Summary
Pour comprendre le lien entre la réponse immunitaire et le comportement, nous décrivons une méthode pour mesurer le comportement locomoteur dans
Abstract
Une interaction complexe entre la réponse immunitaire et comportement de l'hôte a été décrit dans un large éventail d'espèces. L'excès de sommeil, en particulier, est connu pour se produire en réponse à l'infection chez les mammifères 1 et a récemment été décrit chez Drosophila melanogaster 2. Il est généralement admis que le sommeil est bénéfique à l'hôte lors d'une infection et qu'il est important pour le maintien d'un système immunitaire robuste 3,4. Cependant, les preuves expérimentales qui soutient cette hypothèse est limité 4, et la fonction du sommeil en excès au cours d'une réponse immunitaire reste incertaine. Nous avons utilisé une approche multidisciplinaire pour s'attaquer à ce problème complexe, et ont mené des études dans le système modèle génétique simple, la mouche du vinaigre Drosophila melanogaster. Nous utilisons un test standard pour mesurer le comportement locomoteur et de sommeil chez les mouches, et de montrer comment ce test est utilisé pour mesurer le comportement des mouches infected avec une souche pathogène de bactéries. Ce test est également utile pour contrôler la durée de survie chez les mouches individuels au cours d'une infection. D'autres mesures de la fonction immunitaire incluent la capacité de mouches pour effacer une infection et l'activation de NFkB, un facteur de transcription clé qui est au cœur de la réponse immunitaire innée chez la drosophile. Résultats à la fois la survie et la clairance bactérienne au cours de l'infection ainsi que des indicateurs de résistance et de tolérance à l'infection. Résistance réfère à la capacité des mouches pour effacer une infection, tandis que la tolérance est définie comme la capacité de l'hôte à limiter les dommages causés par une infection et ainsi survivre en dépit des niveaux élevés d'agents pathogènes au sein du système 5. Surveillance en temps réel de l'activité de NFkB cours de l'infection permet de mieux comprendre un mécanisme moléculaire de survie lors de l'infection. L'utilisation de la drosophile dans ces essais simples facilite les analyses génétiques et moléculaires de sommeilet la réponse immunitaire et la manière dont ces deux systèmes complexes sont mutuellement influencés.
Protocol
Ce protocole utilise deux configurations (Figure 1) pour l'acquisition de quatre affichages différents recueillies des mouches soumises à une infection bactérienne. Ces sorties comprennent: 1) le sommeil / sillage comportement; résultats de survie 2), 3) la charge bactérienne chez la mouche, et 4) la mesure en temps réel de l'activité du rapporteur NFkB in vivo. En combinaison avec les outils génétiques qui sont disponibles chez la drosophile, ces mesures donnent un aperçu mécanistique sur le lien moléculaire entre la fonction immunitaire et le comportement.
1. Activité locomotrice mesure et hôtels de mouches
- Le montage utilisé pour mesurer l'activité locomotrice et hôtels de mouches, qui comprend le système de surveillance de l'activité chez la drosophile (DAM2, Trikinetics), incubateurs, chambre noire, et la préparation des animaux de laboratoire et les tubes d'activité, a été décrit précédemment 6. La même approche est utilisée ici, avec quelques modifications mineures.
- Activité tubes sont nettoyés pour une réutilisation en faisant bouillir sur une plaque chauffante dans de l'eau déminéralisée. Une petite quantité de détergent est ajouté pour la première ébullition, les tubes sont bien rincées et cuites deux fois plus. Si le fil est utilisé pour boucher le tube, les tubes d'activité utilisées (contenant de la nourriture, de la cire, des mouches et fils) peuvent être nettoyés sans démontage préalable du fil.
- Avant de lancer une expérience, cultures lieu contenant fin nymphe mise en scène des mouches dans des incubateurs pendant trois à quatre jours pour s'adapter à l'éclairage expérimental et d'autres conditions environnementales. Lumière: des conditions sombres ou constante ont été couramment utilisés pour mesurer le comportement du sommeil. Dans cet exemple, les mouches sont acclimatés à lumière constante pour éliminer l'influence de l'horloge circadienne sur la réponse immunitaire et le comportement 2,7,8. Comme il est décrit à la figure 1A 6, et record pour un minimum de trois jours avant l'infection.
2. Infect mouches avec une souche pathogène de bactéries
- Le protocole décrit ici est spécifique à S. marcescens, qui sont faciles à cultiver et à entretenir. Les protocoles de stockage à long terme et les conditions de culture pour d'autres espèces bactériennes peuvent varier. S. marcescens sont stockés dans le glycérol 15-50% à -80 ° C. Pour préparer stockage à long terme, mélangez 2 volumes de culture bactérienne pendant la nuit (DO 600 = 0,5 - 1,0) à 1 volume de glycérol à 50% autoclave en 1,5 ml microtubes. Cela se traduira par une concentration de glycérol final de 17%. Conserver les tubes à -80 ° C. Pour préparer une courte durée d'utilisation de source de bactéries, gratter le stock congelé avec une pointe de pipette stérile 200 ul et d'effectuer une série de trois cours sur une plaque de gélose LB. Incuber la plaque pendant la nuit à 37 & dpar exemple, C pour obtenir des colonies isolées. Conservez la plaque à 4 ° C.
Un jour avant l'infection prévue, choisissez une seule colonie de la plaque de gélose LB avec une pointe de pipette stérile 200 pi et plonger la pointe dans un tube de culture contenant 5 ml de milieu LB. Cultiver des bactéries pendant la nuit, ou jusqu'à 16 heures à l'intérieur d'un agitateur incubateur à 37 ° C et 250 rpm jusqu'à ce qu'il atteigne la phase de croissance exponentielle. Mesurer la concentration d'un spectrophotomètre à une DO 600. La concentration dans cette phase varie de 0,5 à 1. Si la concentration est trop élevée, repiquer les bactéries et croître pendant encore plusieurs heures pour obtenir une concentration optimale. Effectuez la procédure à proximité d'une source de flamme. Certaines souches bactériennes sont conçus pour la résistance aux antibiotiques et sont cultivées et sélectionnées pour antibiotique approprié ajouté au milieu. S. marcescens (ATCC # 8100) ne sont pas résistants aux antibiotiques et sont donc cultivées dans un milieu stérile sans antibiotique. Pour vérifier une technique stérile, faire une maquette culture sans bactéries en tant que témoin.
La solution pour infecter les mouches contient des bactéries (diluée à DO600 = 0,1) et de colorant alimentaire 1% (bleu brillant FCF) dans du PBS. Préparer une solution de contrôle d'injection en ajoutant une quantité équivalente de milieu LB utilisé en solution infection et 1% de colorant alimentaire bleu dans du PBS. Conserver les solutions sur la glace. - Préparer aiguilles de verre pour injecter les mouches. Tirez capillaires en verre (od = 1 mm, id = 0,58 mm, WPI) pour une pointe fine à l'aide d'un extracteur micropipette (Narishige). Sous une loupe binoculaire, utilisez une pince fine à rompre la pointe de l'aiguille de sorte que l'ouverture est assez grande pour remplir de fluide d'injection en appliquant une aspiration avec une seringue, mais assez petit pour minimiser les dommages à la volée pendant le processus d'injection. Après avoir brisé la pointe, la taille de la pointe devrait être autour de 40-50 um. L'aiguille de verre est fixée à une seringue en plastique 3 cc avec une longueur de tube. L'écoulement du fluide d'injection est commandée manuellement en appliquant une pression positive ou suction avec la seringue. Éviter de contaminer le tube en caoutchouc avec un fluide d'injection, comme le dispositif de seringue est utilisée pour le contrôle de l'infection et les injections.
- Anesthésier les mouches en les plaçant sur un tapis de CO 2. CO 2 est passé à travers un récipient fermé d'eau pour humidifier le tampon et pour réduire l'électricité statique, ce qui peut compliquer la manipulation de vol sur la plaquette. Injecter mouches par piquer l'aiguille de verre dans la région au-dessus du scutellum du thorax dorsal. Le passage du milieu d'injection dans la mouche est vérifiée par le colorant alimentaire - mouches deviennent bleus comme les spreads de colorants alimentaires à travers le système. La dose de bactéries qui reçoivent les mouches peut être quantifiée comme décrit dans la section 3 ci-dessous. Certains modèles expérimentaux comprennent un groupe témoin qui reçoit une blessure par injection aseptique mouches avec du colorant alimentaire PBS et sans bactéries.
3. Déterminer la charge bactérienne
Une approche pour evaluating la réponse immunitaire contre l'infection bactérienne est une infection à déterminer la charge bactérienne après. D. melanogaster est un excellent modèle pour déterminer ce paramètre, car la volée entière peut être homogénéisé afin d'estimer le nombre total de bactéries à l'intérieur d'un individu. La raison d'être de ce protocole est que lorsqu'elle est cultivée sur un milieu solide tel que du bouillon de Luria (LB) agar sur une boîte de Pétri (plaque LB), une seule bactérie forme une colonie visible à distinguer. Par conséquent, en homogénéisant les mouches infectées en milieu liquide LB, générer des dilutions en série de l'homogénat, et d'étalement de l'homogénat dilué sur des plaques LB, le nombre de cellules bactériennes qui infectent une volée peut être déterminée. Un groupe de contrôle de vol d'une injection de PBS et de coloration des aliments sans pour autant les bactéries doivent être utilisées pour vérifier que l'infection n'a pas été contaminé par d'autres espèces bactériennes. Il devrait y avoir aucune colonie sur la gélose LB dans cet état.
- Autoclaver tous les matériaux qui seront utilisés pour cetteprocédure avant d'effectuer l'étape d'homogénéisation réelle. Cette regroupe plus de 200 embouts de pipette ul coupés avec des ciseaux, des médias, LB et pilons utilisés pour l'homogénéisation. Préparer les plaques en versant autoclavé milieu LB / agar dans des boîtes de 10 cm de Petri stériles au moins 1 jour avant l'homogénéisation des mouches.
- Anesthésier et de recueillir les mouches dans 1,5 ml microtubes et tubes de magasins sur la glace.
- Effectuez l'homogénéisation près d'une flamme pour éviter la contamination. Une homogénéisation de contrôle contenant les mouches sans infection est particulièrement recommandé lors de l'utilisation d'une souche bactérienne telles que S. marcescens, qui ne sont pas résistantes aux antibiotiques. Homogénéiser un minimum de 2 groupes de 10 mouches par chaque état expérimental. Le nombre de mouches utilisés par homogénat est déterminée par l'expérimentateur. Certains groupes ont utilisé une mouche par homogénat, ce qui est utile pour évaluer la variation de la charge bactérienne entre les mouches individuelles 8, tandis que d'autres ont utilisé de 3 à 10 mouches par homogénatà comparer entre génotype ou de la condition expérimentale 9-12.
- Ajouter 400 ul de milieu LB à chaque microtube contenant les mouches et homogénéiser à l'aide d'un petit moteur et un pilon (Kontes).
- Utiliser des embouts de pipette stériles coupées, serial dilution de 1:10 homogénat en ajoutant 20 ul LB homogénéisé / milieu bactérien à tube de 1,5 ul contenant 180 ul de milieu LB. Couper des pointes de pipette empêche le blocage des débris voler et veille à ce que le volume approprié est en cours de transfert.
- Facteur de dilution est déterminé de manière empirique et dépend du génotype de la mouche, la souche bactérienne utilisée, et les conditions expérimentales. Pour les mouches de type sauvage infectées par S. marcescens, utiliser des dilutions de 1:10 2 1:10 3 ou pour les mouches homogénéisés immédiatement après l'infection, et des dilutions de 1:10 ou 1:10 4 5 pour les mouches homogénéisé 24 h après l'infection.
- Ajouter 100 ul LB / milieu bactérien du microtubes rocentrifuge contenant la dilution finale et la propagation de la moyenne sur une plaque LB utilisant des billes de verre (VWR) pour assurer une distribution uniforme.
- Jeter des boules de verre dans une solution EtOH à 100%. Placez les plaques de LB dans un incubateur à 37 ° C pendant la nuit.
- En option, utilisez un système d'imagerie à la lumière visible pour obtenir une image des plaques LB (FluorChem 8900; Alpha Innotech). Compter le nombre de colonies soit sur la plaque elle-même ou de l'image de la plaque en utilisant l'outil de comptage sur logiciel Photoshop (Adobe Photoshop CS3).
- Calculer le nombre d'unités formant colonie par la mouche selon la formule suivante: [n / (N * D * v)] * V, où n = nombre de colonies cultivées sur la plaque LB, N = le nombre de vol mis en commun dans une microtube, D = facteur de dilution et v = volume de solution étalée sur chaque plaque; V = volume initial de l'homogénat.
4. Évaluer sommeil et la durée de survie après l'infection
- Pourmouches qui ne sont pas exploitées pour mesurer la charge bactérienne, continuer à surveiller le comportement pendant 7-10 jours. Durée de survie est influencée par le génotype des mouches, les conditions environnementales et les espèces bactériennes utilisées pour l'infection.
- Après environ 10 jours, résilier l'expérience, télécharger et traiter les données comportementales telles que décrites précédemment 6. Insomniac2 logiciels sur mesure, qui est basé à Matlab, est utilisé pour analyser les paramètres du sommeil. Il est important d'éliminer les mouches mortes de l'analyse comportementale. Normalement, ce qui limite les analyses à l'intérieur du premier jour après l'infection, selon le type d'infection et le génotype mouche. La mort dans l'essai est indiqué par le temps tous les chefs d'activité ont atteint zéro. Pour faciliter l'analyse de la survie, Drosonex, un logiciel personnalisé écrit en Microsoft Visual C + + 6.0, est utilisé pour traiter les fichiers de données brutes du système de DAM Trikinetics. Les rapports de logiciels sous forme de fichiers Excel, la durée de survie de chaque volée (en heures), compile activité datun ensemble de moniteurs dans une feuille de calcul, et signale l'oiseau survivant pour cent dans le temps fixé par l'utilisateur. Les fichiers Excel sont conçus pour s'intégrer dans d'autres logiciels de statistiques pour une analyse ultérieure.
5. Mesure de l'activité NFKB cours de l'infection en utilisant un dosage rapporteur de la luciférase
Transgénique KB-luc les mouches utilisées dans ce test ont été générés précédemment comme décrit dans Kuo et al., 2010 2. En bref, le journaliste KB-luc contient 8 répétitions d'une séquence NFkB contraignant qui ont été insérés dans un promoteur en amont d'un cadre de lecture ouvert luciférase.
- Ajustez les mouches des conditions d'éclairage expérimentales telles que décrites à la section 1.2. Dans cet exemple, 1-4 jours d'âge KB-luc les mouches sont logés dans des flacons contenant une solution de saccharose à 5%, 2% agar milieu alimentaire et mis en lumière constante (LL) pendant 2 jours pour atteindre le même âge que d'autres mouches lors de l'infection.
- Préparer une microplaque de 96 puits pour les mouches. Chaque puits contient 2 couches de milieu alimentaire (Figure 2), la couche supérieure contient luciférine, le substrat de la luciférase. Ajouter 300 ul d'une solution de saccharose à 5%, solution de gélose à 2% dans chaque puits et laisser se solidifier. Ensuite, ajoutez une couche de 50 ul haut à chaque puits contenant du sucrose 5%, 1% de gélose, et 2 mM de luciférine (Gold Biotechnology, Inc). Luciférine concentrations utilisées pour l'activité du rapporteur de mesure chez la drosophile ont varié dans la littérature, et ont été aussi basses que 100 uM 13. La concentration requise peut être déterminée empiriquement. Entre les couches de distribution des aliments, couvrir la plaque avec un chiffon à maille fine pour faciliter le séchage tout en préservant la stérilité. La plaque devrait être autorisé à sécher, jusqu'à une heure, afin d'empêcher les mouches de se coincer dans les gouttelettes de condensation. Parce que luciférine est sensible à la lumière, éviter d'exposer les plaques à la lumière plus que nécessaire.
- Appliquer un film adhésif transparent (Top-Seal-A; Perkin Elmer) pour une plaque de 96 puits de microtitration et perforer à l'aide d'une aiguille fine à une quantité de 2 trous par puits. Ces trous permettent non seulement un échange d'air dans chaque puits, mais aussi de fournir un moyen d'anesthésier les mouches sur une base individuelle. Utiliser une lame bien aiguisée et d'une règle, d'introduire une coupure entre chaque colonne. Ce sera un moyen facile de charger / décharger les mouches par groupes de 8 à la fois.
Pour charger les mouches dans la plaque de microtitration, retirer les flacons de l'incubateur et les mouches anesthésier sur un pad CO 2. Une charge d'oiseau par une à chaque puits colonne par colonne. Si un avion se coincer par inadvertance sur le joint adhésif, laisser la mouche seulement car ils sont souvent en mesure de se libérer sans intervention. Retour à la plaque de microtitration dans l'incubateur pendant 8-24 h LL pour s'adapter à ce nouvel environnement et à consommer le substrat luciférine. - Bactéries Culture, S. marcescens, et préparer une solution d'infection tel que décrit ci-dessus.
- Anaesthetize til vole à l'aide d'une pointe de la micropipette attachée à une faible pression de CO 2 lignes. Placez la pointe de la micropipette directement au-dessus des trous de ventilation effectués pour chaque puits. Prenez garde à s'assurer que la pression de CO 2 est suffisamment élevée pour anesthésier la volée, mais suffisamment faible pour éviter les blessures à la mouche. Par groupes de huit, individuellement transférer chaque volée à un pad CO 2, et infecter tel que décrit ci-dessus. Après l'infection, retournez chacune à la mouche à son origine bien refermé et la microplaque.
- Luminescence mesure (TopCount NXT-luminescence et compteur à scintillation; Perkin-Elmer). Le compteur de luminescence TopCount contient une cassette d'empilement de plaques, ce qui permet des lectures programmées et automatisées en permanence par incréments souhaités pour toute longueur de temps (habituellement jusqu'à cinq jours). Cette fonction n'est pas disponible sur tous les instruments, et la collecte de données pour les expériences réalisées avec d'autres instruments peuvent donc être moins fréquents. Le compteur de luminescence est logé dans un room avec une température contrôlée et horaire d'éclairage. Lors du chargement des plaques dans la cassette d'empilement, empiler les plaques contenant les mouches claires entre les plaques vierges pour veiller à ce que les mouches recevoir la lumière. Programme du luminomètre selon les spécifications du fabricant de recueillir des lectures toutes les heures pendant un minimum de 24 heures. Dans cet exemple, les détecteurs sont programmés pour lire chaque puits pendant 10 sec et à exprimer le résultat en points (unités arbitraires) par seconde. Cette valeur est une moyenne sur 3 lectures par puits. Exporter les fichiers de données vers un tableur et d'effectuer une analyse standard, la représentation graphique des résultats de luminescence.
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Representative Results
- L'infection favorise le sommeil. Dans cet exemple, Canton-S (CS) des mouches de type sauvage et les mouches mutantes dépourvues d'un gène NFkB, relish (Rel E20) 14, ont été chargés dans deux DAM2 moniteurs d'activité (n = 32 pour chaque génotype) et infectées comme décrit ci-dessus. Les mouches ont été maintenus dans une lumière constante pour éliminer l'influence de l'horloge circadienne sur le comportement et l'infection 2,7,8. Les mutants ont été E20 Rel isogenized à CS comme décrit précédemment 11. Les deux ensembles de mouches ont été infectés par S. marcescens et les résultats sont représentés sur la figure 3. Dans certains cas, un groupe de contrôle supplémentaire géré est utile pour différencier les effets de la manipulation des effets de l'infection 2. Groupes témoins traités sont exposés aux mêmes changements environnementaux comme les groupes infectés, ce qui comprend l'enlèvement de l'incubateur et l'anesthésie pour la même durée de temps, mais ils ne reçoivent une injection. Toutefois, dans cet exemple, il est clair que Rel E20 mutants éprouver moins de sommeil que les CS de commande vole après l'infection (figure 3A). Comme décrit précédemment 6, il existe d'autres paramètres comportementaux qui peuvent être mesurés à partir du dosage DAMS. Il peut s'agir de comptes en activité totale par unité de temps (figure 3B). Dans cet exemple, le changement d'activité après l'infection que les miroirs de sommeil. Nous présentons également les taux d'activité, ou les comptages d'activité par minute de veille (figure 3C). Ce paramètre est un indicateur de la capacité locomotrice des mouches. Dans ce cas, les taux d'activité éveil ne changent pas en soit le génotype cours de l'infection, ce qui suggère que la réduction de l'activité ou augmentation du sommeil n'est pas un résultat de la capacité locomotrice réduite.
- La figure 4A représente le taux de survie après l'infection. Conformément aux résultats antérieurs 14,15, Rel E20 mutants rapidement succomber à l'enfection par rapport aux mouches de type sauvage. La plupart des mouches ont survécu à la commande d'injection aseptique (figure 4B), ce qui indique que les mouches succombé à l'infection et non à la blessure due à l'injection. Parce que les mutants Relish est mort si vite, seules les mouches CS ont été utilisés pour démontrer la charge bactérienne après l'infection (figure 5). Figure 5 montre que S. marcescens continue à proliférer dans la volée 24 heures après l'infection.
- Activité rapporteur de la luciférase est représenté à travers le temps dans l'essai dans quatre mouches individuelles (figure 6). Grande variation entre les points de données et les mouches individuelles peuvent être attribuées aux mouches qui se déplacent à l'intérieur des puits. Bien que le signal provient de tous les tissus au sein de la mouche, il n'est pas prévu que tous les tissus qui émettent la même quantité de signal, et la visibilité du tissu au détecteur pourrait varier à mesure que le mouche. Dans cet exemple, les mouches ont été infectées et par rapportavec un groupe témoin traité. Les mouches qui sont morts ont été exclus de l'analyse sur un groupe de mouches présentés dans la figure 7A. Les mouches mortes sont déterminés par une inspection visuelle. Dans ces mouches, il ya une forte baisse du signal de la luciférase, ainsi qu'une diminution de la variation du signal, ce qui indique que la mouche ne bouge pas. L'activité du rapporteur KB-luc augmente progressivement après l'infection (figure 7A) et des blessures aseptique (figure 7B ). Les pics d'activité autour de reporter de 12 heures post-traumatique et post-infection. Manipulations génétiques et / ou du comportement des mouches sont susceptibles de modifier l'activité du rapporteur KB-luc cours de l'infection. Par exemple, nous avons décrit précédemment 2 que l'induction de l'activité du rapporteur KB-luc a été largement atténuée au cours de l'infection dans Rel E20 mutants, indiquant ce journaliste KB-luc est spécifique à NFkB.
Figure 1. Organigramme qui décrit les grandes étapes de mesurer les réponses immunitaires chez la drosophile (A) La séquence des étapes est décrite pour le sommeil de mesure, la survie et la charge bactérienne au cours d'une infection. (B) La séquence des étapes est décrite pour la mesure de NFkB-dépendante activité rapporteur de la luciférase cours de l'infection. Les expériences peuvent continuer à aller de 1-5 jours, en fonction de la létalité des espèces bactériennes utilisées.
Figure 2. Les mouches schématiques d'une microplaque individu bien. Sont placés en opaque, plaques à 96 puits contenant du milieu et couvert, comme illustré. Parce que les mouches seront manipulés individuellement d'être infecté, il est important de to limiter le nombre de mouches par plaque à un montant qui peut raisonnablement être gérées dans une période de temps donnée, en fonction des conditions expérimentales.
Figure 3. Réponse comportement des mouches infectées par S. marcescens. (A) Moyenne ± SEM pour cent du temps de sommeil qui vole passé et (B) Moyenne ± SEM chefs activité totale sont représentés par incréments h 4 pour 1 jour avant et après l'infection avec S. marcescens. (C) Moyenne ± SEM comptages d'activité par minute de veille avant (BL = base) et après l'infection avec S. marcescens est tracée par incréments h 8. Le comportement est rapporté pour les mouches de type sauvage CS qui ont survécu pendant au moins 24 heures après l'infection, et pour le système immunitaire déficient Rel E20 vole that survécu pendant au moins 8 heures après l'infection. n = 13 pour le CS et pour Rel E20. ** = P <0,01 et * = p <0,05, t étudiant - test.
Figure 4. Résultat la survie des mouches infectées et non infectées. (A) courbes représentatives de survie de Kaplan-Meier sont tracées pour les deux wild-type CS et immuno-déficients mouches E20 Rel qui ont été infectés par S. marcescens. p = 8.13x 10 -13, test du log rank. n = 31 pour le CS et n = 32 pour les mouches E20 Rel. (B) les courbes représentatives de survie de Kaplan-Meier sont signalés comme en (A), à l'exception des mouches reçu des blessures par injection aseptique avec des milieux liquides sans bactéries. Presque toutes les mouches survécu à des blessures aseptique jusqu'à la fin des expériences (60 h après la lésion). p> 0,97, log ranque de test, n = 32 pour le CS et Rel E20 mouches.
Figure 5. La quantification de la charge bactérienne chez les mouches infectées par S. marcescens. (A) représentant la culture bactérienne de CS mouches infectées par S. marcescens qui ont été récoltées immédiatement après l'infection (panneau de gauche), ou 24 heures après l'infection (panneau de droite). Les facteurs de dilution sont indiqués en dessous de chaque figure. Dans cet exemple, 10 mouches ont été homogénéisés dans 400 ul de solution pour chaque groupe. 100 ul de la dilution finale a été étalée sur chaque plaque. La plaque de gauche contient 29 unités formatrices de colonies (UFC). Pour calculer ufc / à la mouche, il faut diviser par 29 ufc [10 mouches * 0,001 (facteur de dilution) * 100 ul (volume de diffusion sur la plaque)], ce qui équivaut à 29, puis multiplier par le volume initial de 400 pl = 11600. Pour cette plaque particulière, nous avons une moyenne de 1,16 x 10 4cfu / vol. La plaque de droite contient 257 colonies. En utilisant la même formule, on trouve une moyenne de 1,03 x 10 6 cfu / à la mouche. (B) Après le calcul ufc / volée à partir de chaque plaque dans chaque condition expérimentale, de générer boîte à moustaches, comme illustré. Dans cet exemple, le 25, le 50e percentile (médiane) et 75e sont présentés comme le bas, milieu et haut de la boîte. Les barres d'erreur représentent l'écart type sur trois expériences indépendantes. ** P <0,01 t de Student-test.
Figure 6. NFkB activité dépendante rapporteur de la luciférase dans les mouches individuels infectés par S. Des exemples représentatifs. marcescens de données brutes sont indiquées pour chaque mouches non infectées (commande traitée, panneaux de gauche) et les mouches infectées (panneaux de droite). Une lecture de base (temps '0 ') ont été recueillis immédiatement avant l'infection ou la manutention; tous les autrespoints dans le temps ont été recueillies après les mouches ont été traités. Notez les différences d'échelle dans les axes des ordonnées entre les mouches dans les conditions de contrôle infectés et manipulés. Une grande variation du signal à l'intérieur de chaque volée peut être attribuée au mouvement de la mouche à l'intérieur du puits.
Figure 7. L'infection par S. marcescens ou des blessures à injection aseptique augmente l'activité du rapporteur KB-luc de mouches vivantes. moyenne ± SEM activité de la luciférase (unités arbitraires) est relevée toutes les heures 4 à travers toutes les mouches qui ont été infectés (A) ou blessés par injection aseptique (B) et ont survécu jusqu'à à 24 dans le test. One-way ANOVA avec mesures répétées ont indiqué que l'activité du rapporteur augmenté de façon significative chez les personnes infectées (p <0,05), blessé (inj p <0,01), et leur con traitéescontrôle (HC, p <0,01) par rapport aux groupes de leur niveau de référence (temps '0 '; Tukey post-hoc). (Insertion, groupe A): Les données du groupe HC sont tracées à une échelle différente. L'augmentation faible mais significative de l'activité du rapporteur dans le groupe HC suggère que les mouches peuvent avoir vécu un stress modéré ou augmenté l'éveil de la manipulation (transfert depuis et vers la plaque de microtitration et équivalent anesthésie des mouches infectées). Les deux groupes les infectés et les blessés ont montré de fortes inductions de l'activité du rapporteur KB-luc qui étaient significativement plus élevée que dans le groupe HC à des points de temps indiqués * = p <0 .05, ** = p <0, 01;. T étudiant - essai; Pour (A) n = 20 et n = HC 13 infection, par (B) n = 15 et n = HC 14 blessure.
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Discussion
Ce protocole décrit une approche pour étudier la façon dont le comportement, en particulier dormir, est liée à des paramètres de la réponse immunitaire. Ces paramètres comprennent la charge bactérienne, les résultats de survie et l'activité NFKB, mesurée par un rapporteur luciférase in vivo. Ensemble, ces paramètres fournissent des informations sur la façon dont une mouche peut combattre une infection. Charge bactérienne et les résultats de survie sont des paramètres de la réponse immunitaire qui impliquent une mesure simple chez la drosophile. Rel E20 mutants, qui n'ont pas un facteur de transcription NFkB qui est au cœur de la réponse immunitaire, succombent rapidement à une infection bactérienne. Les manipulations génétiques ou d'autres comportements peuvent également influer sur ces paramètres de la réponse immunitaire, éventuellement en affectant l'activité NFKB lui-même. Par exemple, la privation de sommeil avant l'infection augmente l'expression de l'ARNm de Relish, et réduit ufc / à la mouche par rapport aux non-privés commandes 11. Mutants des gènes de l'horloge, la période de 7 et intemporelle 8, ont également été signalés pour réduire la survie lors d'une infection ainsi que la clairance bactérienne 8. D'autres études qui utilisent cette approche devrait donner un aperçu de la façon dont le comportement mécanique peut influer sur la fonction immunitaire.
La procédure d'injection / infection que nous décrivons ici est modifiée à partir d'une méthode décrite précédemment par Wu et al 16. Cette procédure est simple et peu coûteux. Toutefois, un inconvénient est que la commande manuelle de volume d'injection à l'aide d'un colorant à titre d'indicateur est brut et peuvent contribuer à la variabilité. D'autres groupes ont utilisé un micro-injecteur pour permettre un volume d'injection constante de 17, ou ont poignardé les mouches avec une aiguille trempée dans une culture bactérienne 18. Néanmoins, la méthode présentée ici a été un succès dans la détection des modifications de la clairance bactérienne dans des conditions expérimentales 11,19 </ Sup>.
La survie des mouches lors de l'infection est généralement quantifiée par comptage des mouches restantes à intervalles réguliers programmés. Ici, nous utilisons le système DAM Trikinetics pour surveiller le temps de la mort chez les mouches individuelles, ce qui est indiqué par la cessation d'activité. Nous avons vérifié que les résultats de survie tel que déterminé par l'activité locomotrice est la même que celle déterminée par inspection visuelle des mouches dans les tubes de l'activité au cours de l'infection (non publié). Cette méthode a également été utilisée précédemment pour mesurer la durée de vie 20,21. Cependant, il est important de noter que l'évaluation de la survie dans le système de DAM se limite à celle des mouches isolées, et que les résultats issus de cette condition devraient être différentes de celles dans des conditions groupées. Les premières études ont montré des différences de survie lorsque l'hôte est placé dans des groupes en fonction des conditions d'isolement 22. Des travaux récents ont également confirmé que la durée de vie dans des groupes de mouches est plusque chez les mouches isolées 20.
Activité rapporteur de la luciférase a été utilisé précédemment pour l'analyse de l'expression des gènes horloge de mouches vivantes (par exemple, ref 23). Dans ces cas, d'autres considérations techniques sont nécessaires, notamment l'épuisement du substrat luciférine qui se déroule sur plusieurs jours de réalisation du test. En revanche, l'essai décrit ici est limitée à la survie des mouches infectées et a impliqué une mesure simple de plus de 24 heures après l'infection. Une analyse de variance à mesures répétées a été suffisante pour évaluer les changements de base au sein de chaque groupe. Approches statistiques pour l'analyse d'une oscillation circadienne des journalistes luciférase, avec étapes de normalisation pour corriger l'appauvrissement de substrat soient discutées ailleurs 24. Dans les deux cas, la mesure de l'activité du rapporteur en temps réel de mouches individuelles est une méthode plus efficace pour extraire des informations sur ses dynamiques temporelles de standard essais biochimiques et immunohistochimiques.
Cependant, un inconvénient potentiel à surveiller l'activité du rapporteur luciférase in vivo, c'est qu'il est dépendant de mouches mangent le substrat luciférine. L'anorexie a été associée à l'infection chez les mouches, et les repas peuvent également varier en fonction du type d'infection ou entre les génotypes 25. Pour contourner préoccupé par l'ingestion du substrat, les mouches peuvent être disséqués dans différentes parties du corps ou des tissus suite à une infection, et l'activité du rapporteur peut être mesurée en culture comme décrit précédemment 26. Sinon, les résultats du dosage de la luciférase peut aussi être vérifiée à l'aide d'un test standard qui ne repose pas sur l'alimentation. Par exemple, la PCR quantitative a été une approche couramment utilisée pour mesurer les niveaux d'expression d'un peptide antimicrobien (AMP) ARNm. SAP sont des cibles connues de NFkB, et donc d'indiquer son niveau d'activité.
Le représentant datdécrit ici une récapitulation des travaux antérieurs montrant que NFkB augmente avec défi immunitaire et une augmentation subséquente de sommeil 2. Cependant, les lecteurs sont avertis que le sommeil dans le système DAM Trikinetics est indiqué par l'inactivité pendant une période minimale de cinq minutes consécutives 27. Mesure du sommeil chez la mouche par vidéographie s'appuie également sur l'inactivité 28. Cette définition sommeil chez les mouches peuvent potentiellement poser des problèmes lors d'une infection, car il est également connu que les animaux contestées immunitaires deviendra inactif pendant de longues périodes sans sommeil 29. Pour surmonter ce problème, des essais que la réactivité sensorielle mesure nécessaires pour vérifier que les mouches sont en effet endormi. Les enquêteurs ont déterminé la réactivité des mouches aux stimuli sensoriels, comme un robinet 30 crayon, se brosser les tubes activité avec un bâton en bois 31, ou de chauffage une extrémité d'un tube 27. Dans tous les cas, les mouches de sommeil sont moins sensibles (mesuréesoit par la latence de réponse ou en pour cent vole répondre en tant que groupe) que les mouches se réveillent. Nous avons constaté que les mouches infectées qui dorment sont en effet moins sensible aux stimuli sensoriels jusqu'à 6-8 heures après l'infection (Th. Kuo et JA Williams, observation non publiée). Malgré les limitations techniques, le système DAM Trikinetics procure un avantage à haut débit qui seront utiles pour de futures études chez les mouches qui explorent un lien génétique et moléculaire entre le sommeil et la fonction immunitaire.
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Disclosures
Aucun conflit d'intérêt déclaré.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par la National Science Foundation Grant # 1025627 IOS et par le National Institutes of Health en vertu subvention no 1R21NS078582-01 à JAW
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Incubators | Percival Scientific, Inc. | I30BLLC8 I36VLC8 |
Any incubator capable of running programmed light/temperature schedules is appropriate. |
| Drosophila Activitiy Monitors | Trikinetics Inc., Waltham, MA | DAM2 | As described elsewhere6, this system requires a computer interface, software, and other accessories. |
| Pyrex Glass Tubes | Trikinetics Inc., Waltham, MA | PGT-5x65 | |
| Microplate scintillation and luminescence counter | Perkin Elmer | TopCount NXT 12 detector |
Any microplate reader capable of detecting luminescence can be used for this type of reporter assay. TopCount contains multiple detectors and an automated stacker; it is capable of being programmed to read continuously from multiple plates. |
| FluorChem 8900 | Alpha Innotech | Imaging of bacterial cultures is optional; any digital imaging system with visual light capability is sufficient. | |
| Micropipette Puller | Tritech Research, Inc. | Narishige PC-10 | |
| Supplies | |||
| Borosilicate Glass Capillaries | World Precision Instrument Inc. | 1B100F-4 | |
| 3 ml Syringe | Fisher Scientific | BD 305482 | |
| Syringe Needles | Fisher Scientific | BD 305196 | 18 G - cut off the tip of the needle to prevent damage to the tubing. |
| Silicone Tubing, i.d. (0.030") o.d. (0.065") Wall Thickness (0.018") | VWR | 60985-706 | Used for attaching glass capillary needles to a syringe |
| 3 Way Stopcock | American Pharmaseal Company | K75 | |
| Kontes Pellet Pestle Cordless Motor | Fisher Scientific | K749540-0000 | |
| Kontes Pellet Pestle | Fisher Scientific | K749521-1590 | |
| Glass balls 3mm | VWR | 26396-630 | |
| Microplate Microlite 1+ | Thermo Scientific | 7571 | Select 96-well plates that are appropriate for luminescence - they must be opaque. |
| TopSeal-A:96-well Microplates | PerkinElmer | 6005185 | Microplate Press-On Adhesive Sealing Film |
| D-Luciferin, Potassium Salt | Gold BioTechnology, Inc. | LUCNA | |
| Software | |||
| Insomniac2 | Available upon request to the authors | custom; written by Lesley Ashmore, Ph.D. (Westminster College) | Matlab based software that has been used routinely for analysis of sleep2,6,11 |
| Drosonex | Available upon request to the authors | custom; written by Thomas Coradetti (Sidewalk Software) | A PC MSVC6 program used for survival analysis from raw data files collected with the Trikinetics system |
| Photoshop CS3 | Adobe | Useful for obtaining numbers of cfu/plate from digital images (optional) | |
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