Summary
免疫応答と行動の間のリンクを理解するために、我々は中に運動行動を測定する方法を説明します
Abstract
免疫応答とホストの動作の間の複雑な相互作用は、種の広い範囲に記載されている。過剰睡眠は、特に、哺乳類1感染に対する反応として起こることが知られており、また、最近、 キイロショウジョウバエ 2に記載されている。これは、一般的に睡眠が感染時に宿主に有益であり、それは強力な免疫システム3,4の維持に重要であることが受け入れられている。しかし、この仮説を支持する実験的証拠は、4限られており、免疫応答時の過剰睡眠の機能は不明なままである。我々は、この複雑な問題に対処するための学際的なアプローチを使用していて、単純な遺伝モデル系、ショウジョウバエキイロショウジョウバエの研究を行ってきた。我々はハエの運動行動と睡眠を測定するための標準的なアッセイを使用し、このアッセイはハエinfecteにおける挙動を測定するために使用される方法を示してい細菌の病原性株でd。このアッセイはまた、感染時に個々のハエの生存期間を監視するのに役立ちます。免疫機能の追加措置は、感染症およびNFκB、 ショウジョウバエの自然免疫応答の中心となる重要な転写因子の活性化をクリアするハエの能力を含んでいます。感染時の生存転帰と細菌クリアランスの両方が一緒に感染に対する抵抗性と寛容の指標である。許容範囲は、感染による被害を制限し、それによりシステム5内病原体の高レベルにもかかわらず、生き残るためには、ホストの能力と定義されていて抵抗が、感染をクリアするには、ハエの能力を指します。感染中のNFκB活性のリアルタイム監視は、感染時に生存の分子機構への洞察を提供します。これらの簡単なアッセイにおけるショウジョウバエの使用は睡眠の遺伝学的および分子生物学的解析を容易にと免疫応答とどのようにこれらの2複雑なシステムが相互に影響を受けています。
Protocol
このプロトコルは、細菌感染にさらさハエから収集された四つの異なる読み出しを取得する2つの設定（ 図1）を使用しています。 2）生存転帰;、3）その場で細菌負荷、4）in vivoにおける NFκBのレポーター活性のリアルタイム測定、これらの出力）はスリープ/スリープ解除の動作を1が含まれています。 ショウジョウバエで利用可能な遺伝学的ツールとの組み合わせでは、これらの測定は、免疫機能と動作の間の分子リンクに機械論的な洞察を提供します。
1。ハエの自発運動と睡眠を測定
- ショウジョウバエの活動モニタリングシステム（DAM2、Trikinetics）、インキュベーター、暗い部屋、実験動物および活動チューブの調製を含むハエの自発運動と睡眠を測定するために使用する設定は、6以前に記載されている。同じアプローチはいくつかのマイナーな修正を加えて、ここで使用されます。
- 活動チューブを脱イオン水でホットプレート上で沸騰することで再利用するために掃除されています。少量の洗剤第一沸騰のために追加され、試験管をよくすすぎ、さらに2回煮沸する。糸がチューブを接続するときに使用している場合、使用される活性チューブ（食品、ワックス、ハエや糸を含む）は、糸の前に除去することなく洗浄することができます。
- 事前の実験を開始し、後半蛹を含む場所培養は実験的な照明などの環境条件に適応するために3〜4日間インキュベーターでハエを上演した。ライト：暗い場所や、一定の条件は、一般的に睡眠行動を測定するために使用されてきた。この例では、ハエは免疫応答や行動2,7,8で体内時計の影響を排除するために一定の光に順応する。 図1Aに記載されているように6を用いて説明し、3日間以上のレコード監視します。
2。細菌の病原性株とハエに感染
- ここで説明されたプロトコルは、S.に対して特異的である成長し、維持するのは簡単ですマルセッセンス 、。他の細菌種に対する長期保管および培養条件のためのプロトコルが異なります。S.マルセッセンスを -80℃で15から50パーセントのグリセリンに格納されています1.5 mlのマイクロチューブにオートクレーブし、50％グリセロールの1ボリュームに-長期保存のために準備するために、一晩細菌培養の2倍量（1.0 OD 600 = 0.5）を混ぜます。これは17％の最終グリセロール濃度になります。 -80℃でチューブ℃で保存細菌のソース用に短期を準備するために、無菌200μlのピペットチップで凍結ストックをこすりとLB寒天プレート上で三方連勝を行う。 37＆dで一晩静置し例えば、C分離したコロニーを取得する。 4℃でプレートを保存する
スケジュールされた感染前のある日、5 mlのLB培地を含む培養チューブに無菌200μlのピペットチップと水没先端を含むLB寒天プレートからシングルコロニーを拾う。それが指数増殖期に達するまで細菌の一晩、または37℃、250rpmでインキュベーターシェーカー内部まで16時間を栽培しています。 OD 600における分光光度計を用いて濃度を測定する。この段階での濃度は0.5〜1の範囲である。濃度が高すぎると、菌を継代培養し、最適な濃度を得るために別のいくつかの時間のために成長します。炎源の近くに手順を実行します。いくつかの細菌株は抗生物質耐性用に設計され、成長し、適切な抗生物質のために選択されている培地に添加する。S.はマルセッセンス （ATCC＃8100）は、抗生物質耐性ではないので、抗生物質なしで無菌培地で栽培されています。滅菌技術を検証するために、モックcultuを行うコントロールとして細菌ずに再。
ハエに感染するソリューションは、細菌（= 0.1 OD 600に希釈したもの）と、PBS中の1％の食品着色料（ブリリアントブルーFCF）が含まれています。感染溶液及びPBS中1％青い食品着色料で使用されてLB培地と同等の量を追加することで、噴射制御のためのソリューションを用意してください。氷の上でソリューションを格納します。 - ハエを注入するためのガラス針を準備します。マイクロピペットプラー（ナリシゲ）を使用して細かい先端にガラスキャピラリーを（OD = 1ミリメートルは、id = 0.58ミリメートル、WPI）引き出します。解剖顕微鏡下では、開口部が注射器で吸引して適用することによって、注射液で埋めるのに十分な大きさであるように、針の先端を断つために細かい鉗子を使用していますが、注入プロセスの間にフライへのダメージを最小限に抑えるのに十分に小さい。先端を破った後に、チップサイズは40〜50μm程度である必要があります。ガラス針は、チューブの長さと3ccのプラスチックシリンジに接続されています。注射媒体の流れを正圧またはs適用手動で制御されるシリンジではじめ。注射器装置は感染および制御注射の両方に使用されているように、注射液とゴム管を汚染しないようにします。
- CO 2のパッドの上にそれらを置くことによって、ハエを麻酔。 CO 2はパッドを加湿するとパッドの上にハエの操作が複雑になる可能性があり、静電気を低減するために、水の密閉容器を介して渡されます。背側胸部の胚盤の上の領域にガラス針をつつくことでハエを注入します。フライへの注射媒体の受け渡しは食品着色料によって検証されます - ハエは、システムを介して食品着色料の普及に青に変わります。第3節で説明したようにハエが受け取る細菌の投与量は、下記に定量することができる。いくつかの実験的なデザインは、PBSおよび食品着色料ではなく細菌なしでハエを注入することにより無菌傷害を受け取るコントロールの基が挙げられる。
3。細菌負荷を決定する
evaluatinする一つのアプローチグラム細菌感染に対する免疫応答は、細菌負荷の感染後を決定することである。D.ショウジョウバエは、全体のフライは、個々の内総細菌数を推定するために均質化することができるので、このパラメータを決定するのに最適なモデルです。このプロトコルの背後にある理論的根拠は、ルリア培地（LB）をシャーレに寒天培地（LBプレート）などの固体培地上で増殖させたときに、単一の細菌が目に見える区別コロニーを形成しているということです。したがって、ホモジネートの連続希釈液を生成し、LBプレート上に希釈したホモジネートを広め、LB液体培地で感染したハエを均質化することにより、その場に感染する細菌細胞の数を決定することができる。 PBSおよび食品着色料ではなく細菌なし注入ハエの対照群は、感染が他の細菌種で汚染されていないことを確認するために使用されるべきである。この状態でLB寒天プレート上にコロニーがあってはならない。
- このために使用されるすべての材料をオートクレーブ実際の均質化ステップを実行する前に手順。これは、均質化のために使用はさみ、LB培地、および乳棒で切断200μlのピペットチップが含まれています。ハエを均質化する前に、少なくとも1日10センチメートル滅菌シャーレにオートクレーブしたLB /寒天培地を注ぐことによってプレートを準備します。
- 麻酔して、氷上に1.5 mlのマイクロチューブや店舗チューブにハエを集める。
- 汚染を防ぐために、火気の近くで均質化を行う。例えばS.として菌株を使用する場合は特に感染せずにハエを含む制御均質化することをお勧めします抗生物質耐性はありませんマルセッセンス 、。 10ハエ当たり各実験条件の2つのグループの最小値をホモジナイズする。ホモジネートごとに使用されるハエの数は実験によって決定されます。他はホモジネート当たり3月10日ハエから使用している間、いくつかのグループは、個々のハエ8の間の細菌負荷の変動を評価するために有用である、ホモジネートごとに1つのフライを使用していた9月12日遺伝子型又は実験条件間で比較します。
- ハエを含む各マイクロチューブに400μlのLB培地を追加し、小型モーターおよび乳棒（Kontes）を使用して均一化する。
- 滅菌カットピペットチップを使用して、シリアルは180μlのLB培地を含む1.5μlの微量遠心チューブに20μlの均質化されたLB /細菌の培地を加えてホモジネート1:10に希釈します。カッティングピペットチップは、フライ破片から閉塞を防止し、適切なボリュームが転送されていることを保証します。
- 希釈倍率は、経験的に決定し、ハエの遺伝子型は、使用した細菌株、実験条件に依存しています。 Sで感染した野生型ハエ用マルセッセンスは 、感染後直ちにホモジナイズハエのために1時10分2または1:10 3の希釈液を使用し、ハエのために1時10分4または1:10 5の希釈は、24時間後の感染を均質化した。
- マイクからの100μlのLB /細菌の培地を追加最終希釈を含むチューブをrocentrifugeと均等な分配を確保するためのガラス玉（VWR）を使用してLBプレートに培地を広げた。
- 100％EtOHを溶液中にガラス球を捨ててください。一晩37℃のインキュベーター中でLBプレートを置きます。
- オプションの手順として、LBプレート（;アルファイノテックFluorChem 8900）の画像を得るために可視光での撮像システムを使用しています。プレート自体に、またはPhotoshopソフトウェア（Adobe PhotoshopのCS3）でカウントツールを使用してプレートの画像のいずれかからのコロニー数をカウントします。
- 式を使ってフライあたりのコロニー形成単位数を計算します[N /（N * D * V）] * V、どこLBプレート上に生育したコロニーの数N = N = 1にプールハエの数微量遠心チューブ、D =希釈係数であり、v各プレート上に広げソリューションの=体積、Vホモジネート=初期体積。
4。感染後スリープと生存期間を評価
- のために細菌負荷を測定するために収穫されていないハエは、別の7から10日間の行動を監視し続ける。生存期間は、ハエの遺伝子型は、環境条件、および感染に使用細菌種によって影響される。
- 〜10日後に、実験を終了し、以前にダウンロードし6に記載されているように行動データを処理します。 Matlabで基づいているInsomniac2カスタムソフトウェアは、睡眠パラメータを分析するために使用されています。行動分析から死んだハエを排除することが重要です。通常、これは感染症やハエ遺伝子型の種類に応じて、感染後最初の日内に分析を制限します。アッセイにおける死はすべての活動カウントがゼロに達した時点で示されます。生存率の分析を容易にするために、Drosonexは、Microsoft Visual Basicで記述されたカスタムソフトウェアはC + + 6.0、TrikineticsのDAMシステムからの生データファイルを処理するために使用されます。 Excelファイル、各ハエの生存期間（時間単位）などのソフトウェアレポートは、アクティビティのdatをコンパイルすべてのモニタから単一のスプレッドシートに変換し、％はユーザによって設定され、時間の経過存続飛んで報告します。 Excelファイルは、さらなる分析のために他の統計ソフトウェアパッケージに統合できるように設計されています。
5。ルシフェラーゼレポーターアッセイを用いて感染中NFκBの活性を測定する
クオらで説明したように、このアッセイで用いられるトランスジェニックκB-Lucのハエは、以前に生成されていました。、2010 2。簡単に言えば、κB-LUCレポーターは、ルシフェラーゼオープンリーディングフレームの上流プロモーターを挿入したNFκB結合配列の8反復を含む。
- セクション1.2に記載されている実験の照明条件にハエを調整します。この例では、1から4日齢κB-lucのハエは感染時に他のハエと同じ年齢に到達するために2日間、5％スクロースを含むバイアル内に収容された2％寒天食品媒体と定常光（LL）に配置されます。
- ハエ用の96ウェルマイクロプレートを準備します。各ウェルは、食品中の2つの層（ 図2）が含まれている 、トップ層は、ルシフェリン、ルシフェラーゼの基質を含んでいます。 5％スクロース、各ウェルに2％寒天溶液300μlを加え、凝固させる。次に、各ウェルを含む5％スクロース、1％寒天、および2 mMルシフェリン（ゴールドバイオテクノロジー、株式会社）に50μlのトップ層を追加します。 ショウジョウバエにおけるレポーター活性を測定するために使用されるルシフェリン濃度は文献に変化している、及び100μM13限り低くなっている。必要な濃度は、経験的に決定することができます。食品層を分配する間、無菌性を維持しながら、乾燥を促進するために細かいメッシュの布でカバープレート。プレートは凝縮液滴中に立ち往生からハエを防ぐために、最長1時間、徹底的に乾燥させなければならない。ルシフェリンは、光に敏感であるため、必要以上に光にプレートをさらすことは避けてください。
- 明確な接着フィルム（トップを適用96ウェルマイクロプレートにパーキンエルマー）とウェルあたり2つの穴の量で細い針を使用して穿孔し、シール - 。これらの穴は、各ウェルに空気の交換を許可していませんが、また個別にハエを麻酔する方法を提供します。鋭い刃とストレートエッジを使用して、各列の間のカットを紹介します。これは、一度に8つのグループでハエをロード/アンロードするための簡単な方法を提供します。
マイクロウェルプレートにハエをロードするには、CO 2のパッドの上にインキュベーターと麻酔ハエからバイアルを取り外します。負荷が列ごとに各ウェルに一つずつ飛ぶ。彼らは頻繁に介入することなく、自分自身を解放することができるように接着シールにはまりうっかり飛ぶべきで、単独でフライにしておきます。 8から24時間、新しい環境に適応するとルシフェリン基質を消費するためにLLのインキュベーターにマイクロウェルプレートを返します。 - 培養菌、S.マルセッセンス 、前述のように感染の溶液を調製します。
- Anaesthetizeトン彼は低気圧のCO 2回線に接続されているマイクロピペットチップを使用することによって飛ぶ。直接各ウェルのために作られた通気孔の上にマイクロピペットチップを置きます。 CO 2の圧力がフライをanaesthetizeに十分高いが、フライへの損傷を防ぐのに十分な低さであることを保証するために十分に注意ください。 8つのグループで、個別にCO 2のパッドにそれぞれのフライを転送し、上記のように感染します。感染後、その元々のウェルに各フライ返し、マイクロプレートを封印してください。
- メジャー発光（トップカウント-NXTの発光とシンチレーションカウンター、パーキンエルマー社）。トップカウントルミネッセンスカウンターは時間の任意の長さ（通常は最大5日間）のための所望の刻みで連続してプログラムされ、自動化された測定値を可能にするプレートの積み重ねカセットを含む。この機能は、すべての楽器に使用できず、他の楽器を用いて行った実験のデータ収集は、したがって、それほど頻繁かもしれません。ルミネッセンスカウンターがRO内に収容されている制御された温度と照明のスケジュールとオム。スタッキングカセットにプレートをロードするときに、ハエが光を受けることを確保するための明確なブランクプレート間のハエを含むプレートを積み重ねる。測定値を24 hrの最小毎時間を収集するために、製造業者の仕様に従ってプログラムルミノ。この例では、検出器が10秒間、各ウェルを読み取り、秒当たりのカウント数（任意の単位）として結果を表現するためにプログラムされています。この値は、ウェル当たり3の測定値を平均しています。スプレッドシートへのデータファイルをエクスポートし、標準的な分析を行い、発光の結果をグラフ化する。
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Representative Results
- 感染症は、睡眠を促進する。前述したように、この例では、NFκBの遺伝子、 レリッシュ（REL E20）14を欠くカントン-S（CS）は、野生型ハエや変異ハエは2 DAM2アクティビティモニター（各遺伝子型についてn = 32）にロードされ、感染していた。ハエが動作し、感染2,7,8で概日時計の影響を排除するために一定の光の中で維持した。 DDBJリリースE20の変異体は、以前に説明した11 CSにisogenizedた。ハエの両方のセットは、S.に感染していたマルセッセンスその結果は図3に示されている。いくつかのケースでは、追加の扱わ対照群では感染2の効果から処理の効果を差別化するのに便利です。扱わ対照群は、同じ時間の持続期間のためのインキュベーターや麻酔からの除去が含まれていますが、彼らは注射を受けていない感染群と同じ環境の変化にさらされている。ただし、この例では 、rel E20変異体はCS制御感染（ 図3A）の後に飛ぶより少ない睡眠を経験することは明らかである。以前に6説明したように、ダムアッセイから測定することができる他の行動のパラメータがあります。これらは、単位時間当たりの総活動数（ 図3B）を含むことができる。この例では、睡眠のその感染ミラー後の活性の変化。我々はまた、活動率、または覚醒分当たりの活動回数（ 図3C）を報告する。このパラメータは、ハエの運動能力の指標の一つである。この場合、覚醒アクティビティレートは、アクティビティや睡眠の増加でその減少が減少歩行能力の結果ではないことが示唆さ感染、遺伝子型の間のいずれかに変更されることはありません。
- 図4Aは、感染後の生存率を示しています。内に従来の知見と一致して14,15、REL E20変異急速に屈する野生型のハエに比べてクション。ほとんどの感染症にしない注射によるケガに屈して飛ぶことを示す、無菌制御インジェクション（ 図4B）を生き残ったハエ。 レリッシュ突然変異体は唯一のCSハエが感染（ 図5）の後に細菌負荷を実証するために使用されていたので、迅速に死亡したため、 図5に示すように、S.マルセッセンスは感染後ハエ24時間で増殖し続けています。
- ルシフェラーゼレポーター活性は、4つの個別のハエ（ 図6）アッセイにおける時間の向こう側に描かれている。データ点と個々のハエとの間に大きな変化は井戸の内部を動き回るハエに起因することができます。信号はフライ内のすべての組織に由来しているが、それはすべての組織は、信号の同じ量を放出すると、検出器に対する組織の可視性は、フライの移動に応じて変化するであろうことが予想されていません。この例では、ハエは感染と比較した扱わ対照群と。死んだハエは図7Aに示すように、ハエのグループ全体の分析から除外した。死んだはえは、目視検査によって決定されます。これらのハエでは、ルシフェラーゼ信号の急激な減少と同様、信号変化の減少は、ハエが動いていないことを示してあります。κB-LUCレポーター活動は着実に感染（ 図7A）、無菌損傷後上昇する（ 図7Bは、 ）。レポーター活性の12時間後の傷害および感染後の周りのピーク。ハエの遺伝的および/ または行動の両方の操作は、感染時にκB-LUCレポーター活性を修飾するために期待されています。例えば、私たちは、以前にこのκB-LUCレポーターはNFκBに固有であることを示す、REL E20の変異体では感染時κB-LUCレポーター活性の誘導が大きく減衰したことを2に記載。
図1。 ショウジョウバエの免疫応答を測定する主な手順の概要を示したフローチャート （A）は、一連の手順は、感染時に睡眠、生存、および細菌負荷を測定するために概説されている、（B）工程の順序はNFκB依存性測定のために概説されている感染中のルシフェラーゼレポーター活性。実験では、使用される細菌種の致死性に応じて、1-5日からどこでも続けることができます。
図2。よく、個々のマイクロプレートの模式図。ハエは、不透明で培地を含む96ウェルプレートを配置し、図のようにカバーされています。ハエが個別に感染して処理されますので、それは重要なtである合理的に実験的な状況に応じて、所定の期間内に管理することができる額にプレートあたりのハエの数を制限するO。
図3。 S.に感染ハエの行動応答マルセッセンス （A） ±過ごし寝て飛ぶのSEMパーセントの時間を意味し、（B）の平均値±SEM総活性カウントはSと感染前後で1日4時間単位でプロットされているマルセッセンス 。 （C）の平均値±起きている毎分SEMの活動カウントを前に（BL =ベースライン）とS.感染後マルセッセンスを 8時間単位でプロットされます。行動は、少なくとも24時間感染後の生存が、野生型のCSハエに対して報告されており、免疫不全DDBJリリースE20用股関節を飛ぶさtは少なくとも8時間後に感染を生き残った。 CS用および Rel E20はn = 13。 ** = p <0.01および* = p <0.05、スチューデントの t -検定。
図4。感染と感染していないハエの生存転帰（A）代表Kaplan-Meier生存曲線はSで感染した野生型CSおよび免疫不全DDBJリリースE20ハエの両方に対してプロットされているマルセッセンス 。 P = 8.13x 10 -13は 、順位検定をログに記録します。 DDBJリリースE20のハエのCSと、n = 32でn = 31。 （B）の代表Kaplan-Meier生存曲線は、細菌を含まない液体培地で無菌注射により傷害を受けたハエを除いて、（）のように報告されています。ほぼすべてのハエは、実験の終了（60時間後に負傷）まで無菌傷害を生き延びた。 P> 0.97、ログRANK試験、CS および Rel E20のハエについてn = 32である。
図5。 S.に感染ハエの細菌負荷の定量化マルセッセンス 。CSからの（A）の代表細菌培養は、S.に感染して飛ぶ感染直後に収穫したマルセッセンス （左パネル）、または感染後24時間（右パネル）。希釈倍率は、各図の下に示されている。この例では、10ハエは、グループごとに400μlの溶液中でホモジナイズした。最終希釈液100μlを各プレート上に広げた。左側のプレートは29コロニー形成単位（CFU）が含まれています。 [10ハエ* 0.001（希釈倍率）* 100μL（プレート上にボリュームスプレッド）] 29に等しく、その後400μlの初期体積= 11600を掛けた29 CFUを分割、CFU /フライを計算することができます。この特定の板のために、私たちは1.16×10 4個の平均を持っているCFU /フライ。右のプレートは257コロニーを含んでいます。同じ式を使用して、我々は1.03×10 6 CFU /ハエの平均を求める。図のように（B）の各実験条件で各プレートからCFU /フライを計算した後、箱ひげプロットを生成する。この例では、第25回、第50回（中央値）と75パーセンタイルは、底部、中部、ボックスの上部に表示されている。エラーバーは3つの独立した実験の標準偏差を表す。 **はp <0.01、Student-t検定。
図6。 Sで感染した個体のハエにおけるNFκB依存性ルシフェラーゼレポーター活性。、感染したハエ（右パネル）; マルセッセンス生データの代表例としては、個々の非感染ハエ（左パネルに処理制御）のために示されている。ベースラインの読み（時間'0 '）は直ちに感染や取り扱いの前に収集された、他のすべてのハエが治療を受けた後、時間ポイントが集められた。感染および処理制御条件におけるハエの間にy軸のスケールの違いに注意してください。各フライ内の信号の大きな変動をマイクロウェル内部にハエの動きに起因することがあります。
図7。 Sと感染無菌の注射でマルセッセンスやけがは、生きているハエにκB-LUCレポーター活性を増大させる。±SEMでルシフェラーゼ活性（任意の単位）が感染していたすべてのハエを越え毎4時間をプロットした（）または無菌の注射（B）により負傷し、アップ生き残っていることを意味アッセイで24〜。反復測定一元配置ANOVAは、レポーター活性（INJ、p <0.01）で負傷した（p <0.05）に感染して有意に増加したことが示されており、彼らの扱う詐欺制御（HC、P <0.01）、そのベースラインを基準にしてグループ（タイム'0 '; Tukeyの事後）。 （挿入、パネル）：HCグループからのデータは、異なるスケールでプロットされています。 HC群でレポーター活性の小さいが有意な増加がハエが処理（へとマイクロウェルプレートと麻酔と同等から感染ハエへの転送）から軽度のストレスまたは増加覚醒を経験していることを示唆している。両方に感染したと負傷者のグループが示された時点で、HC群に比べ有意に高かったκB-lucのレポーター活性の強い帰納法を示した* = P <0.05、** = p <0の0.01;スチューデントの t -テスト、（）は、n = 20、HCおよびn = 13感染症については、（B）は、n = 15、HCおよびn = 14怪我のために。
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Discussion
このプロトコルは、どのような動作を調査するためのアプローチを概説し、特に睡眠、免疫応答パラメータにリンクされています。これらのパラメータは、in vivoでのルシフェラーゼレポーターによって測定された細菌負荷、生存転帰、およびNFκB活性が挙げられる。一緒に、これらのパラメータは、ハエは感染と闘うことができるどれだけの情報を提供します。細菌負荷と生存転帰は、 ショウジョウバエの直接的な測定を伴う免疫応答パラメータです。屈する急速に細菌感染に対する免疫応答の中心であるNFκBの転写因子を欠くDDBJリリースE20変異体は、。行動の遺伝的または他の操作もおそらくNFκBの活動自体に影響を与えることによって、これらの免疫応答パラメータに影響を与えるかもしれない。たとえば、 レリッシュmRNAの感染が増加する式に先立っ剥奪をスリープ状態、およびCFUを低減/非奪わコントロール11に対して飛ぶ。ムタン時計遺伝子のTS、 期間 7と8は 時代を超越した 、また、感染症だけでなく、細菌クリアランス8時の生存率を減少させることが報告されています。このアプローチを使用し、さらに研究が行動が免疫機能に影響を及ぼすかもしれないどのように機構的な洞察を提供することが期待される。
私たちがここで説明する注入/感染手順はWu ら 16で前述した方法から変更されます。この手順は、単純で安価である。しかし、欠点はその指標として染料を用いた注入量の手動制御は原油であり、ばらつきに寄与することです。他のグループは一定注入量17を有効にするマイクロインジェクターを使用している、または細菌培養18に浸し針でハエを刺されました。それにもかかわらず、ここで紹介する方法は、実験条件11,19にわたる細菌クリアランスの変化を検出することに成功している</>（商標）。
感染中のハエの生存率は、通常、定期的に一定間隔で残りのハエを計数することによって定量化される。ここでは、活動の停止により示されている個々のハエに死の時間を監視するTrikineticsのDAMシステムを使用しています。私たちは、自発運動によって決定された生存転帰が感染（未発表）の間活動チューブでハエの目視検査によって決定されたものと同じであることを確認しました。また、この方法は、寿命20,21を測定するために以前に使用されてきました。しかし、DAMシステムで生存のその評価に注意することが重要です孤立ハエのものに限定されており、この状態から派生したその結果がグループ化された条件とは異なることが予想される。初期の研究では、ホストが隔離された条件は22対のグループに置かれている生存率の違いを示している。最近の研究はまた、ハエのグループの寿命が長くなることを確認しています20隔離されたハエに比べて。
ルシフェラーゼレポーター活性は、リビングハエにおける時計遺伝子の発現（たとえば、ref 23）の分析のために以前に使用されてきました。これらのケースでは、他の技術的な考慮事項は特に、アッセイを実行する数日間にわたって行われるルシフェリン基質の枯渇が必要である。これとは対照的に、ここに記載されるアッセイは、感染したハエの生存に限定されており、感染後24時間かけて簡単な測定を含んだ。反復測定ANOVAは、各グループ内のベースラインからの変化を評価するのに十分であった。基質の枯渇のために修正するために正規化手順に沿って、ルシフェラーゼレポーターの概日振動を解析するための統計的アプローチは完全に別の場所で24議論されている。いずれの場合においても、個々のハエのリアルタイムレポーター活性を測定することは、安定よりも、その時間的ダイナミクスに関する情報を抽出するためのより効率的な方法であるndard生化学的および免疫組織化学的アッセイ。
しかし、in vivo におけるルシフェラーゼレポーター活性を監視することに潜在的な欠点は、ルシフェリン基質を食べるハエに依存していることです。拒食症は、ハエの感染と関連しており、摂食はまた、感染の種類によって、または遺伝子型25の間で異なる場合があります。基板の摂取の懸念を回避するために、ハエは感染後、別の身体部分または組織に切開することができ、以前に説明したように26レポーター活性は、培養で測定することができます。あるいは、ルシフェラーゼアッセイからの結果はまた、給餌に依存しない標準的なアッセイを用いて検証することができます。例えば、定量PCRは、抗菌ペプチド（AMP）のmRNAの発現レベルを測定するために一般的に使用されたアプローチとなっています。アンプは、NFκBの既知のターゲットであり、したがって、活動のレベルを示しています。
代表ダットNFκBは、免疫の挑戦と睡眠2のその後の増加に伴って上昇することを示した以前の研究を要約ここで説明する。しかしながら、読者はTrikineticsのDAMシステムでその睡眠は5つの連続した27分の最小非アクティブで示されていると警告されます。ビデオ撮影によってオンザフライで睡眠の測定はまた、非アクティブ28に依存しています。それはまた、免疫挑戦動物は29寝たまま長時間非アクティブになることが知られているので、ハエのこのスリープの定義は、潜在的に感染の間に問題が多いかもしれません。この問題を克服するために、感覚応答性を測定することアッセイはそのハエは本当に眠っているかどうかを確認するために必要である。調べでは、木の棒31と活動チューブをブラッシング、またはチューブ27の一端を加熱し、そのような鉛筆タップ30などの感覚刺激にハエの応答性を決定した。すべてのケースで、眠っているハエは少なく応答性（測定いずれかの応答待ち時間によってまたはパーセントで目を覚ましハエより）グループとして応答飛ぶ。我々は眠っている感染したハエは、最大6〜8時間、感染後（定理クオとJAウィリアムズ、未発表データ）への感覚刺激に対する確かに少ない応答性であることを発見した。技術的な制限があるにもかかわらず、TrikineticsのDAMシステムは、睡眠と免疫機能との間の遺伝子や分子のリンクを探索するハエの将来の研究のために有用であろう、高スループットの利点を提供する。
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Disclosures
特別な利害関係は宣言されません。
Acknowledgments
この作品は、顎に助成＃1R21NS078582-01の下に交付金＃IOS-1025627の下で国立科学財団によってと米国立衛生研究所によってサポートされていました
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Incubators | Percival Scientific, Inc. | I30BLLC8 I36VLC8 |
Any incubator capable of running programmed light/temperature schedules is appropriate. |
| Drosophila Activitiy Monitors | Trikinetics Inc., Waltham, MA | DAM2 | As described elsewhere6, this system requires a computer interface, software, and other accessories. |
| Pyrex Glass Tubes | Trikinetics Inc., Waltham, MA | PGT-5x65 | |
| Microplate scintillation and luminescence counter | Perkin Elmer | TopCount NXT 12 detector |
Any microplate reader capable of detecting luminescence can be used for this type of reporter assay. TopCount contains multiple detectors and an automated stacker; it is capable of being programmed to read continuously from multiple plates. |
| FluorChem 8900 | Alpha Innotech | Imaging of bacterial cultures is optional; any digital imaging system with visual light capability is sufficient. | |
| Micropipette Puller | Tritech Research, Inc. | Narishige PC-10 | |
| Supplies | |||
| Borosilicate Glass Capillaries | World Precision Instrument Inc. | 1B100F-4 | |
| 3 ml Syringe | Fisher Scientific | BD 305482 | |
| Syringe Needles | Fisher Scientific | BD 305196 | 18 G - cut off the tip of the needle to prevent damage to the tubing. |
| Silicone Tubing, i.d. (0.030") o.d. (0.065") Wall Thickness (0.018") | VWR | 60985-706 | Used for attaching glass capillary needles to a syringe |
| 3 Way Stopcock | American Pharmaseal Company | K75 | |
| Kontes Pellet Pestle Cordless Motor | Fisher Scientific | K749540-0000 | |
| Kontes Pellet Pestle | Fisher Scientific | K749521-1590 | |
| Glass balls 3mm | VWR | 26396-630 | |
| Microplate Microlite 1+ | Thermo Scientific | 7571 | Select 96-well plates that are appropriate for luminescence - they must be opaque. |
| TopSeal-A:96-well Microplates | PerkinElmer | 6005185 | Microplate Press-On Adhesive Sealing Film |
| D-Luciferin, Potassium Salt | Gold BioTechnology, Inc. | LUCNA | |
| Software | |||
| Insomniac2 | Available upon request to the authors | custom; written by Lesley Ashmore, Ph.D. (Westminster College) | Matlab based software that has been used routinely for analysis of sleep2,6,11 |
| Drosonex | Available upon request to the authors | custom; written by Thomas Coradetti (Sidewalk Software) | A PC MSVC6 program used for survival analysis from raw data files collected with the Trikinetics system |
| Photoshop CS3 | Adobe | Useful for obtaining numbers of cfu/plate from digital images (optional) | |
References
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