़ा हुआ है. इंजेक्शन मध्यम के प्रवाह मैन्युअल आवेदन सकारात्मक दबाव या नियंत्रित किया जाता हैसिरिंज के साथ uction. इंजेक्शन तरल पदार्थ के साथ रबर टयूबिंग contaminating, सिरिंज तंत्र के रूप में दोनों संक्रमण और नियंत्रण इंजेक्शन के लिए प्रयोग किया जाता है से बचें.
  3. उन्हें एक सीओ 2 के पैड पर डाल द्वारा मक्खियों anesthetize. सीओ 2 पानी की एक मोहरबंद कंटेनर के माध्यम से पारित करने के लिए पैड गीला और स्थैतिक बिजली, जो पैड पर मक्खियों की हेरफेर को जटिल बना सकता है कम. पृष्ठीय छाती की स्कुटेलम ऊपर क्षेत्र में कांच सुई poking द्वारा मक्खियों इंजेक्षन. मक्खी में इंजेक्शन के माध्यम के पारित खाद्य रंग द्वारा सत्यापित है - मक्खियों प्रणाली के माध्यम से खाद्य रंग फैलता है के रूप में नीले रंग की बारी. बैक्टीरिया है कि मक्खियों प्राप्त की खुराक के रूप में धारा 3 में वर्णित मात्रा निर्धारित किया जा सकता है, नीचे. कुछ प्रयोगात्मक डिजाइन एक नियंत्रण समूह है कि सड़न रोकनेवाला चोट पीबीएस और खाद्य रंग के साथ है, लेकिन बैक्टीरिया बिना मक्खियों इंजेक्शन द्वारा प्राप्त शामिल हैं.

3. बैक्टीरियल लोड निर्धारित

एक दृष्टिकोण evaluatinछ जीवाणु संक्रमण के खिलाफ प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के लिए जीवाणु लोड के बाद संक्रमण निर्धारित है. डी. मेलानोगास्टर एक महान मॉडल इस पैरामीटर तय है क्योंकि पूरे उड़ान भरने के लिए एक व्यक्ति के भीतर कुल बैक्टीरियल संख्या का अनुमान homogenized जा सकता है. इस प्रोटोकॉल के पीछे तर्क यह है कि जब Luria (पौंड) शोरबा एक पेट्री डिश पर अगर (लेग प्लेट) के रूप में एक ठोस माध्यम पर हो, एक जीवाणु एक दृश्य वर्गो में विभाजनीय कॉलोनी रूपों. इसलिए, पौंड तरल माध्यम में संक्रमित मक्खियों homogenizing, homogenate के धारावाहिक dilutions, और लेग प्लेटों पर पतला homogenate के प्रसार से, जीवाणु एक मक्खी को संक्रमित कोशिकाओं की संख्या निर्धारित किया जा सकता है. पीबीएस और खाद्य रंग के साथ है, लेकिन बैक्टीरिया बिना इंजेक्शन मक्खियों के एक नियंत्रण समूह को सत्यापित करें कि संक्रमण अन्य बैक्टीरियल प्रजातियों के साथ दूषित नहीं किया गया था के लिए किया जाना चाहिए. इस हालत में लेग अगर प्लेट पर कोई कालोनियों होना चाहिए.

  1. सभी सामग्री है कि इस के लिए इस्तेमाल किया जाएगा आटोक्लेववास्तविक homogenization कदम प्रदर्शन से पहले प्रक्रिया. यह 200 μl विंदुक कैंची, लेग मीडिया और pestles homogenization के लिए प्रयोग किया जाता के साथ कटौती सुझाव भी शामिल है. 10 सेमी बाँझ पेट्री डिश में autoclaved मध्यम / लेग अगर कम से कम 1 दिन घनघोर मक्खियों homogenizing पहले प्लेटों को तैयार करो.
  2. Anesthetize और 1.5 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब और दुकान ट्यूब में बर्फ पर मक्खियों एकत्र.
  3. प्रदूषण को रोकने के लिए एक लौ निकट homogenization प्रदर्शन. नियंत्रण संक्रमण के बिना मक्खियों युक्त homogenization खासकर जब एस के रूप में एक बैक्टीरियल तनाव का उपयोग करने की सिफारिश की है marcescens, जो एंटीबायोटिक प्रतिरोधी नहीं कर रहे हैं. 10 मक्खियों के प्रति प्रत्येक प्रयोगात्मक हालत 2 समूहों की एक न्यूनतम homogenize. homogenate प्रति इस्तेमाल मक्खियों की संख्या experimenter द्वारा निर्धारित किया जाता है. कुछ समूहों homogenate प्रति एक मक्खी का इस्तेमाल किया है, जो व्यक्ति 8 मक्खियों के बीच जीवाणु लोड में परिवर्तन के मूल्यांकन के लिए उपयोगी है, जबकि दूसरों के प्रति 3-10 मक्खियों से homogenate का इस्तेमाल किया हैजीनोटाइप या प्रयोगात्मक हालत 9-12 भर तुलना.
    1. प्रत्येक microcentrifuge मक्खियों युक्त ट्यूब 400 μl लेग मध्यम जोड़ें और एक छोटे से मोटर और मूसल (Kontes) का उपयोग homogenize.
    2. निष्फल कटौती विंदुक युक्तियाँ का प्रयोग, 1.5 μl microcentrifuge ट्यूब 180 μl लेग मध्यम युक्त 20 μl homogenized लेग बैक्टीरियल / मध्यम जोड़कर सीरियल homogenate 1:10 पतला. विंदुक युक्तियाँ काटना मक्खी मलबे से रुकावट को रोकता है और यह सुनिश्चित करता है कि एक उचित मात्रा में स्थानांतरित किया जा रहा है.
    3. कमजोर पड़ने कारक empirically निर्धारित किया जाता है और मक्खी के जीनोटाइप, बैक्टीरियल तनाव, और प्रयोगात्मक हालत पर निर्भर करता है. जंगली प्रकार एस से संक्रमित मक्खियों marcescens, तुरंत बाद संक्रमण homogenized मक्खियों के लिए 3 2 1:10 या 1:10 के dilutions उपयोग करते हैं, और मक्खियों के लिए 5 4 1:10 या 1:10 के dilutions 24 घंटे के बाद संक्रमण homogenized.
    4. 100 μl / mic से बैक्टीरियल मध्यम लेग जोड़ेंrocentrifuge युक्त अंतिम कमजोर पड़ने और ट्यूब एक लेग गिलास गेंदों (VWR) का उपयोग करने के लिए एक भी वितरण को सुनिश्चित करने के प्लेट पर मध्यम फैल गया.
    5. 100% EtOH समाधान में गिलास गेंदों त्यागें. एक 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में लेग प्लेट जगह रातोरात.
    6. एक वैकल्पिक कदम के रूप में, दृश्य प्रकाश के साथ एक इमेजिंग प्रणाली का उपयोग करने के लिए लेग प्लेट (+८९०० FluorChem, अल्फा Innotech) की एक छवि प्राप्त. या तो थाली पर ही या फ़ोटोशॉप सॉफ्टवेयर (Adobe Photoshop CS3) पर भरोसा उपकरण का उपयोग थाली की छवि से कालोनियों की संख्या की गणना.
    7. की संख्या कॉलोनी के गठन सूत्र का उपयोग मक्खी प्रति यूनिट की गणना: [/ n (एन * डी * v)] * वी, जहां n लेग प्लेट पर विकसित कालोनियों की संख्या = एन = मक्खियों की संख्या में जमा microcentrifuge ट्यूब, डी = कमजोर पड़ने कारक, और वी के समाधान के = मात्रा प्रत्येक की थाली पर फैला, वी = homogenate की प्रारंभिक मात्रा.

4. नींद और संक्रमण के बाद अस्तित्व अवधि का मूल्यांकन

  1. के लिएमक्खियों कि जीवाणु लोड को मापने के लिए काटा नहीं कर रहे हैं, एक और 7-10 दिनों के लिए व्यवहार की निगरानी जारी है. जीवित रहने की अवधि मक्खी, पर्यावरणीय परिस्थितियों के जीनोटाइप से प्रभावित है, और प्रजातियों के जीवाणु के संक्रमण के लिए इस्तेमाल किया.
  2. ~ 10 दिनों के बाद, प्रयोग समाप्त कर सकता है, डाउनलोड और व्यवहार डेटा के रूप में पहले से वर्णित 6 की प्रक्रिया. Insomniac2 कस्टम सॉफ्टवेयर, जो Matlab में आधारित है, करने के लिए नींद पैरामीटर का विश्लेषण करने के लिए प्रयोग किया जाता है. यह व्यवहार विश्लेषण से मृत मक्खियों को खत्म करने के लिए महत्वपूर्ण है. आम तौर पर, इस संक्रमण के बाद पहले दिन के भीतर का विश्लेषण करती है, को प्रतिबंधित संक्रमण और मक्खी जीनोटाइप के प्रकार पर निर्भर करता है. परख में मौत समय सभी गतिविधियों की गिनती शून्य तक पहुँच चुके हैं ने संकेत दिया है. अस्तित्व के विश्लेषण की सुविधा, Drosonex, कस्टम सॉफ्टवेयर Microsoft Visual में लिखा सी + + 6.0 है, कच्चे Trikinetics बांध प्रणाली से डेटा फ़ाइलों पर कार्रवाई करने के लिए किया है. Excel फ़ाइलों, एक मक्खी के जीवित रहने की अवधि (घंटे में), के रूप में सॉफ्टवेयर रिपोर्ट compiles गतिविधि datएक एकल स्प्रेडशीट में सभी मॉनिटर से एक और रिपोर्ट प्रतिशत मक्खियों उपयोगकर्ता द्वारा सेट के रूप में समय के साथ जीवित रहने का. एक्सेल फाइल करने के लिए आगे के विश्लेषण के लिए अन्य सांख्यिकीय सॉफ्टवेयर संकुल में एकीकृत करने के लिए डिजाइन किए हैं.

5. संक्रमण के दौरान एक luciferase रिपोर्टर परख का उपयोग NFκB गतिविधि को मापने

ट्रांसजेनिक κB-luc इस परख में इस्तेमाल किया मक्खियों पहले कू एट अल में वर्णित उत्पन्न किया गया, 2 2010. संक्षेप में, संवाददाता κB-luc एक NFκB बाध्यकारी अनुक्रम कि एक प्रमोटर में डाला गया एक luciferase खुला पढ़ने फ्रेम के ऊपर के 8 दोहराता शामिल हैं.

  1. प्रयोगात्मक प्रकाश के रूप में 1.2 खंड में वर्णित शर्तों मक्खियों को समायोजित करें. इस उदाहरण में, 1-4 दिन पुराने κB-luc मक्खियों एक 5% sucrose, 2% अगर भोजन मध्यम और 2 दिनों के लिए निरंतर प्रकाश (डालूँगा) में रखा संक्रमण के दौरान अन्य मक्खियों के रूप में एक ही उम्र तक पहुँचने युक्त शीशियों में रखे जाते हैं.
  2. मक्खियों के लिए एक 96-अच्छी तरह से microplate तैयार. हर अच्छी तरह से भोजन मध्यम के 2 परतों (2 चित्रा) शामिल हैं, ऊपर परत Luciferin, luciferase के सब्सट्रेट शामिल हैं. एक 5% sucrose, एक अच्छी तरह से 2% अगर समाधान के 300 μl जोड़ें और कठियाना करने की अनुमति देते हैं. अगला, प्रत्येक अच्छी तरह से युक्त 5% sucrose, अगर 1%, और 2 मिमी Luciferin (गोल्ड जैव प्रौद्योगिकी, Inc) एक 50 μl शीर्ष परत जोड़ने. Luciferin ड्रोसोफिला में मापने संवाददाता गतिविधि के लिए इस्तेमाल किया सांद्रता साहित्य में विविध है, और 100 13 सुक्ष्ममापी के रूप में कम के रूप में किया गया है. आवश्यक एकाग्रता empirically निर्धारित किया जा सकता है. वितरण भोजन परतों के बीच एक ठीक जाल कपड़े सुखाने जबकि बाँझपन बनाए रखने की सुविधा के साथ थाली कवर. थाली करने के लिए अच्छी तरह से सूखे की अनुमति दी जानी चाहिए, एक घंटे के क्रम में संक्षेपण बूंदों में अटक रही मक्खियों को रोकने के. Luciferin प्रकाश के प्रति संवेदनशील है, क्योंकि प्लेटों को उजागर करने के लिए आवश्यकता से अधिक प्रकाश से बचने के लिए.
  3. एक स्पष्ट चिपकने वाली फिल्म (शीर्ष लागूसील-A, Perkin एल्मर एक 96-अच्छी तरह microwell प्लेट और छेदना अच्छी तरह से प्रति 2 छेद के एक मात्रा में एक ठीक सुई का उपयोग करने के लिए). ये छेद केवल एक अच्छी तरह से करने के लिए हवा विनिमय की अनुमति नहीं देते, लेकिन भी एक एक व्यक्ति के आधार पर मक्खियों anesthetize तरीका प्रदान करेगा. एक तेज ब्लेड और सीधे बढ़त का उपयोग करना, प्रत्येक स्तंभ के बीच एक कट परिचय. यह लोड / 8 के समूहों में एक समय में मक्खियों अनलोड करने के लिए के लिए एक आसान तरीका प्रदान करेगा.
    Microwell थाली में मक्खियों को लोड करने के लिए, एक सीओ 2 पैड पर इनक्यूबेटर और anesthetize मक्खियों से शीशियों को हटा दें. लोड प्रत्येक स्तंभ स्तंभ अच्छी तरह से करने के लिए एक से एक मक्खियों. एक अनजाने उड़ना चाहिए चिपकने वाला सील करने के लिए अटक, मक्खी अकेले छोड़ के रूप में वे अक्सर हस्तक्षेप के बिना खुद को मुक्त करने में सक्षम हैं. डालूँगा में इनक्यूबेटर में 8-24 घंटा नए वातावरण को समायोजित करने के लिए और Luciferin सब्सट्रेट का उपभोग करने के लिए microwell प्लेट लौटें.
  4. संस्कृति बैक्टीरिया, एस. marcescens, और संक्रमण के लिए एक समाधान के रूप में ऊपर वर्णित तैयार.
  5. संज्ञाहीन करना टीवह एक कम दबाव एक सीओ 2 लाइन जुड़ी micropipette टिप का उपयोग करके मक्खियों. वेंटिलेशन प्रत्येक के लिए अच्छी तरह बने छेद सीधे ऊपर micropipette टिप रखें. सीओ 2 के दबाव पर्याप्त उच्च करने के लिए मक्खी संज्ञाहीन करना है, लेकिन काफी कम करने के लिए उड़ान भरने के लिए चोट से बचने के लिए सुनिश्चित करें कि सावधानी रखना. आठ के समूह में, व्यक्तिगत रूप से एक सीओ 2 पैड एक मक्खी हस्तांतरण, और को संक्रमित के रूप में ऊपर वर्णित है. संक्रमण के बाद, अपने मूल के एक मक्खी अच्छी तरह से वापस और microplate reseal.
  6. उपाय luminescence (TopCount - NXT Luminescence और जगमगाहट काउंटर, Perkin - Elmer). प्लेटें, जो प्रोग्राम और स्वचालित रीडिंग के लिए समय के किसी भी लम्बाई (आम तौर पर पांच दिन) के लिए वांछित वेतन वृद्धि पर लगातार की अनुमति देता है के लिए TopCount luminescence काउंटर stacking कैसेट शामिल हैं. यह सुविधा सभी उपकरणों पर उपलब्ध नहीं है, और अन्य उपकरणों के साथ प्रदर्शन प्रयोगों के लिए डेटा संग्रह इसलिए लगातार कम हो सकता है. luminescence काउंटर एक ro में रखे हैएक नियंत्रित तापमान और प्रकाश कार्यक्रम के साथ ओम. जब stacking कैसेट में प्लेटें लोड हो रहा है, जिसमें स्पष्ट रिक्त प्लेटों के बीच मक्खियों को सुनिश्चित करना है कि मक्खियों प्रकाश प्राप्त प्लेटें हो चुकी है. कार्यक्रम निर्माता विनिर्देशों के अनुसार करने के लिए रीडिंग 24 घंटे की एक न्यूनतम के लिए हर घंटे एकत्र luminometer. इस उदाहरण में, डिटेक्टरों के लिए 10 सेकंड के लिए एक अच्छी तरह से पढ़ सकते हैं और प्रति सेकंड (मनमाना यूनिट) के रूप में गिना जाता है परिणाम व्यक्त क्रमादेशित रहे हैं. यह मूल्य अच्छी तरह से प्रति 3 रीडिंग भर में औसत है. एक स्प्रेडशीट डेटा फ़ाइलों को निर्यात और एक मानक विश्लेषण करने, luminescence के परिणाम रेखांकन.

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Representative Results

  1. संक्रमण नींद को बढ़ावा देता है. इस उदाहरण में, गुआंगज़ौ-S (सीएस) जंगली प्रकार मक्खियों और उत्परिवर्ती मक्खियों एक NFκB जीन, स्वाद (E20 रिलायंस) 14 की कमी, दो DAM2 गतिविधि मॉनिटर में लोड किया गया (n = प्रत्येक जीनोटाइप के लिए 32) और संक्रमित के रूप में ऊपर वर्णित है. मक्खियों लगातार व्यवहार और 2,7,8 संक्रमण पर circadian घड़ी के प्रभाव को समाप्त करने के प्रकाश में बनाए रखा गया. रिलायंस E20 म्यूटेंट के सीएस isogenized थे के रूप में 11 पहले से वर्णित है. मक्खियों के दोनों सेट एस से संक्रमित थे marcescens और परिणाम चित्रा 3 में चित्रित कर रहे हैं. कुछ मामलों में, एक अतिरिक्त संभाला नियंत्रण समूह 2 संक्रमण के प्रभाव से निपटने के प्रभाव फर्क करने के लिए उपयोगी है. संभाला नियंत्रण समूहों संक्रमित समूहों के रूप में एक ही पर्यावरण परिवर्तन है, जो समय की इसी अवधि के लिए इन्क्यूबेटरों और anesthetization से हटाने को उजागर कर रहे हैं, लेकिन वे एक इंजेक्शन नहीं प्राप्त करते हैं. हालांकि, इस उदाहरण में, यह स्पष्ट है कि रिलायंस E20 म्यूटेंट सीएस संक्रमण (चित्रा 3A) के बाद मक्खियों नियंत्रण की तुलना में कम नींद का अनुभव है. 6 के रूप में पहले से वर्णित है, वहाँ अन्य व्यवहार मापदंडों है कि बांधों परख से मापा जा सकता है. प्रति इकाई समय कुल गतिविधि मायने रखता है (3B चित्रा) में शामिल हो सकते हैं. इस उदाहरण में, संक्रमण दर्पण के बाद है कि नींद की गतिविधि में परिवर्तन. हम भी गतिविधि की दर, या जागते प्रति मिनट गतिविधि मायने रखता है (चित्रा 3C) की रिपोर्ट. यह पैरामीटर मक्खियों में हरकत करने की क्षमता का एक सूचक है. इस मामले में, जागने गतिविधि दरों या तो जीनोटाइप में संक्रमण है, जिससे पता चलता है कि गतिविधि या नींद में वृद्धि में कमी कम हरकत करने की क्षमता का एक परिणाम नहीं है के दौरान नहीं बदल सकता हूँ.
  2. चित्रा 4A संक्रमण के बाद जीवित रहने की दर को दर्शाया गया है. लगातार पिछले 14,15 निष्कर्षों के साथ, रिलायंस E20 म्यूटेंट तेजी से करने के लिए समर्पणfection के रूप में जंगली प्रकार मक्खियों की तुलना में. हाल सड़न रोकनेवाला नियंत्रण इंजेक्शन (4B चित्रा) से बच मक्खियों, यह दर्शाता है कि संक्रमण के लिए और इंजेक्शन की वजह से चोट नहीं झुक मक्खियों. क्योंकि स्वाद म्यूटेंट इतनी जल्दी मर गया, केवल सीएस मक्खियों को बैक्टीरिया के संक्रमण के बाद लोड (5 चित्रा) का प्रदर्शन इस्तेमाल किया गया चित्रा. एस 5 कि शो marcescens संक्रमण के बाद 24 घंटा मक्खी में पैदा जारी है.
  3. Luciferase रिपोर्टर गतिविधि परख में चार व्यक्ति मक्खियों (6 चित्रा) में समय में दिखाया गया है. बड़े डेटा अंक और व्यक्तिगत मक्खियों के बीच भिन्नता कुओं के अंदर चारों ओर जाने मक्खियों के लिए जिम्मेदार ठहराया जा सकता है. हालांकि संकेत मक्खी के भीतर सभी ऊतकों से निकाली गई है, यह उम्मीद नहीं है कि हर ऊतक संकेत की एक ही राशि का उत्सर्जन होगा, और ऊतक के डिटेक्टर को दृश्यता उड़ कदम के रूप में भिन्न होता है. इस उदाहरण में, मक्खियों और संक्रमित थे तुलनाएक संभाला नियंत्रण समूह के साथ. मक्खियों कि मर चित्रा 7A में दिखाया मक्खियों के एक समूह के पार विश्लेषण से बाहर रखा गया है. मृत मक्खियों दृश्य निरीक्षण द्वारा निर्धारित कर रहे हैं. इन मक्खियों में luciferase संकेत में तेज गिरावट, के रूप में के रूप में अच्छी तरह से संकेत विभिन्नता में एक कमी है, यह दर्शाता है कि मक्खी नहीं बढ़ रहा है κB-luc संवाददाता गतिविधि तेजी से संक्रमण (चित्रा 7A) और सड़न रोकनेवाला चोट के बाद ही उगता है. (चित्रा 7B ). 12 घंटा बाद चोट और संक्रमण के बाद चारों ओर संवाददाता गतिविधि चोटियों. मक्खियों के दोनों आनुवंशिक और / या व्यवहार जोड़तोड़ κB-luc संक्रमण के दौरान संवाददाता गतिविधि को संशोधित करने की उम्मीद कर रहे हैं. उदाहरण के लिए, हम पहले 2 वर्णित है कि κB-luc संवाददाता गतिविधि के प्रेरण काफी हद तक तनु था रिलायंस E20 म्यूटेंट में संक्रमण के दौरान, यह दर्शाता है इस संवाददाता κB-luc NFκB लिए विशिष्ट है.


चित्रा 1. फ़्लोचार्ट कि ड्रोसोफिला में प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया को मापने का एक प्रमुख कदम की रूपरेखा (ए) कदम के अनुक्रम मापने नींद, अस्तित्व, और एक संक्रमण के दौरान जीवाणु लोड के लिए उल्लिखित है, (बी) के कदम के अनुक्रम NFκB निर्भर मापने के लिए उल्लिखित है. luciferase रिपोर्टर गतिविधि संक्रमण के दौरान. प्रयोगों कहीं भी 1-5 दिनों से बैक्टीरियल प्रजातियों के मारक के आधार पर जारी कर सकते हैं.

चित्रा 2
चित्रा 2. एक व्यक्ति microplate की अच्छी तरह से योजनाबद्ध. मक्खियों अपारदर्शी, साथ 96 मध्यम और कवर के रूप में दिखाया गया युक्त प्लेटों में रखा जाता है. क्योंकि मक्खियों व्यक्तिगत रूप से संक्रमित हो संभाला जाएगा, यह महत्वपूर्ण टी हैओ प्लेट प्रति मक्खियों की संख्या सीमित एक राशि है कि उचित समय का एक दिया अवधि के भीतर किया जा सकता है, प्रयोगात्मक परिस्थितियों पर निर्भर करता है.

चित्रा 3
चित्रा 3. मक्खियों के व्यवहार प्रतिक्रिया एस से संक्रमित marcescens (एक) ± SEM प्रतिशत समय है कि खर्च सो रही है और (बी) मीन मक्खियों मीन ± SEM कुल गतिविधि मायने रखता है 1 दिन के लिए 4 घंटा वेतन वृद्धि में एस के साथ संक्रमण के पहले और बाद में प्लॉट किए जाते हैं marcescens. (सी) ± (बीएल आधारभूत =) से पहले के बाद एस के साथ संक्रमण SEM जागते प्रति मिनट गतिविधि मायने रखता है मतलब marcescens 8 घंटा वेतन वृद्धि में साजिश रची है. व्यवहार जंगली प्रकार सीएस मक्खियों कि कम से कम 24 घंटे के बाद संक्रमण के लिए बच के लिए सूचना दी है, और प्रतिरक्षा कमी रिलायंस E20 के लिए था मक्खियोंकम से कम 8 घंटे के बाद संक्रमण के लिए बच गया. सीएस के लिए और रिलायंस E20 के लिए = 13 n. ** = पी <0.01 और * = पी 0.05 <छात्र टी परीक्षण.

चित्रा 4
चित्रा 4. जीवन रक्षा संक्रमित और uninfected मक्खियों के परिणाम (ए) प्रतिनिधि Kaplan-Meier अस्तित्व घटता दोनों प्रकार के जंगली सीएस और प्रतिरक्षा की कमी रिलायंस E20 मक्खियों कि एस से संक्रमित थे के लिए प्लॉट किए जाते हैं. marcescens. पी = 10 -13 8.13x, रैंक परीक्षण लॉग इन करें. n = सीएस और n के लिए 31 = रिलायंस E20 मक्खियों के लिए 32. (बी) के प्रतिनिधि Kaplan-Meier अस्तित्व घटता (ए) के रूप में सूचित कर रहे हैं, को छोड़कर बैक्टीरिया बिना तरल मीडिया के साथ इंजेक्शन द्वारा मक्खियों सड़न रोकनेवाला चोट प्राप्त. लगभग सभी प्रयोगों के अंत तक (60 घंटा पोस्ट चोट) मक्खियों सड़न रोकनेवाला चोट बच. p> 0.97, लॉग rank परीक्षण, n = सीएस और रिलायंस E20 मक्खियों के लिए 32.

चित्रा 5
चित्रा 5. बैक्टीरियल लोड के एस से संक्रमित मक्खियों में मात्रा का ठहराव marcescens (ए) सीएस से प्रतिनिधि जीवाणु संस्कृति एस से संक्रमित मक्खियों marcescens है कि संक्रमण (बाएं पैनल), या संक्रमण (राइट पैनल) के बाद 24 घंटे के तुरंत बाद काटा गया. मन्दन कारकों प्रत्येक आंकड़ा नीचे संकेत कर रहे हैं. इस उदाहरण में, 10 मक्खियों प्रत्येक समूह के लिए 400 μl समाधान में homogenized गया. अंतिम कमजोर पड़ने की 100 μl प्रत्येक थाली पर फैल गया था. बाएँ प्लेट 29 कॉलोनी के गठन इकाइयों (CFU) शामिल हैं. CFU की गणना / उड़ान भरने, 29 CFU विभाजित [10 मक्खियों 0.001 * (कमजोर पड़ने कारक) * 100 (प्लेट पर मात्रा प्रसार) μl], जो 29 के बराबर होती है, और फिर 400 μl = 11,600 के प्रारंभिक मात्रा से गुणा. इस विशेष थाली के लिए, हम 1.16 एक्स के एक औसत 10 4/ CFU मक्खी. सही प्लेट 257 कालोनियों शामिल हैं. एक ही सूत्र का उपयोग करना, हम 1.03 x 10 6 CFU / मक्खी की एक औसत लगता है. (बी) एक थाली से प्रत्येक प्रयोगात्मक हालत में CFU / मक्खी की गणना करने के बाद, बॉक्स और गलमुच्छा भूखंडों उत्पन्न के रूप में दिखाया गया है. इस उदाहरण में, 25, 50 (औसत) और 75 प्रतिशतक नीचे, मध्य, और बॉक्स के शीर्ष के रूप में प्रस्तुत कर रहे हैं. त्रुटि सलाखों के तीन स्वतंत्र प्रयोगों में मानक विचलन का प्रतिनिधित्व करते हैं. ** पी <0.01 छात्र टी परीक्षण.

चित्रा 6
6 चित्रा. NFκB एस से संक्रमित व्यक्ति मक्खियों में निर्भर luciferase रिपोर्टर गतिविधि और संक्रमित मक्खियों (सही पैनल), marcescens कच्चे डेटा के प्रतिनिधि उदाहरण व्यक्ति uninfected (छोड़ दिया पैनलों संभाला नियंत्रण) मक्खियों के लिए दिखाए जाते हैं. एक आधारभूत पढ़ने (समय '0 ') संक्रमण या हैंडलिंग से पहले तुरंत एकत्र किया गया था, अन्य सभीसमय अंक के बाद मक्खियों इलाज किया गया एकत्र किए गए. Y अक्षों संक्रमित और संभाला नियंत्रण की स्थिति में मक्खियों के बीच में बड़े पैमाने में मतभेद नोट. एक मक्खी के भीतर संकेत के बड़े बदलाव microwell अंदर मक्खी के आंदोलन करने के लिए जिम्मेदार ठहराया जा सकता है.

7 चित्रा
चित्रा 7. एस के साथ संक्रमण marcescens या सड़न रोकनेवाला इंजेक्शन के साथ चोट रहने वाले मक्खियों में κB-luc संवाददाता गतिविधि बढ़ जाती है मतलब ± SEM luciferase गतिविधि (मनमाना इकाइयों) सभी मक्खियों कि संक्रमित थे भर में हर 4 घंटा साजिश रची है (ए) या ​​सड़न रोकनेवाला इंजेक्शन (बी) से घायल और ऊपर बच. 24 परख में. दोहराया उपायों के साथ एक तरह से एनोवा संकेत दिया कि रिपोर्टर गतिविधि संक्रमित में काफी वृद्धि हुई है (<0.05 पी), घायल (inj, पी <0.01), और उनके संभाला चोरtrol (एचसी, पी <0.01) अपने आधारभूत के सापेक्ष समूहों (समय '0 '; Tukey के बाद अस्थायी). (सम्मिलित करें, पैनल): HC समूह से डेटा एक अलग स्तर पर प्लॉट किए जाते हैं. कोर्ट समूह में संवाददाता गतिविधि में छोटी लेकिन महत्वपूर्ण वृद्धि से पता चलता है कि मक्खियों हल्के तनाव का अनुभव हो सकता है या हैंडलिंग (microwell प्लेट और anesthetization समकक्ष से संक्रमित मक्खियों हस्तांतरण) से जागना बढ़. दोनों संक्रमित और घायल समूहों κB-luc संवाददाता गतिविधि के मजबूत inductions से पता चला है कि कोर्ट समूह में महत्वपूर्ण है कि अधिक से अधिक संकेत समय बिंदुओं पर थे * = पी 0 0.05 <; ** = 0 <.01 p; छात्र टी - (ए) n = 20 कोर्ट और n = 13 के लिए संक्रमण, (बी) n = 15 कोर्ट और n = 14 चोट के लिए परीक्षण.

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Discussion

इस प्रोटोकॉल की जांच कैसे व्यवहार विशेष रूप से सो, प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया मापदंडों से जुड़ा हुआ है के लिए एक दृष्टिकोण की रूपरेखा. इन मानकों जीवाणु लोड, अस्तित्व परिणाम, और NFκB गतिविधि vivo में luciferase रिपोर्टर द्वारा मापा के रूप में शामिल हैं. एक साथ इन मानकों कितनी अच्छी तरह एक मक्खी एक संक्रमण से लड़ने के बारे में जानकारी प्रदान करते हैं. बैक्टीरियल लोड और अस्तित्व परिणाम प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया पैरामीटर है कि ड्रोसोफिला में एक सीधा माप शामिल रिलायंस E20 म्यूटेंट, जो एक NFκB प्रतिलेखन कारक है कि प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के लिए केंद्रीय है, मृत्यु को प्राप्त होना जीवाणु संक्रमण तेजी से कमी. व्यवहार के आनुवंशिक या अन्य जोड़तोड़ भी इन प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया पैरामीटर NFκB गतिविधि ही प्रभावित को प्रभावित करने, संभवतः. उदाहरण के लिए, अभाव से पहले संक्रमण स्वाद mRNA की वृद्धि अभिव्यक्ति के लिए, सोने और कम कर देता है CFU / गैर वंचित 11 नियंत्रण के सापेक्ष उड़ान भरने के. Mutanघड़ी जीन, अवधि 7 और 8 कालातीत के टीएस भी एक संक्रमण के दौरान जीवित रहने के रूप में के रूप में अच्छी तरह से बैक्टीरिया 8 निकासी को कम बताया गया है. आगे के अध्ययन है जो इस दृष्टिकोण का उपयोग कैसे व्यवहार प्रतिरक्षा समारोह को प्रभावित कर सकते में यंत्रवत अंतर्दृष्टि प्रदान की उम्मीद कर रहे हैं.

प्रक्रिया / इंजेक्शन संक्रमण हम यहाँ का वर्णन एक वू एट 16 अल द्वारा पहले से वर्णित विधि से संशोधित किया गया है. यह प्रक्रिया सरल और सस्ती है. हालांकि, एक नुकसान डाई का उपयोग के साथ के रूप में एक सूचक क्रूड और परिवर्तनशीलता में योगदान कर सकते हैं कि इंजेक्शन मात्रा के मैनुअल नियंत्रण है. अन्य समूहों का इस्तेमाल किया है एक microinjector एक निरंतर इंजेक्शन मात्रा 17 सक्षम है या छुरा घोंपा एक सुई के साथ मक्खियों बैक्टीरियल 18 संस्कृति में डूबा हुआ है. बहरहाल, यहाँ प्रस्तुत पद्धति बैक्टीरियल निकासी में प्रयोगात्मक 11,19 शर्तों में परिवर्तन का पता लगाने में सफल रहा है </> समर्थन.

संक्रमण के दौरान मक्खियों के अस्तित्व को आम तौर पर नियमित रूप से समय अंतराल में शेष मक्खियों की गिनती द्वारा मात्रा निर्धारित है. यहाँ हम Trikinetics बांध प्रणाली का उपयोग करने के लिए व्यक्ति मक्खियों, जो गतिविधि की समाप्ति ने संकेत दिया है में मृत्यु के समय पर नजर रखने के. हम सत्यापित किया है कि अस्तित्व परिणाम के रूप में हरकत गतिविधि द्वारा निर्धारित (अप्रकाशित) संक्रमण के दौरान गतिविधि ट्यूब में मक्खियों के दृश्य निरीक्षण द्वारा निर्धारित किया है कि के रूप में एक ही है. इस विधि को भी पहले से इस्तेमाल किया गया है जीवन 20,21 अवधि उपाय. हालांकि, यह नोट करना महत्वपूर्ण है कि बांध प्रणाली में अस्तित्व के मूल्यांकन पृथक मक्खियों सीमित है, और इस हालत से प्राप्त परिणामों को समूहीकृत स्थितियों में उन लोगों से अलग होने की उम्मीद कर रहे हैं कि. प्रारंभिक अध्ययन अस्तित्व में मतभेद जब मेजबान समूहों में पृथक 22 शर्तों बनाम रखा है दिखाया गया है. हाल ही में काम की भी पुष्टि की है कि मक्खियों के समूहों के जीवन काल में रह गया हैपृथक 20 मक्खियों में से.

Luciferase रिपोर्टर गतिविधि घड़ी जीवित मक्खियों में जीन की अभिव्यक्ति (उदाहरण के लिए, 23 रेफरी) के विश्लेषण के लिए किया गया है पहले से इस्तेमाल किया. इन मामलों में, अन्य तकनीकी कारणों से आवश्यक है, विशेष रूप से Luciferin सब्सट्रेट की कमी जो परख चलाने का कई दिनों से अधिक होता है. इसके विपरीत, परख यहाँ वर्णित संक्रमित मक्खियों के अस्तित्व के लिए सीमित है और संक्रमण के बाद 24 घंटे से अधिक एक सीधा माप शामिल. एक दोहराया उपायों एनोवा आधारभूत से प्रत्येक समूह के भीतर परिवर्तन का मूल्यांकन करने के लिए पर्याप्त था. Luciferase पत्रकारों के एक circadian सामान्यीकरण कदम के साथ साथ, दोलन का विश्लेषण सब्सट्रेट कमी के लिए सही सांख्यिकीय दृष्टिकोण पूरी तरह से 24 कहीं चर्चा कर रहे हैं. या तो मामले में, व्यक्तिगत मक्खियों में वास्तविक समय संवाददाता गतिविधि को मापने के स्टेशन की तुलना में अपने अस्थायी गतिशीलता के बारे में जानकारी निकालने के लिए एक अधिक कुशल तरीका हैndard जैव रासायनिक और immunohistochemical assays.

हालांकि, vivo में luciferase रिपोर्टर गतिविधि की निगरानी के लिए एक संभावित नुकसान है कि यह Luciferin सब्सट्रेट मक्खियों खाने पर निर्भर है. आहार मक्खियों में संक्रमण के साथ संबद्ध किया गया है, और खिला भी संक्रमण के प्रकार के साथ या 25 जीनोटाइप के बीच भिन्न हो सकते हैं. सब्सट्रेट की घूस के बारे में चिंता को दरकिनार करने के लिए, मक्खियों संक्रमण के बाद अलग - अलग शरीर के अंगों या ऊतकों में dissected किया जा सकता है, और रिपोर्टर गतिविधि संस्कृति में मापा जा सकता है के रूप में पहले 26 में वर्णित है. वैकल्पिक रूप से, luciferase परख से परिणाम भी एक मानक परख है कि भोजन पर भरोसा नहीं करता का उपयोग सत्यापित किया जा सकता है. उदाहरण के लिए, मात्रात्मक पीसीआर रोगाणुरोधी पेप्टाइड mRNA (एएमपी) की अभिव्यक्ति के स्तर को मापने के लिए आमतौर पर इस्तेमाल किया दृष्टिकोण किया गया है. AMPS NFκB के ज्ञात लक्ष्य कर रहे हैं, और इसलिए गतिविधि के अपने स्तर का संकेत है.

प्रतिनिधि datएक यहाँ बताया कि पिछले काम दिखा है कि NFκB प्रतिरक्षा चुनौती है और 2 नींद में बाद में वृद्धि के साथ बढ़ जाता है पुनरावृत्ति करना. हालांकि, पाठकों को आगाह कर रहे हैं Trikinetics बांध प्रणाली में है कि नींद निष्क्रियता द्वारा लगातार पाँच 27 मिनट की एक न्यूनतम के लिए संकेत दिया है. वीडियोग्राफी द्वारा मक्खी में सोने के मापन 28 निष्क्रियता पर भी निर्भर करता है. मक्खियों में यह सोने परिभाषा एक संक्रमण के दौरान संभावित समस्याग्रस्त किया जा सकता है, क्योंकि यह भी ज्ञात है कि प्रतिरक्षा चुनौती दी जानवरों 29 सो बिना लंबी अवधि के लिए निष्क्रिय हो जाएगा. इस मुद्दे पर काबू पाने, assays कि उपाय संवेदी जवाबदेही को सत्यापित करें कि मक्खियों वास्तव में सो रहे हैं के लिए आवश्यक हैं. जांचकर्ताओं को एक पेंसिल 30 नल जैसे संवेदी उत्तेजनाओं, एक लकड़ी के 31 छड़ी, या हीटिंग एक 27 ट्यूब के एक छोर के साथ गतिविधि ट्यूबों brushing मक्खियों की जवाबदेही निर्धारित की है. सभी मामलों में, सो मक्खियों कम उत्तरदायी हैं (मापाया तो प्रतिक्रिया विलंबता प्रतिशत या जाग मक्खियों की तुलना में एक समूह के रूप में जवाब) मक्खियों. हमने पाया है कि संक्रमित मक्खियों कि सो रहे हैं वास्तव में कम करने के लिए संवेदी stimuli करने के लिए उत्तरदायी हैं 6-8 घंटा पोस्ट संक्रमण (TH. कू और जावेद विलियम्स, अप्रकाशित अवलोकन). तकनीकी सीमाओं के बावजूद, Trikinetics बांध प्रणाली एक उच्च throughput लाभ कि मक्खियों कि नींद और प्रतिरक्षा समारोह के बीच एक आनुवंशिक और आणविक लिंक का पता लगाने में भविष्य के अध्ययनों के लिए उपयोगी हो जाएगा प्रदान करता है.

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Disclosures

ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.

Acknowledgments

अनुदान IOS-1025627 # के तहत यह काम राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन द्वारा समर्थित किया गया और अनुदान के तहत स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थानों द्वारा # 1R21NS078582-01 जबड़े

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Equipment
Incubators Percival Scientific, Inc. I30BLLC8
I36VLC8
Any incubator capable of running programmed light/temperature schedules is appropriate.
Drosophila Activitiy Monitors Trikinetics Inc., Waltham, MA DAM2 As described elsewhere6, this system requires a computer interface, software, and other accessories.
Pyrex Glass Tubes Trikinetics Inc., Waltham, MA PGT-5x65
Microplate scintillation and luminescence counter Perkin Elmer TopCount NXT
12 detector
Any microplate reader capable of detecting luminescence can be used for this type of reporter assay. TopCount contains multiple detectors and an automated stacker; it is capable of being programmed to read continuously from multiple plates.
FluorChem 8900 Alpha Innotech Imaging of bacterial cultures is optional; any digital imaging system with visual light capability is sufficient.
Micropipette Puller Tritech Research, Inc. Narishige PC-10
Supplies
Borosilicate Glass Capillaries World Precision Instrument Inc. 1B100F-4
3 ml Syringe Fisher Scientific BD 305482
Syringe Needles Fisher Scientific BD 305196 18 G - cut off the tip of the needle to prevent damage to the tubing.
Silicone Tubing, i.d. (0.030") o.d. (0.065") Wall Thickness (0.018") VWR 60985-706 Used for attaching glass capillary needles to a syringe
3 Way Stopcock American Pharmaseal Company K75
Kontes Pellet Pestle Cordless Motor Fisher Scientific K749540-0000
Kontes Pellet Pestle Fisher Scientific K749521-1590
Glass balls 3mm VWR 26396-630
Microplate Microlite 1+ Thermo Scientific 7571 Select 96-well plates that are appropriate for luminescence - they must be opaque.
TopSeal-A:96-well Microplates PerkinElmer 6005185 Microplate Press-On Adhesive Sealing Film
D-Luciferin, Potassium Salt Gold BioTechnology, Inc. LUCNA
Software
Insomniac2 Available upon request to the authors custom; written by Lesley Ashmore, Ph.D. (Westminster College) Matlab based software that has been used routinely for analysis of sleep2,6,11
Drosonex Available upon request to the authors custom; written by Thomas Coradetti (Sidewalk Software) A PC MSVC6 program used for survival analysis from raw data files collected with the Trikinetics system
Photoshop CS3 Adobe Useful for obtaining numbers of cfu/plate from digital images (optional)

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Kuo, T. H., Handa, A., Williams, J. A. Quantitative Measurement of the Immune Response and Sleep in Drosophila. J. Vis. Exp. (70), e4355, doi:10.3791/4355 (2012).

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