Summary
Om een verband tussen de immuunrespons en gedrag te begrijpen, beschrijven we een methode om locomotorisch gedrag te meten in
Abstract
Een complexe interactie tussen de immuunrespons en ontvangende gedrag is beschreven in diverse soorten. Overmaat slaap, in het bijzonder kan optreden als reactie op infectie bij zoogdieren 1 en is onlangs ook beschreven in Drosophila melanogaster 2. Het is algemeen aanvaard dat de slaap gunstig voor de gastheer tijdens een infectie en dat het belangrijk is voor het behoud van een robuust immuunsysteem 3,4. Echter experimenteel bewijs dat deze hypothese ondersteunt beperkt 4 en de functie van overtollige slaap tijdens een immuunreactie blijft onduidelijk. We hebben gebruik gemaakt van een multidisciplinaire aanpak van dit complexe probleem aan te pakken, en hebben studies uitgevoerd in de eenvoudige genetische modelsysteem, de fruitvlieg Drosophila melanogaster. We maken gebruik van een standaard test voor het meten van locomotorisch gedrag en slapen in vliegen, en zien hoe deze test wordt gebruikt om gedrag in vliegen infecte metend met een pathogene bacteriestam. Deze bepaling is ook nuttig om de overlevingskans in individuele vliegen tijdens een infectie. Aanvullende maatregelen van het immuunsysteem omvatten het vermogen van vliegen een infectie en de activering van NFKB een belangrijke transcriptiefactor die centraal in de aangeboren immuunrespons in Drosophila wissen. Zowel uitkomst van overleving en bacteriële klaring tijdens infectie bij elkaar zijn indicatoren van resistentie en tolerantie voor infectie. Weerstand verwijst naar het vermogen van vliegen een infectie duidelijk, terwijl tolerantie wordt gedefinieerd als het vermogen van de gastheer om schade door een infectie dan beperken en overleven ondanks hoge pathogeen in het systeem 5. Real-time monitoring van NFKP activiteit tijdens infectie geeft inzicht in een moleculair mechanisme van overleven tijdens de infectie. Het gebruik van Drosophila in deze assays maakt het eenvoudige genetische en moleculaire analyses van slaapen de immuunrespons en hoe deze twee complexe systemen samengebouwd beïnvloed.
Protocol
Dit protocol gebruikt twee opstellingen (figuur 1) te verwerven vier verschillende uitlezingen vanuit vliegen aan een bacteriële infectie. Deze uitgangen zijn 1) slaap / waak gedrag; 2) uitkomst van overleving; 3) bacteriële belasting in de vlieg, en 4) real-time meting van NFKB reporter activiteit in vivo. In combinatie met de genetische technieken die beschikbaar zijn in Drosophila, deze metingen geven inzicht in de mechanistische moleculair verband tussen het immuunsysteem en gedrag.
1. Meet bewegingsactiviteit en Slaap in Flies
- De setup wordt gebruikt om bewegingsactiviteit te meten en in vliegen slapen, waaronder de Drosophila Activity Monitoring-systeem (DAM2, Trikinetics), incubators, donkere kamer, en de voorbereiding van proefdieren en activiteit buizen, is eerder 6 beschreven. Dezelfde aanpak wordt hier gebruikt, met enkele kleine wijzigingen.
- Activiteit buizen worden gereinigd voor hergebruik door koken op een hete plaat in gedeïoniseerd water. Een kleine hoeveelheid reinigingsmiddel wordt toegevoegd voor het eerst koken worden de buizen goed gespoeld en tweemaal gekookt. Als garen wordt toegepast om de buis steekt, kan gebruikt activiteit tubes (met voedsel, wax, vliegen en garen) worden gereinigd zonder voorafgaande verwijdering van het garen.
- Voorafgaand aan de behandeling van een experiment, plaats kweken die laat popstadium opgevoerd vliegen in incubators voor drie tot vier dagen aan te passen aan experimentele verlichting en andere omgevingsfactoren. Licht: donker of constante omstandigheden zijn vaak gebruikt om slaapgedrag meten. In dit voorbeeld worden gewend aan vliegen constant licht de invloed van de circadiane klok op de immuunrespons en het gedrag 2,7,8 elimineren. Zoals beschreven in figuur 1A 6 en record voor minimaal drie dagen voor de infectie.
2. Infect Vliegen met een pathogene stam van bacteriën
- De hier beschreven protocol specifiek is voor S. marcescens, die gemakkelijk te kweken en te onderhouden. Protocollen voor langdurige opslag en kweekomstandigheden voor andere bacteriële species variëren. S. marcescens opgeslagen in 15-50% glycerol bij -80 ° C. Ter voorbereiding langdurige opslag, 2 volumes overnacht bacteriecultuur (OD 600 = 0,5 - 1,0) te mengen om een volume van autoclaaf 50% glycerol in 1,5 ml microcentrifugebuizen. Dit resulteert in een uiteindelijke glycerolconcentratie van 17%. Bewaar buizen bij -80 ° C. Om een korte termijn voor te bereiden in-use bron van bacteriën, schraap de bevroren voorraad met een steriele 200 ul pipet tip en het uitvoeren van een drie-weg streak op een LB-agar plaat. 'S nachts Incubeer de plaat bij 37 & dbijvoorbeeld, C tot geïsoleerde kolonies te krijgen. Bewaar de plaat bij 4 ° C.
Een dag voor de geplande infectie, kies een enkele kolonie van de LB-agar plaat met een steriele 200 ul pipet en dompel de punt in een cultuur buis met 5 ml LB-medium. Bacteriën groeien nacht of tot 16 uur in een incubator shaker bij 37 ° C en 250 rpm tot in de exponentiële groeifase. Meten van de concentratie fotometrisch bij OD 600. De concentratie in deze fase varieert van 0,5 tot 1. Als de concentratie te hoog is, subcultuur de bacteriën groeien en nog enkele uren een optimale concentratie te krijgen. Voer de procedure uit in de buurt van een vlam bron. Sommige bacteriestammen zijn ontworpen voor antibioticaresistentie en worden gekweekt en geselecteerd op geschikte antibioticum aan het medium toegevoegd. S. marcescens (ATCC # 8100) niet antibiotica resistent en worden dus gekweekt in steriel medium zonder antibioticum. Om steriele techniek te controleren, doe een mock cultuopnieuw zonder bacteriën als controle.
De oplossing vliegen infecteren bacteriën bevat (verdund tot OD 600 = 0,1) en 1% kleurstof (Brilliant Blue FCF) in PBS. Bereid een oplossing voor injectie controle door toevoeging van een equivalente hoeveelheid LB medium gebruikt infectie oplossing en 1% blauwe kleurstof in PBS. Bewaar oplossingen op ijs. - Bereid glas naalden voor het injecteren van de vliegen. Trek glazen capillairen (OD = 1 mm, id = 0,58 mm, WPI) om een fijne punt met behulp van een micropipet trekker (Narishige). Onder een dissectiemicroscoop gebruikt fijne tang afbreken van de punt van de naald met de opening is groot genoeg om met injectievloeistof vullen door te zuigen met een spuit, maar klein genoeg om beschadiging van de vlieg tijdens de injectie te minimaliseren. Na het breken van de tip, moet de punt groot zijn ongeveer 40-50 micrometer. De glazen naald is bevestigd aan een 3 cc spuit met een plastic buisje. De stroom van injectiemedium wordt geregeld handmatig die positieve druk of sWanneer kunt met de spuit. Contaminatie van de rubber buis met injectievloeistof, de spuit inrichting zowel voor infectie en controle injecties.
- Verdoof vliegen door ze op een CO 2 pad. CO 2 wordt door een verzegelde container water aan de pad bevochtigen en om statische elektriciteit, die manipulatie van vliegen kan bemoeilijken het pad verminderen. Injecteer vliegen door rond te snuffelen het glas naald in het gebied boven de schildje van de dorsale thorax. Het doorgeven van injectie medium in de vlieg wordt gecontroleerd door de kleurstof - vliegen blauw als de kleurstof verspreidt zich via het systeem. De dosering van bacteriën die vliegen ontvangen kan worden gekwantificeerd zoals beschreven in paragraaf 3 hieronder. Sommige experimentele ontwerpen omvatten een controle groep die aseptische letsel ontvangt door het injecteren van vliegen met PBS en kleurstof, maar zonder bacteriën.
3. Bepaal de bacteriële verontreiniging
Een benadering om evaluating de immuunrespons tegen bacteriële infectie is het bepalen van de hoeveelheid bacteriën na infectie. D. melanogaster is een groot model om deze parameter te bepalen, omdat de hele vlieg kan worden gehomogeniseerd om de totale bacteriële aantallen te schatten binnen een individu. De rationale achter dit protocol is dat bij groei op een vast medium zoals Luria bouillon (LB) agar op een petrischaal (LB plaat), een bacterie zichtbaar onderscheiden kolonie vormt. Derhalve homogeniseren geïnfecteerde vliegen in vloeibaar LB medium, genereren seriële verdunningen van het homogenaat en verspreiden van de verdunde homogenaat op LB platen, kan het aantal bacteriële cellen infecteren van een vlieg worden bepaald. Een controlegroep van vliegen geïnjecteerd met PBS en kleurstof zonder bacteriën worden gebruikt om te controleren of de infectie niet verontreinigd met andere bacteriële species. Er mogen geen kolonies op de LB agar plaat in deze toestand.
- Autoclave alle materialen die worden gebruikt voor dezeprocedure voordat de eigenlijke homogenisatiestap. Dit omvat 200 ul pipetpunten geknipt met een schaar, LB media, en stampers voor het homogeniseren. Bereid platen door het gieten van geautoclaveerd LB / agarmedium in 10 cm steriel Petri schalen ten minste 1 dag voor het homogeniseren vliegen.
- Verdoven en verzamel vliegen in 1,5 ml microcentrifuge buizen en tubes slaan op ijs.
- Voer de homogenisering in de buurt van een vlam om besmetting te voorkomen. Een controle homogenisatie met vliegen zonder infectie wordt vooral aanbevolen bij gebruik van een bacteriële stam als S. marcescens, die geen antibioticaresistente. Meng minimaal 2 groepen van 10 elk vliegen per experimentele conditie. Het aantal vliegen gebruikt per homogenaat wordt bepaald door de experimentator. Sommige groepen hebben gebruikt een vlieg per homogenaat, wat handig is voor het evalueren van variatie in bacteriële verontreiniging tussen individuele vliegen 8, terwijl anderen hebben gebruikt 3-10 vliegen per homogenaatte vergelijken over genotype of experimentele conditie 9-12.
- Voeg 400 ul LB-medium aan elk microcentrifugebuis met vliegen en homogeniseren met behulp van een kleine motor en een stamper (Kontes).
- Met behulp van gesteriliseerde gesneden pipetpunten, seriële verdunnen het homogenaat 01:10 door toevoeging van 20 ul gehomogeniseerde LB / bacteriële medium tot 1,5 pl microcentrifugebuis met 180 ul LB-medium. Snijden pipetpunten voorkomt verstopping van vlieg vuil en zorgt ervoor dat een geschikt volume wordt overgedragen.
- Verdunningsfactor wordt empirisch bepaald en afhankelijk van het genotype van de vlieg, de gebruikte bacteriestam en experimentele conditie. Voor wild type vliegen geïnfecteerd met S. marcescens, gebruik verdunningen van 1:10 of 1:10 2 3 voor vliegen direct gehomogeniseerd na infectie en verdunningen van 1:10 of 1:10 4 5 voor vliegen gehomogeniseerd 24 uur na infectie.
- Voeg 100 pl LB / bacteriële medium van de microfoonrocentrifuge buizen die de uiteindelijke verdunning en verdeel het medium op een LB plaat met glasbolletjes (VWR) om een gelijkmatige verdeling te verzekeren.
- Gooi de glazen ballen in 100% EtOH oplossing. Plaats de LB platen in een 37 ° C incubator overnacht.
- Als optionele stap, een beeldvormend systeem met zichtbaar licht een beeld van de LB platen (Fluorchem 8900; Alpha Innotech) te verkrijgen. Tel het aantal kolonies hetzij op de plaat zelf of van het beeld van de plaat met het telapparaat gereedschap in Photoshop software (Adobe Photoshop CS3).
- Bereken het aantal kolonievormende eenheden per vlieg met de formule: [n / (N * D * v)] * V; waarbij n = aantal kolonies gegroeid op de LB plaat, N = het aantal vliegen samen in een microcentrifugebuis, D = verdunningsfactor en v = volume van de oplossing uitgespreid op elke plaat, V = volume van het homogenaat.
4. Evalueer Slaap en Survival Duur na infectie
- Voorvliegen die niet worden geoogst voor het meten van bacteriële verontreiniging, blijven volgen gedrag voor een ander 7-10 dagen. Survival duur wordt beïnvloed door het genotype van de vlieg, de omgevingsomstandigheden, en bacteriële soorten die voor infectie.
- Na ~ 10 dagen, te beëindigen van het experiment, downloaden en verwerken gedragsgegevens zoals eerder beschreven 6. Insomniac2 aangepaste software, dat gevestigd is in Matlab, wordt gebruikt om de slaap parameters te analyseren. Het is belangrijk om dode vliegen elimineren uit de gedragsanalyse. Normaal is beperkt analyses binnen de eerste dag na infectie, afhankelijk van het type infectie en fly genotype. Dood in de assay wordt aangegeven door de tijd telt alle activiteiten zijn verstreken. Om de analyse van de overleving te vergemakkelijken, Drosonex, software op maat geschreven in Microsoft Visual C + + 6.0, wordt gebruikt om ruwe data bestanden van het Trikinetics DAM-systeem te verwerken. De software rapportages als Excel-bestanden, overleven duur van elke vlieg (in uren), stelt de activiteit DATeen van alle monitoren in een spreadsheet, en rapporteert het percentage vliegt overgebleven na verloop van tijd zoals ingesteld door de gebruiker. De Excel bestanden zijn ontworpen om in andere statistische software-pakketten integreren voor verdere analyse.
5. Meet NFKP activiteit tijdens infectie met behulp van een luciferase reporter assay
Transgene KB-luc vliegen die in deze assay werden gegenereerd zoals eerder beschreven in Kuo et al.. 2010 2. Kortom, de KB-luc reporter bevat 8 herhalingen van NFKB binding sequentie die zijn ingevoegd in een promoter stroomopwaarts van een luciferase open reading frame.
- Stel vliegen naar experimentele lichtomstandigheden zoals beschreven in paragraaf 1.2. In dit voorbeeld worden 1-4 dagen oud KB-luc vliegen gehuisvest in flesjes met een 5% sucrose, 2% agar medium en voedsel in constant licht (LL) voor 2 dagen dezelfde leeftijd als andere vliegen tijdens infectie bereiken.
- Bereid een 96-well microplaat voor vliegen. Elk putje bevat 2 lagen voedsel medium (figuur 2), de bovenste laag bevat luciferine, het substraat van luciferase. Voeg 300 ul van een 5% sucrose, 2% agar aan elke well en laat stollen. Voeg daarna een 50 ul toplaag aan elk putje met 5% sucrose, 1% agar en 2 mM luciferin (Gold BioTechnology, Inc.) Luciferine concentraties gebruikt voor het meten reporter-activiteit in Drosophila hebben gevarieerd in de literatuur en zijn zo laag als 100 pM 13. De vereiste concentratie kan empirisch worden bepaald. Tussen toedienen voedsel lagen bedekken de plaat met een fijnmazige doek vergemakkelijken drogen met behoud van steriliteit. De plaat moet grondig drogen, tot een uur, om vliegen voorkomen vastlopen in condensdruppels. Omdat luciferine is lichtgevoelig, niet bloot te stellen platen om meer dan nodig branden.
- Breng een duidelijke zelfklevende film (Top-Seal-A, Perkin Elmer) een 96-well plaat en geperforeerde microwell met een fijne naald in een hoeveelheid van 2 gaten per well. Deze gaten zullen niet alleen toe luchtverversing aan elk putje, maar zal ook een manier om vliegen op individuele basis verdoven. Met behulp van een scherp mes en rechte rand, de invoering van een cut tussen elke kolom. Dit zal een eenvoudige manier te laden / lossen vliegen in groepen van 8 tegelijk.
Om vliegen te laden in de microwell plaat, neem dit aantal flacons uit de incubator en Anesthetize vliegen op een CO 2 pad. Load vliegt een voor een aan elk putje kolom per kolom. Indien een per ongeluk vliegen vast komen te zitten aan de lijm afdichting, laat de vlieg als ze zijn vaak in staat om zichzelf te bevrijden, zonder interventie. Zet de microwell plaat naar de incubator in LL 8 tot 24 uur aan te passen aan de nieuwe omgeving en aan de luciferine substraat consumeren. - Cultuur bacteriën, S. marcescens, en met een oplossing voor infectie zoals hierboven beschreven.
- Algemene Chirurgie tvliegt hij met behulp van een micropipet tip aan een lage druk CO 2 lijn. Plaats de micropipet tip direct boven de ventilatieopeningen die voor elk putje. Wees voorzichtig dat de CO 2 druk hoog genoeg om de fly verdoven, maar laag genoeg om letsel bij de vlieg. In groepen van acht, afzonderlijk breng elke fly een CO 2 pad, en infecteren zoals hierboven beschreven. Na infectie, elke vlieg en terug te keren naar zijn oorspronkelijke en verzegelt de microplaat.
- Meet luminescentie (TopCount-NXT Luminescentie en scintillatieteller, Perkin-Elmer). De TopCount luminescentie teller bevat een stapeling cassette voor platen, die het mogelijk maakt voor de geprogrammeerde en geautomatiseerde metingen continu op de gewenste stappen voor elke lengte van de tijd (meestal maximaal vijf dagen). Deze functie is niet beschikbaar op alle instrumenten, en het verzamelen van gegevens voor experimenten uitgevoerd met andere instrumenten kan dus minder frequent. De luminescentie teller is ondergebracht in een roOm met een gecontroleerde temperatuur en verlichting schema. Bij het laden van platen in de cassette stapelen, stapelen de platen met de vliegen tussen heldere lege platen om ervoor te zorgen dat vliegen licht te ontvangen. Programma luminometer volgens de specificaties te verzamelen metingen per uur ten minste 24 uur. In dit voorbeeld zijn de detectoren geprogrammeerd om goed te lezen 10 seconden en het resultaat als tellingen (arbitraire eenheden) per seconde drukken. Deze waarde is een gemiddelde over 3 metingen per putje. Exporteer de gegevens bestanden naar een spreadsheet en het uitvoeren van een standaard analyse, grafieken de resultaten van luminescentie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
- Infectie bevordert de nachtrust. In dit voorbeeld, Canton-S (CS) wildtype en mutant vliegen vliegen ontbreekt een NFKB gen, Relish (Rel E20) 14 werden geladen in twee DAM2 activiteitsmonitoren (n = 32 per genotype) en geïnfecteerd zoals hierboven beschreven. Vliegen werden in constant licht de invloed van de circadiane klok gedrag en 2,7,8 infectie elimineren. De Rel E20 mutanten werden isogenized op CS zoals hiervoor beschreven 11. Beide vliegen werden geïnfecteerd met S. marcescens en de resultaten worden weergegeven in Figuur 3. In sommige gevallen kan een aanvullende behandeling controlegroep is bruikbaar voor verschillende effecten van de behandeling van de gevolgen van infectie 2. Behandeld controlegroepen worden blootgesteld aan dezelfde veranderingen in het milieu als de geïnfecteerde groepen, die verwijdering van incubators en verdoving voor dezelfde tijdsduur omvat, maar ze niet ontvangen een injectie. In dit voorbeeld is het duidelijk dat Rel E20 mutanten minder slaap dan CS control vliegt na infectie (Figuur 3A) ervaren. Zoals eerder beschreven zes, er andere gedrag die kunnen worden gemeten vanaf de DAMS assay. Deze kunnen totale activiteit counts per tijdseenheid (Figuur 3B). In dit voorbeeld is de verandering in de activiteit na infectie spiegels slaap. We melden ook activiteitsgraad, of activiteit tellingen per minuut wakker (Figuur 3C). Deze parameter is een indicator van motorische vermogen in vliegen. In dit geval, moet wakker activiteit tarieven niet te wijzigen in genotype tijdens infectie, wat suggereert dat vermindering van de activiteit of toename van de slaap is niet het gevolg van verminderde motorische vaardigheid.
- Figuur 4A toont het overlevingspercentage na infectie. In overeenstemming met eerdere bevindingen 14,15, Rel E20 mutanten snel bezwijken voor de infection vergeleken met wild type vliegen. De meeste vliegen overleefde de aseptische control injectie (figuur 4B), wat aangeeft dat vliegen overleden aan de infectie en niet om de schade door de injectie. Omdat de Relish mutanten stierf zo snel werden alleen CS vliegen gebruikt om bacteriële lading na infectie (Figuur 5) te tonen. Figuur 5 toont dat S. marcescens blijft prolifereren in de vlieg 24 uur na infectie.
- Luciferase reporter-activiteit in de tijd is weergegeven in de assay in vier afzonderlijke vliegen (Figuur 6). Grote variatie tussen individuele datapunten en vliegen kan worden toegeschreven aan de vliegen rond in de putjes bewegen. Hoewel het signaal afgeleid uit alle weefsels in het vlieg, wordt niet verwacht dat elk weefsel zou dezelfde hoeveelheid signaal afgeven en de zichtbaarheid van het weefsel naar de detector zou variëren als fly beweegt. In dit voorbeeld werden vliegen besmet en vergelekenbehandeld met een controlegroep. Vliegen die stierven werden uitgesloten van de analyse over een groep vliegen getoond in figuur 7A. Dode vliegen worden bepaald door visuele inspectie. In de vliegen, er een scherpe daling van de luciferase-signaal, alsmede een afname in signaalverloop geven dat de vlieg stilstaat. KB-luc reporter activiteit gestaag toeneemt na infectie (Figuur 7A) en aseptische schade (Figuur 7B ). De reporter-activiteit pieken ongeveer 12 h na letsel en na infectie. Zowel genetische en / of gedragskenmerken manipulaties vliegen verwachting KB-luc reporteractiviteit wijzigen tijdens infectie. Zo hebben wij eerder beschreven 2 dat de inductie van KB-luc reporter activiteit in grote mate afgezwakt tijdens infectie in Rel E20 mutanten, waarin deze KB-luc reporter specifiek is NFKB.
Figuur 1. Stroomschema dat de belangrijkste stappen van het meten van de immuunrespons in Drosophila schetst (A) De reeks stappen is beschreven voor het meten van slaap, overleving en bacteriële verontreiniging tijdens een infectie. (B) De reeks stappen is beschreven voor het meten van NFKB-afhankelijke luciferase reporter-activiteit tijdens infectie. Experimenten kan overal verder met 1-5 dagen, afhankelijk van de letaliteit van gebruikte bacteriële species.
Figuur 2. Schema van een afzonderlijke microtiterplaat zijn. Vliegen worden in ondoorzichtige, 96 well platen bevattende medium en bedekt zijn. Omdat vliegen wordt individueel behandeld te worden besmet, is het belangrijk to beperken van het aantal vliegen per plaat tot een bedrag dat redelijkerwijs kan worden beheerd binnen een bepaalde periode, afhankelijk van de experimentele omstandigheden.
Figuur 3. Gedrag reactie vliegen besmet met S. marcescens. (A) Gemiddelde ± SEM percentage tijd doorgebracht met slapen en dat (B) Gemiddelde ± SEM vliegt totale activiteit tellingen worden weergegeven in 4 uur stappen 1 dag voor en na infectie met S. marcescens. (C) Gemiddelde ± SEM-activiteit tellingen per minuut wakker voordat (BL = baseline) en na infectie met S. marcescens wordt uitgezet in 8 uur stappen. Gedrag gerapporteerd voor wild-type CS vliegen die overleefden gedurende ten minste 24 uur na infectie en immuun-deficiënte Rel E20 vliegt that overleefden gedurende ten minste 8 uur na infectie. n = 13 voor CS en voor Rel E20. ** = P <0,01 en * = p <0,05, student t - test.
Figuur 4. Overlevingsresultaten van geïnfecteerde en niet-geïnfecteerde vliegen. (A) Representative Kaplan-Meier curves weergegeven voor zowel wild-type CS en immuun-deficiënte Rel E20 vliegen die werden geïnfecteerd met S. marcescens. p = 8.13x 10 -13, log rank test. n = 31 voor CS en n = 32 voor Rel E20 vliegen. (B) Representatieve Kaplan-Meier curves worden als in (A), behalve vliegen ontvangen aseptische verwondingen door injectie met vloeibare media zonder bacteriën. Bijna alle vliegen overleefden aseptische schade tot eind experimenten (60 uur na beschadiging). p> 0,97, log rank-test, n = 32 voor CS en Rel E20 vliegen.
Figuur 5. Kwantificering van bacteriële verontreiniging in vliegen besmet met S. marcescens. (A) Vertegenwoordiger bacteriecultuur van CS vliegen geïnfecteerd met S. marcescens die werden geoogst onmiddellijk na infectie (linker paneel) of 24 uur na infectie (rechter paneel). Verdunningsfactoren worden aangegeven onder elke figuur. In dit voorbeeld werden 10 vliegen gehomogeniseerd in 400 pl oplossing voor elke groep. 100 ul van de uiteindelijke verdunning werd uitgestreken op elke plaat. De linker plaat bevat 29 kolonievormende eenheden (kve). Om kve berekenen / vliegen, 29 kve delen door [10 vliegen * 0,001 (verdunningsfactor) * 100 ul (volume spread op plaat)], waarvan er 29 gelijk is aan, en dan vermenigvuldigen met het oorspronkelijke volume van 400 ul = 11.600. Voor deze plaat, we hebben een gemiddelde van 1,16 x 10 4kve / vliegen. De juiste plaat bevat 257 kolonies. Volgens dezelfde formule vinden we een gemiddelde van 1,03 x 10 6 cfu / fly. (B) Na het berekenen van kve / vlieg van elke plaat in elke experimentele conditie, het genereren van box-and-whiskerdiagrammen zoals afgebeeld. In dit voorbeeld zijn de 25e, 50e (mediaan) en 75 percentiel gepresenteerd als de onderste, middelste en bovenzijde van de doos. Foutbalken vertegenwoordigen standaarddeviatie over drie onafhankelijke experimenten. ** P <0,01 Studenten t-test.
Figuur 6. NFKP afhankelijke luciferase reporter-activiteit in individuele vliegen geïnfecteerd met S. . marcescens Representatieve voorbeelden van ruwe data worden weergegeven voor individuele geïnfecteerde vliegen (behandeld controle; linker panelen) en geïnfecteerde vliegen (rechter panelen). Een baseline lezen (tijd '0 ') werd verzameld onmiddellijk voor infectie of behandeling; alle anderetijdstippen werden verzameld na vliegen behandeld. Let op de verschillen in omvang in de y-assen van de vliegen in besmet en behandeld controlecondities. Grote variatie van het signaal in elk vlieg kan worden toegeschreven aan de beweging van het vlieg in de microwell.
Figuur 7. Infectie met S. marcescens of verwonding van aseptische injectie verhoogt KB-luc reporter activiteit in levende vliegen. gemiddelde ± SEM luciferase activiteit (willekeurige eenheden) per 4 uur uitgezet in alle vliegen die waren geïnfecteerd (A) of verwond door aseptische injectie (B) en overleefden 24 in de assay. One-way ANOVA met herhaalde metingen bleek dat reporter-activiteit sterk toegenomen geïnfecteerde (p <0,05), gewonden (inj; p <0,01), en hun con behandeldcontrole (HC, p <0,01) groepen uit de baseline (tijd '0 '; Tukey post-hoc). (Invoegen, paneel A): Data van de HC-groep worden uitgezet op een andere schaal. De kleine maar significante toename van de reporter-activiteit in de HC groep suggereert dat vliegen kan milde stress hebben ervaren of verhoogd waakzaamheid van het hanteren (transfer van en naar de microwell plaat en verdoving gelijk aan geïnfecteerde vliegen). Zowel de geïnfecteerde en gewonden vertoonden sterke inductie van KB-luc reporter activiteit die significant hoger is dan die in het HC groep aangegeven tijdstippen * = p <0 0,05; ** = p <0,01 0;. Student t - test; voor (A) n = 20 n = HC en 13 Infection, voor (B) n = 15 n = HC en 14 letsel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dit protocol beschrijft een aanpak om te onderzoeken hoe het gedrag, in het bijzonder slapen, is gekoppeld aan immuunrespons parameters. Deze parameters omvatten bacteriële belasting effect op overleving en NFKB zoals die met een luciferase reporter in vivo. Samen vormen deze parameters geven informatie over hoe goed een vlieg kan een infectie te bestrijden. Bacteriën en effect op overleving zijn immuunrespons parameters is een eenvoudige meting in Drosophila betrekken. Rel E20 mutanten die een transcriptiefactor NFKB die centraal staat de immuunrespons bezwijken snel een bacteriële infectie missen. Genetische of andere manipulaties van gedrag kan ook van invloed deze immuunrespons parameters, mogelijk door een effect NFKP activiteit zelf. Bijvoorbeeld voorafgaand aan slaaptekort infectie toe expressie van mRNA Relish en vermindert cfu / vliegen opzichte van niet verstoken controles 11. Mutants van de klok genen periode 7 en 8 tijdloos, zijn ook gerapporteerd te overleven tijdens een infectie en bacteriële klaring 8 verminderen. Verdere studies die deze aanpak gebruiken wordt verwacht dat mechanistisch inzicht te geven in hoe het gedrag kan het immuunsysteem beïnvloeden.
De injectie / infectie hier beschreven procedure wordt aangepast van een methode eerder beschreven door Wu et al 16. Deze procedure is eenvoudig en goedkoop. Een nadeel is dat handbediening van injectievolume met behulp van kleurstof als indicator is grof en kan bijdragen aan variabiliteit. Andere groepen hebben gebruik gemaakt van een microinjector om een constant injectievolume 17 mogelijk te maken, of hebben gestoken vliegen met een naald gedoopt in bacteriecultuur 18. Toch is de methode hier gepresenteerde succesvol geweest in het detecteren van veranderingen in bacteriële klaring over experimentele condities 11,19 </ Sup>.
Survival vliegen tijdens infectie wordt gewoonlijk gekwantificeerd door het tellen van de resterende vliegen op regelmatige tijdsintervallen. Hier gebruiken we de Trikinetics DAM systeem het tijdstip van overlijden monitoren afzonderlijke vliegen, die wordt aangegeven door stillegging. We hebben vastgesteld dat het effect op overleving zoals vastgesteld door bewegingsactiviteit is dezelfde als vastgesteld door visuele inspectie van vliegen in de buizen tijdens infectie activiteit (niet gepubliceerd). Deze methode wordt ook eerder gebruikt voor het meten levensduur 20,21. Het is echter belangrijk op te merken dat de evaluatie van overleving in de DAM is beperkt tot die in geïsoleerde vliegen, en dat resulteert uit deze voorwaarde wordt verwacht verschillen van die in gegroepeerde omstandigheden. Vroege studies hebben aangetoond verschillen in overleving wanneer de gastheer wordt geplaatst in groepen versus geïsoleerde omstandigheden 22. Recent werk heeft ook bevestigd dat de levensduur in groepen van vliegen is langerdan in geïsoleerde vliegen 20.
Luciferase reporter-activiteit is eerder gebruikt voor de analyse van genexpressie klok in living flies (bijvoorbeeld ref 23). In deze gevallen andere technische overwegingen nodig, met name de uitputting van de luciferin substraat die optreedt gedurende verscheidene dagen van het uitvoeren van de assay. In tegenstelling tot de hier beschreven assay is beperkt tot het overleven van geïnfecteerde vliegen en die een eenvoudige meting over 24 uur na infectie. Een herhaalde metingen ANOVA was voldoende om veranderingen ten opzichte van de uitgangswaarde binnen elke groep te evalueren. Statistische benaderingen analyseren van een circadiane oscillatie van luciferase reporters, samen met normalisatie stappen te corrigeren substraat depletie volledig elders 24 besproken. In beide gevallen meet real-time reporter-activiteit in afzonderlijke vliegen is een efficiëntere methode voor het extraheren van informatie over de tijd dynamieken dan standard biochemische en immunohistochemische assays.
Echter een potentieel nadeel controle luciferase reporter-activiteit in vivo is dat het afhankelijk vliegen eten van luciferin substraat. Anorexia is geassocieerd met infectie in vliegen en voeding kan ook variëren met het type infectie of tussen genotypen 25. De bezorgdheid over opname van het substraat te omzeilen kan vliegen ontleed in afzonderlijke lichaamsdelen of weefsels na infectie en reporter activiteit kan worden gemeten in kweek zoals eerder 26 beschreven. Als alternatief kunnen de resultaten van de luciferase assay wordt geverifieerd met een standaard test die niet afhankelijk voeding. Zo is kwantitatieve PCR is een veel gebruikte aanpak voor expressie van antimicrobiële peptide (AMP) mRNA te meten. Versterkers zijn bekend doelstellingen van NFKB, en dus aan het niveau van activiteit.
De vertegenwoordiger DATeen hier beschreven recapituleren eerdere werk waaruit blijkt dat NFKP stijgt met het immuunsysteem van uitdaging en een latere toename van de slaap 2. Echter, wordt de lezer gewaarschuwd die slapen in het Trikinetics DAM-systeem wordt aangegeven door inactiviteit gedurende minimaal vijf opeenvolgende minuten 27. Meting van de slaap in de vlieg door videografie beroept zich ook op inactiviteit 28. Deze slaap definitie vliegen kan mogelijk problemen tijdens een infectie, omdat het ook bekend dat immune dieren uitgedaagd inactief lange tijd zonder slapen 29. Om dit probleem te verhelpen, testen die maatregel zintuiglijke responsiviteit zijn noodzakelijk om te verifiëren dat inderdaad vliegen zijn slaap. Onderzoekers hebben vastgesteld reactie van vliegen voor sensorische stimuli, zoals een potlood tap 30, borstelen de activiteit buizen met een houten stok 31 of verwarming een uiteinde van een buis 27. In alle gevallen, slapen vliegen zijn minder gevoelig (gemetenhetzij door de reactie van latentie of door procent vliegt reageren als groep) dan wakker vliegen. We hebben gevonden dat besmet vliegen die slapen inderdaad minder ontvankelijk voor sensorische stimuli tot 6-8 uur na infectie (Th. Kuo en JA Williams, niet gepubliceerde waarneming). Ondanks de technische beperkingen, de Trikinetics DAM-systeem zorgt voor een hoge doorvoersnelheid voordeel dat van nut zal zijn voor toekomstige studies in vliegen die een genetische en moleculaire link tussen slaap en het immuunsysteem te verkennen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door de National Science Foundation onder toekenning # IOS-1025627 en door de National Institutes of Health onder subsidie # 1R21NS078582-01 naar JAW
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Incubators | Percival Scientific, Inc. | I30BLLC8 I36VLC8 |
Any incubator capable of running programmed light/temperature schedules is appropriate. |
| Drosophila Activitiy Monitors | Trikinetics Inc., Waltham, MA | DAM2 | As described elsewhere6, this system requires a computer interface, software, and other accessories. |
| Pyrex Glass Tubes | Trikinetics Inc., Waltham, MA | PGT-5x65 | |
| Microplate scintillation and luminescence counter | Perkin Elmer | TopCount NXT 12 detector |
Any microplate reader capable of detecting luminescence can be used for this type of reporter assay. TopCount contains multiple detectors and an automated stacker; it is capable of being programmed to read continuously from multiple plates. |
| FluorChem 8900 | Alpha Innotech | Imaging of bacterial cultures is optional; any digital imaging system with visual light capability is sufficient. | |
| Micropipette Puller | Tritech Research, Inc. | Narishige PC-10 | |
| Supplies | |||
| Borosilicate Glass Capillaries | World Precision Instrument Inc. | 1B100F-4 | |
| 3 ml Syringe | Fisher Scientific | BD 305482 | |
| Syringe Needles | Fisher Scientific | BD 305196 | 18 G - cut off the tip of the needle to prevent damage to the tubing. |
| Silicone Tubing, i.d. (0.030") o.d. (0.065") Wall Thickness (0.018") | VWR | 60985-706 | Used for attaching glass capillary needles to a syringe |
| 3 Way Stopcock | American Pharmaseal Company | K75 | |
| Kontes Pellet Pestle Cordless Motor | Fisher Scientific | K749540-0000 | |
| Kontes Pellet Pestle | Fisher Scientific | K749521-1590 | |
| Glass balls 3mm | VWR | 26396-630 | |
| Microplate Microlite 1+ | Thermo Scientific | 7571 | Select 96-well plates that are appropriate for luminescence - they must be opaque. |
| TopSeal-A:96-well Microplates | PerkinElmer | 6005185 | Microplate Press-On Adhesive Sealing Film |
| D-Luciferin, Potassium Salt | Gold BioTechnology, Inc. | LUCNA | |
| Software | |||
| Insomniac2 | Available upon request to the authors | custom; written by Lesley Ashmore, Ph.D. (Westminster College) | Matlab based software that has been used routinely for analysis of sleep2,6,11 |
| Drosonex | Available upon request to the authors | custom; written by Thomas Coradetti (Sidewalk Software) | A PC MSVC6 program used for survival analysis from raw data files collected with the Trikinetics system |
| Photoshop CS3 | Adobe | Useful for obtaining numbers of cfu/plate from digital images (optional) | |
References
- Majde, J. A., Krueger, J. M. Links between the innate immune system and sleep. J. Allergy Clin. Immunol. 116, 1188-1198 (2005).
- Kuo, T. H., Pike, D. H., Beizaeipour, Z., Williams, J. A. Sleep triggered by an immune response in Drosophila is regulated by the circadian clock and requires the NFkappaB Relish. BMC Neurosci. 11, 1471-2202 (2010).
- Preston, B. T., Capellini, I., McNamara, P., Barton, R. A., Nunn, C. L. Parasite resistance and the adaptive significance of sleep. BMC Evol Biol. 9, 7 (2009).
- Imeri, L., Opp, M. R. How (and why) the immune system makes us sleep. Nat. Rev. Neurosci. 10, 199-210 (2009).
- Ayres, J. S., Schneider, D. S. A Signaling Protease Required for Melanization in Drosophila Affects Resistance and Tolerance of Infections. PLoS Biol. 6, e305 (2008).
- Chiu, J. C., Low, K. H., Pike, D. H., Yildirim, E., Edery, I. Assaying Locomotor Activity to Study Circadian Rhythms and Sleep Parameters in Drosophila. J. Vis. Exp. (43), e2157 (2010).
- Lee, J. E., Edery, I. Circadian Regulation in the Ability of Drosophila to Combat Pathogenic Infections. Curr. Biol. 18, 195-199 (2008).
- Stone, E. F., et al. The circadian clock protein timeless regulates phagocytosis of bacteria in Drosophila. PLoS Pathog. 8, e1002445 (2012).
- Hill-Burns, E. M., Clark, A. G. X-linked variation in immune response in Drosophila melanogaster. Genetics. 183, 1477-1491 (2009).
- Short, S. M., Lazzaro, B. P. Female and male genetic contributions to post-mating immune defence in female Drosophila melanogaster. Proc. Biol. Sci. 277, 3649-3657 (2010).
- Williams, J. A., Sathyanarayanan, S., Hendricks, J. C., Sehgal, A. Interaction between sleep and the immune response in Drosophila: a role for the NFkappaB relish. Sleep. 30, 389-400 (2007).
- Ramsden, S., Cheung, Y. Y., Seroude, L. Functional analysis of the Drosophila immune response during aging. Aging Cell. 7, 225-236 (2008).
- Williams, J. A., Su, H. S., Bernards, A., Field, J., Sehgal, A. A circadian output in Drosophila mediated by neurofibromatosis-1 and Ras/MAPK. Science. 293, 2251-2256 (2001).
- Hedengren, M., et al. Relish, a central factor in the control of humoral but not cellular immunity in Drosophila. Mol. Cell. 4, 827-837 (1999).
- Leulier, F., Rodriguez, A., Khush, R. S., Abrams, J. M., Lemaitre, B. The Drosophila caspase Dredd is required to resist gram-negative bacterial infection. EMBO Rep. 1, 353-358 (2000).
- Wu, L. P., Choe, K. -M., Lu, Y., Anderson, K. V. Drosophila Immunity: Genes on the Third Chromosome Required for the Response to Bacterial Infection. Genetics. 159, 189-199 (2001).
- Dionne, M. S., Ghori, N., Schneider, D. S. Drosophila melanogaster is a genetically tractable model host for Mycobacterium marinum. Infect. Immun. 71, 3540-3550 (2003).
- Romeo, Y., Lemaitre, B. Drosophila immunity: methods for monitoring the activity of Toll and Imd signaling pathways. Methods Mol. Biol. 415, 379-394 (2008).
- Lu, Y., Wu, L. P., Anderson, K. V. The antibacterial arm of the Drosophila innate immune response requires an I{kappa}B kinase. Genes Dev. 15, 104-110 (2001).
- Koh, K., Evans, J. M., Hendricks, J. C., Sehgal, A. A Drosophila model for age-associated changes in sleep:wake cycles. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 103, 13843-13847 (2006).
- Bushey, D., Hughes, K. A., Tononi, G., Cirelli, C. Sleep, aging, and lifespan in Drosophila. BMC Neurosci. 11, 1471-2202 (2010).
- Allee, W. C. The social life of animals. , W.W. Norton & Company, Inc. (1938).
- Stanewsky, R., Jamison, C. F., Plautz, J. D., Kay, S. A., Hall, J. C. Multiple circadian-regulated elements contribute to cycling period gene expression in Drosophila. Embo. J. 16, 5006-5018 (1997).
- Levine, J. D., Funes, P., Dowse, H. B., Hall, J. C. Signal analysis of behavioral and molecular cycles. BMC Neurosci. 3, 1 (2002).
- Ayres, J. S., Schneider, D. S. The role of anorexia in resistance and tolerance to infections in Drosophila. PLoS Biol. 7, e1000150 (2009).
- Plautz, J. D., Kaneko, M., Hall, J. C., Kay, S. A. Independent photoreceptive circadian clocks throughout Drosophila. Science. 278, 1632-1635 (1997).
- Huber, R., et al. Sleep homeostasis in Drosophila melanogaster. Sleep. 27, 628-639 (2004).
- Zimmerman, J. E., Raizen, D. M., Maycock, M. H., Maislin, G., Pack, A. I. A video method to study Drosophila sleep. Sleep. 31, 1587-1598 (2008).
- Toth, L. A., Rehg, J. E., Webster, R. G. Strain differences in sleep and other pathophysiological sequelae of influenza virus infection in naive and immunized mice. J. Neuroimmunol. 58, 89-99 (1995).
- Hendricks, J. C., et al. Rest in Drosophila is a sleep-like state. Neuron. 25, 129-138 (2000).
- Wu, M. N., Koh, K., Yue, Z., Joiner, W. J., Sehgal, A. A genetic screen for sleep and circadian mutants reveals mechanisms underlying regulation of sleep in Drosophila. Sleep. 31, 465-472 (2008).
