Summary
Um eine Verbindung zwischen der Immunantwort und Verhalten zu verstehen, beschreiben wir eine Methode, um Bewegungs-Verhalten zu messen
Abstract
Eine komplexe Wechselwirkung zwischen der Immunantwort und Host Verhalten wurde in einer Vielzahl von Arten beschrieben worden. Überschüssiges Schlaf, insbesondere, ist bekannt, als Reaktion auf eine Infektion in Säugern 1 auftreten und kürzlich auch in Drosophila melanogaster 2 beschrieben. Es ist allgemein anerkannt, daß der Schlaf nützlich zum Host während einer Infektion ist, und dass es für die Beibehaltung einer robusten Immunsystems 3,4 wichtig. Jedoch gibt experimentelle Hinweise, dass diese Hypothese unterstützt begrenzte 4, und die Funktion des Schlafes Überschuß bei einer Immunantwort bleibt unklar. Wir haben einen multidisziplinären Ansatz verwendet, um dieses komplexe Problem anzugehen, und habe durchgeführten Studien in der einfachen genetischen Modellsystem der Fruchtfliege Drosophila melanogaster. Wir verwenden eine Standard-Test zur Messung lokomotorische Verhalten und schlafen in Fliegen, und zeigen, wie dieser Test verwendet wird, um das Verhalten der Fliegen infecte messend mit einem pathogenen Stamm von Bakterien. Dieser Assay ist auch nützlich zur Überwachung der Dauer des Überlebens in einzelnen Fliegen während einer Infektion. Zusätzliche Maßnahmen der Immunfunktion umfassen die Fähigkeit der Fliegen, um eine Infektion und die Aktivierung von NFkB, ein wichtiger Transkriptionsfaktor, der von zentraler Bedeutung für die angeborene Immunantwort in Drosophila ist klar. Sowohl das Überleben Ergebnis und bakterielle Clearance während der Infektion zusammen sind Indikatoren für Widerstand und Toleranz gegenüber Infektionen. Widerstand bezieht sich auf die Fähigkeit der Fliegen, um eine Infektion zu löschen, während Toleranz als die Fähigkeit des Wirts, um eine Beschädigung von einer Infektion zu begrenzen und dadurch trotz hoher Pathogen innerhalb des Systems 5 überleben definiert ist. Echtzeit-Überwachung von NFKB Aktivität während der Infektion gibt einen Einblick in einen molekularen Mechanismus des Überlebens während der Infektion. Die Verwendung von Drosophila in diesen einfachen Tests erleichtert die genetische und molekulare Analysen des Schlafesund die Immunantwort und wie diese beiden komplexen Systemen wechselseitig beeinflusst.
Protocol
Dieses Protokoll verwendet zwei Setups (Abbildung 1) zu vier verschiedenen Anzeigen von Fliegen, die einer bakteriellen Infektion gesammelt erwerben. Diese Ausgänge sind 1) Schlaf / Wach-Verhalten; 2) das Überleben Ergebnis; 3) Keimbelastung in der Fliege, und 4) Echtzeit-Messung von NFKB Reporter Aktivität in vivo. In Kombination mit den genetischen Werkzeuge, die verfügbar sind in Drosophila, bieten diese Messungen mechanistischen Einblick in die molekulare Verbindung zwischen Immunfunktion und Verhalten.
Ein. Measure Bewegungsaktivität und Hotels in Flies
- Das Setup verwendet, um Bewegungsaktivität zu messen und Hotels in Fliegen, die auch die Drosophila Activity Monitoring System (DAM2, Trikinetics), Inkubatoren, dunklen Raum, und die Vorbereitung der Versuchstiere und Aktivität Röhren, wurde bereits 6 beschrieben. Der gleiche Ansatz wird hier, mit einigen geringfügigen Änderungen verwendet.
- Aktivität Röhrchen werden zur Wiederverwendung durch Kochen auf einer Heizplatte in entionisiertem Wasser gereinigt. Eine geringe Menge an Detergens für das erste Kochen zugesetzt werden Rohre gut gespült und kochte noch zweimal. Wenn Garn verwendet wird, um das Rohr anschließen, können verwendet Aktivität Rohre (Aufnahme von Lebensmitteln, Wachs, Fliegen und Garne) ohne vorherige Entfernung des Garns gereinigt werden.
- Vor Beginn eines Experiments, inszeniert Ort Kulturen mit späten Puppenstadium Fliegen in Inkubatoren für drei bis vier Tage an experimentelle Beleuchtung und andere Umweltbedingungen anzupassen. Light: dunkel oder konstanten Bedingungen wurden häufig verwendet, um das Schlafverhalten messen. In diesem Beispiel werden entfernt, um konstantes Licht, um den Einfluss der circadianen Uhr auf die Immunantwort und Verhalten 2,7,8 eliminieren akklimatisiert. Wie in 1A beschriebenen 6 und Rekord für ein Minimum von drei Tagen beschrieben vor der Infektion.
2. Infect Fliegen mit einem pathogenen Stamm von Bakterien
- Das hier beschriebene Protokoll ist spezifisch für S. marcescens, die einfach zu züchten und zu warten sind. Protokolle für Langzeitspeicherung und Kulturbedingungen für andere bakterielle Spezies variieren. S. marcescens in 15-50% Glycerin bei -80 ° C gelagert Um für die langfristige Lagerung vorbereiten, mischen 2 Volumina Nacht Bakterienkultur (OD 600 = 0,5 - 1,0) bis 1 Volumen autoklavierten 50% Glycerin in 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen. Diese werden in einem abschließenden Glycerinkonzentration von 17% führen. Röhrchen bei -80 ° C. Um einen kurzfristigen in-use Quelle von Bakterien vorzubereiten, kratzen die gefrorenen Aktie mit einem sterilen 200 ul Pipettenspitze und führen eine Drei-Wege-Streifen auf einer LB-Agarplatte. Inkubieren Sie die Platte über Nacht bei 37 & dzB, C, um isolierte Kolonien zu erhalten. Bewahren Sie die Platte bei 4 ° C.
Einen Tag vor der geplanten Infektion, wählen Sie eine einzelne Kolonie von der LB-Agar-Platte mit einem sterilen 200 ul Pipettenspitze und tauchen die Spitze in einer Kultur Röhrchen mit 5 ml LB-Medium. Bakterien wachsen über Nacht, oder bis zu 16 Stunden innerhalb eines Inkubationsschüttler bei 37 ° C und 250 rpm bis zum Erreichen der exponentiellen Wachstumsphase. Messen der Konzentration mit einem Spektrophotometer bei OD 600. Die Konzentration in dieser Phase im Bereich von 0,5 zu 1 beträgt. Ist die Konzentration zu hoch ist, subkultivieren Bakterien und wachsen noch mehrere Stunden, um eine optimale Konzentration zu erhalten. Führen Sie das Verfahren in der Nähe einer Flamme Quelle. Einige Bakterienstämme für Antibiotikaresistenz konstruiert und gezüchtet werden und ausgewählt geeigneten Antibiotika zu dem Medium hinzugefügt. S. marcescens (ATCC # 8100) sind keine Antibiotika-resistente und werden daher in sterilen Medium ohne Antibiotikum gezüchtet. Um sterile Technik überprüfen, gehen Sie ein Mock cultuerneut ohne Bakterien als Kontrolle.
Die Lösung, um Fliegen zu infizieren enthält Bakterien (verdünnt auf OD 600 = 0,1) und 1% Lebensmittelfarbe (Brilliant Blue FCF) in PBS. Bereiten Sie eine Lösung zur Injektion Kontrolle, indem äquivalente Menge LB-Medium in Infektion Lösung und 1% blaue Lebensmittelfarbe in PBS verwendet. Store Solutions auf Eis. - Bereiten Glasnadeln zum Einspritzen die Fliegen. Ziehen Sie Glaskapillaren (od = 1 mm, id = 0,58 mm, WPI) zu einer feinen Spitze mit einem Feinpipettenziehvorrichtung (Narishige). Unter einem Präpariermikroskop, verwenden feinen Pinzette zum Abbruch der Spitze der Nadel, so daß die Öffnung groß genug ist, um mit Injektionsflüssigkeit durch Saugwirkung mit einer Spritze zu füllen, aber klein genug, um eine Beschädigung der Fliege während der Injektion zu minimieren. Nach dem Bruch der Spitze, sollte die Spitze Größe ca. 40-50 um betragen. Das Glas Nadel wird zu einer 3 cc-Kunststoffspritze mit einem Länge Rohr befestigt. Der Fluss der Injektion Medium manuell gesteuert Anwendung Überdruck oder suction mit der Spritze. Vermeiden Sie Verschmutzung der Gummischlauch mit Injektionsflüssigkeit, wie die Spritze Gerät sowohl für Infektionen und Kontrolle Injektionen verwendet wird.
- Anesthetize Fliegen, indem sie auf eine CO 2-Pad. CO 2 wird durch einen abgedichteten Behälter mit Wasser geleitet, um das Kissen zu befeuchten und um statische Elektrizität, die Manipulation der Fliegen an den Pad kann verkomplizieren reduzieren. Injizieren Fliegen durch Stossen das Glas Nadel in den Bereich oberhalb des Scutellum des dorsalen Thorax. Die Weitergabe der Injektion Medium in-the-fly durch die Lebensmittelfarbe überprüft - Fliegen drehen blau wie die Lebensmittelfarbe Spreads durch das System. Die Dosis von Bakterien, die Fliegen empfangen kann quantifiziert, wie in Abschnitt 3 beschrieben, weiter unten. Einige experimentelle Designs gehören eine Kontrollgruppe, die aseptische Verletzungen erhält durch die Injektion Fliegen mit PBS und Lebensmittelfarbe aber ohne Bakterien.
3. Bestimmen Sie die bakterielle Belastung
Ein Ansatz zur evaluating die Immunantwort gegen eine bakterielle Infektion ist, um die bakterielle Belastung nach der Infektion bestimmt. D. melanogaster ist ein großes Vorbild, um diesen Parameter zu bestimmen, weil die ganze Fliege kann homogenisiert, um die Summe der Keimzahlen innerhalb eines einzelnen zu schätzen. Das Grundprinzip hinter diesem Protokoll ist, wenn sie auf einem festen Medium wie Luria Broth (LB)-Agar in einer Petrischale (LB-Platte) gezüchtet, ein einzelnes Bakterium eine sichtbare unterscheidbare Kolonie bildet. Daher kann durch Homogenisieren infizierten Fliegen in LB-Flüssigmedium, Erzeugen von seriellen Verdünnungen des Homogenats und Spreizen des verdünnten Homogenat auf LB-Platten, kann die Anzahl der Bakterienzellen Infizieren einer Fliege bestimmt werden. Eine Kontrollgruppe von Fliegen mit PBS und Lebensmittelfarbe, aber ohne Bakterien injiziert sollte verwendet werden, um sicherzustellen, dass die Infektion nicht mit anderen bakteriellen Spezies kontaminiert werden. Es sollte keine Kolonien auf der LB-Agar-Platte in diesem Zustand sein.
- Autoklavieren alle Materialien, die dafür verwendet werden sollenVerfahren vor Durchführung der eigentlichen Homogenisierung Schritt. Dazu gehören 200 ul Pipettenspitzen mit einer Schere, LB Medien und Stößel für die Homogenisierung verwendet geschnitten. Bereiten Platten durch Gießen autoklavierten LB / Agar-Medium in 10 cm sterile Petrischalen mindestens 1 Tag vor Homogenisieren Fliegen.
- Anesthetize sammeln und fliegt in 1,5 ml Reaktionsgefäße und Shop Röhrchen auf Eis.
- Führen Sie die Homogenisierung in der Nähe einer Flamme, um eine Kontamination zu verhindern. Eine Steuerung Homogenisierung mit Fliegen ohne Infektion wird empfohlen, insbesondere bei Verwendung eines Bakterienstamm wie S. marcescens, die nicht Antibiotikum resistent. Homogenisieren ein Minimum von 2 Gruppen von 10 Fliegen pro Tier experimentellen Zustand. Die Zahl der Fliegen pro Homogenat verwendet wird vom Experimentator bestimmt. Einige Gruppen haben eine Fliege pro Homogenat verwendet, was nützlich ist, zum Auswerten Variation zwischen einzelnen bakteriellen Belastung entfernt 8, während andere 3-10 Fliegen pro Homogenat verwendet habenum über Genotyp oder experimentelle Bedingung 9-12 vergleichen.
- Fügen Sie 400 ul LB-Medium zu jedem Mikrozentrifugenröhrchen mit Fliegen und homogenisieren mit einem kleinen Motor und Stößel (Kontes).
- Mit sterilisiert geschnitten Pipettenspitzen verdünnen serielle das Homogenat 1.10 durch Zugabe von 20 ul homogenisierte LB / bakterielle mittel-bis 1,5 ul Mikrozentrifugenröhrchen mit 180 ul LB-Medium. Schneiden Pipettenspitzen verhindert das Blockieren von fly Schutt und stellt sicher, dass ein geeignetes Volumen wird übertragen.
- Verdünnungsfaktor wird empirisch bestimmt und hängt von der Genotyp des fliegen, der Bakterienstamm verwendet, und experimentellen Bedingungen. Für Wildtyp Fliegen mit S. infiziert marcescens, verwenden Verdünnungen von 1:10 oder 1:10 3 2 für Fliegen sofort nach der Infektion homogenisiert und Verdünnungen von 1:10 oder 1:10 4 5 für Fliegen homogenisiert 24 h nach der Infektion.
- Fügen Sie 100 ul LB / bakterielle Medium aus der microcentrifuge Röhrchen mit dem Endverdünnung und verteilt das Medium auf einer LB-Platte unter Verwendung von Glaskugeln (VWR), um eine gleichmäßige Verteilung zu gewährleisten.
- Entsorgen Sie die Glaskugeln in 100% EtOH Lösung. Legen Sie die LB-Platten in einem 37 ° C Inkubator über Nacht.
- Als optionaler Schritt, verwenden ein Abbildungssystem mit sichtbarem Licht, um ein Bild der LB-Platten (FluorChem 8900; Alpha Innotech) zu erhalten. Zählen der Anzahl von Kolonien entweder auf der Platte selbst oder aus dem Bild der Platte mit dem Werkzeug auf das Zählen Photoshop Software (Adobe Photoshop CS3).
- Berechnen der Anzahl der Kolonie-bildenden Einheiten pro Fliege unter Verwendung der Formel: [n / (N * T * v)] * V, wobei n = Anzahl der Kolonien auf dem LB-Platte gezüchtet, N = die Anzahl der Fliegen in einem gepoolten Mikrozentrifugenröhrchen, D = Verdünnungsfaktor, und v = Volumen der Lösung auf jeder Platte zu verbreiten; V = ursprüngliches Volumen der Homogenat.
4. Bewerten Sleep and Survival-Dauer nach der Infektion
- FürFliegen, die nicht für die Messung bakterielle Belastung geerntet werden, weiterhin überwachen Verhalten für weitere 7-10 Tage. Überlebensdauer von Genotyp der Fliege, die Umgebungsbedingungen beeinflusst und Bakterienarten für die Infektion verwendet.
- Nach ca. 10 Tagen zu kündigen das Experiment, herunterzuladen und zu verarbeiten Verhaltensdaten wie zuvor 6 beschrieben. Insomniac2 kundenspezifische Software, die in Matlab basiert, wird verwendet, um Schlaf-Parameter zu analysieren. Es ist wichtig zu toten Fliegen aus der Verhaltensanalyse eliminieren. Normalerweise schränkt dies Analysen innerhalb der ersten Tage nach der Infektion, je nach Art der Infektion und Fliege Genotyp. Tod im Assay wird durch die Zeit alle Aktivitäten zählt Null erreicht angegeben haben. Um die Analyse des Überlebens zu erleichtern, Drosonex, kundenspezifische Software in Microsoft Visual C + + 6.0, wird verwendet, um Rohdaten aus dem Trikinetics DAM-System zu verarbeiten. Die Software-Berichte als Excel-Dateien, Überleben Dauer jedes fly (in Stunden), kompiliert Aktivität data von allen Monitoren in einer einzigen Tabelle, und meldet die prozentuale fliegt überlebende im Laufe der Zeit, wie sie durch den Benutzer. Die Excel-Dateien sind zum Einbau in andere statistische Software-Pakete für die weitere Analyse zu integrieren.
5. Messen NFKB Aktivität während der Infektion mit einem Luciferase Reporter Assay
Transgene Fliegen kappaB-luc in diesem Test verwendet wurden erzeugt, wie in vorher Kuo et al., 2010 2. Kurz gesagt, enthält die KB-luc Reporter 8 Wiederholungen einer NFKB Bindungssequenz, die in einen Promotor eingefügt wurden stromaufwärts eines Luciferase offenen Leserahmens.
- Passen Fliegen zu experimentellen Lichtverhältnissen, wie in Abschnitt 1.2 beschrieben. In diesem Beispiel sind 1-4 Tage alte kappaB-luc Fliegen in Fläschchen, die eine 5% Saccharose, 2% Agar Nährboden und in Gleichlicht (LL) für 2 Tage, um die gleiche Alter als andere während der Infektion entfernt erreichen untergebracht.
- Bereiten Sie eine 96-well Mikrotiterplatten für Fliegen. Jede Vertiefung enthält 2 Schichten von Lebensmitteln Medium (Abbildung 2), die obere Schicht enthält Luciferin, das Substrat der Luciferase. Fügen Sie 300 ul einer 5% Saccharose, 2% Agar-Lösung in jede Vertiefung und lassen Sie sich zu verfestigen. Weiter, einen 50 ul Deckschicht zu jedem Well, enthaltend 5% Sucrose, 1% Agar, und 2 mM Luciferin (Gold Biotechnology, Inc.). Luciferin Konzentrationen für Mess-Reporter-Aktivität in Drosophila verwendet wurden in der Literatur unterschiedlich und haben so niedrig wie 100 uM 13 gewesen. Die erforderliche Konzentration kann empirisch ermittelt werden. Zwischen Abgabe der Lebensmittel Schichten, decken Sie die Platte mit einem feinmaschigen Gewebe zu erleichtern Trocknen unter Beibehaltung Sterilität. Die Platte sollte gründlich trocknen gelassen werden, bis zu einer Stunde, um Fliegen aus immer in Kondensationstropfen steckenbleiben. Da Luciferin ist lichtempfindlich, vermeiden Platten mehr als nötig leuchten.
- Tragen Sie eine klare Klebefolie (Top-Seal-A; Perkin Elmer) in eine 96-well-Mikrotiterplatte und perforierten mit einer feinen Nadel in einer Menge von 2 Löcher pro Vertiefung. Diese Löcher werden nicht nur ermöglichen Luftaustausch in jede Vertiefung, sondern auch eine Möglichkeit, um Fliegen auf einer individuellen Basis zu betäuben. Mit einem scharfen Messer und Lineal, stellen einen Schnitt zwischen den einzelnen Spalten. Dies wird eine einfache Möglichkeit zum Laden / Entladen Fliegen in Gruppen von 8 zu einem Zeitpunkt.
Um Fliegen in die Mikrotiterplatte zu laden, entfernen Sie die Fläschchen aus dem Inkubator und betäuben Fliegen auf einen CO 2-Pad. Last fliegt ein-by-one zu jeder Vertiefung Spalte für Spalte. Sollte ein Versehen fliegen Klebe-/Dichtungsmasse stecken, lassen die Fliege allein, wie sie oft in der Lage, sich ohne Intervention befreien. Bringen Sie die Mikrotiterplatte in den Inkubator in LL für 8-24 Stunden an die neue Umgebung anzupassen und die Luciferinsubstrat verbrauchen. - Kultur Bakterien, S. marcescens, und bereiten eine Lösung für eine Infektion wie oben beschrieben.
- Betäuben tfliegt er mit einer Mikropipette Spitze an einer Niederdruck-CO 2-Leitung. Legen Sie die Mikropipettenspitze direkt über den Lüftungsöffnungen für jeden gut gemacht. Vorsicht geboten, um zu gewährleisten, dass der CO 2-Druck hoch genug, um die Fliege betäuben, aber niedrig genug, um eine Verletzung des fly vermeiden. In Gruppen von acht einzeln übertragen jede Fliege zu einer CO 2-Pad, und infizieren wie oben beschrieben. Nach der Infektion wieder jede Fliege auf seine ursprüngliche gut und versiegeln Sie den Mikroplatten.
- Maßnahme Lumineszenz (TopCount NXT-Lumineszenz und Scintillation Counter; Perkin-Elmer). Die Lumineszenz TopCount Zähler enthält eine Stapelkassette für Platten, die für den programmierten und automatisierte Messungen ermöglicht kontinuierlich an gewünschten Inkremente für längere Zeit (in der Regel bis zu fünf Tagen). Diese Funktion ist nicht auf allen Instrumenten und Datenerfassung für Experimente mit anderen Instrumenten durchgeführt werden daher seltener. Die Lumineszenz-Zähler in einem ro untergebrachtom mit einer kontrollierten Temperatur und Beleuchtung Zeitplan. Beim Laden Platten in die Stapelkassette, stapeln Sie die Platten mit den Fliegen zwischen klaren Blindplatten um sicherzustellen, dass Fliegen Licht zu empfangen. Programm das Luminometer nach den Angaben des Herstellers zu sammeln Lesungen jede Stunde für ein Minimum von 24 Stunden. In diesem Beispiel werden die Detektoren programmiert, um alle Vertiefungen für 10 sec zu lesen und das Ergebnis als Zählungen (willkürliche Einheiten) pro Sekunde abzugeben. Dieser Wert wird auf 3 Lesungen pro Vertiefung gemittelt. Exportieren Sie die Dateien in ein Tabellenkalkulationsprogramm und führen Sie eine Standard-Analyse, grafische Darstellung der Ergebnisse der Lumineszenz.
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Representative Results
- Infektion fördert den Schlaf. In diesem Beispiel, Canton-S (CS) Wildtyp Mutante Fliegen und Fliegen fehlt ein NFKB Gens, Relish (Rel E20) 14 wurden in zwei DAM2 Aktivitätsmonitore geladen (n = 32 für jeden Genotyp) infiziert und, wie oben beschrieben. Fliegen wurden in konstantes Licht, um den Einfluss der circadianen Uhr auf Verhalten und Infektion zu eliminieren 2,7,8 aufrechterhalten. Die Rel E20 Mutanten wurden CS isogenized wie zuvor beschrieben 11. Beide Sätze von Fliegen wurden mit S. infiziert marcescens und die Ergebnisse sind in Abbildung 3 dargestellt. In einigen Fällen ist eine zusätzliche gehandhabt Kontrollgruppe nützlich zum Differenzieren Wirkungen der Behandlung von Auswirkungen der Infektion 2. Handled Kontrollgruppen werden zu den gleichen Veränderungen der Umwelt wie die infizierten Gruppen, die Entfernung von Inkubatoren und Betäubung für die gleiche Zeitdauer umfasst ausgesetzt, aber sie nicht erhalten eine Injektion. Jedoch wird in diesem Beispiel ist es klar, dass Rel E20 Mutanten weniger Schlaf als CS-Steuerinformationen fliegt nach Infektion (3A) zu erfahren. Wie zuvor beschrieben 6, gibt es andere Parameter, die Verhaltensänderungen der DAMS Assay gemessen werden kann. Dazu kann auch die Gesamtaktivität Zählungen pro Zeiteinheit (3B). In diesem Beispiel ist die Änderung der Aktivität nach der Infektion der Spiegel, dass Schlaf. Außerdem berichten wir Erwerbsquote oder Aktivität Zählungen pro wache Minute (3C). Dieser Parameter ist ein Indikator für Bewegungsapparates Fähigkeit Fliegen. In diesem Fall müssen Aufwachen Erwerbsquoten weder in Genotyp ändern während der Infektion, die, dass die Reduktion der Aktivität oder Erhöhung der Schlaf ist nicht eine Folge der reduzierten motorischen Fähigkeiten schlägt.
- 4A zeigt die Überlebensrate nach Infektion. Im Einklang mit früheren Befunden 14,15, Rel E20 Mutanten schnell erliegen die infektion zu Wildtyp-Fliegen verglichen. Die meisten Fliegen die aseptische Kontrolle Injektion (4B) überlebt, was darauf hinweist, dass Fliegen die Infektion und nicht auf die Verletzungsgefahr durch die Injektion erlegen. Da die Relish Mutanten starb so schnell, wurden nur CS Fliegen verwendet, um bakterielle Belastung nach der Infektion (Abbildung 5) zu demonstrieren. Abbildung 5 zeigt, dass S. marcescens weiterhin in the fly 24 h nach Infektion proliferieren.
- Luciferase-Reporter-Aktivität wird über die Zeit in dem Assay in vier einzelnen Fliegen (Abbildung 6) dargestellt. Große Unterschiede zwischen den Datenpunkten und individuellen Fliegen können den Fliegen bewegen in den Vertiefungen zugeschrieben werden. Obwohl die Signale von allen Geweben innerhalb des fly abgeleitet ist, ist nicht zu erwarten, dass jedes Gewebe würde die gleiche Menge an Signal auszusenden, und die Sicht des Gewebes zu dem Detektor fliegen würde wie die Züge variieren. In diesem Beispiel wurden entfernt und verglichen infiziertmit einem gehandhabt Kontrollgruppe. Fliegen, die starben, wurden aus der Analyse auf eine Gruppe von Fliegen in 7A gezeigt ausgeschlossen. Tote Fliegen werden durch visuelle Inspektion bestimmt. In dieser Fliegen, gibt es einen starken Rückgang in der Luciferase-Signal, sowie ein Rückgang der Signaländerung, was darauf hinweist, dass die Fliege bewegt sich nicht. KB-luc Reporteraktivität stetig steigt nach der Infektion (7A) und aseptische Verletzung (7B ). Die Reporter-Aktivität Gipfel rund 12 Stunden nach der Verletzung und nach der Infektion. Sowohl genetische und / oder Verhaltensstörungen Manipulationen Fliegen wird erwartet, dass KB-luc Reporter-Aktivität während der Infektion zu ändern. Zum Beispiel haben wir zuvor beschriebenen 2, dass die Induktion von KB-luc Reporter-Aktivität weitgehend abgeschwächt war während der Infektion in Rel E20 Mutanten, was auf diesem KB-luc-Reporter ist spezifisch für NFkB.
Abbildung 1. Flussdiagramm, das die wichtigsten Schritte des Messens der Immunantworten in Drosophila umreißt (A) Die Reihenfolge der Schritte ist für die Messung Schlaf, Überleben und bakterielle Belastung während einer Infektion skizziert;. (B) Die Reihenfolge der Schritte ist für die Messung NFKB-abhängigen umrissen Luciferase-Reporter-Aktivität während der Infektion. Experimente kann überall weiter bei 1-5 Tage in Abhängigkeit von der Letalität von Bakterienarten verwendet.
Abbildung 2. Schematische Darstellung eines einzelnen Mikrotiterplatten. Flies in opak, 96-Well-Platten mit mittleren und bedeckte wie gezeigt gesetzt. Weil Fliegen individuell behandelt werden infiziert werden, ist es wichtig, to die Zahl der von Fliegen pro Platte zu einer Menge, die vernünftigerweise innerhalb einer gegebenen Zeitspanne verwaltet werden können, abhängig von den experimentellen Bedingungen.
Abbildung 3. Behavior Reaktion der Fliegen mit S. infiziert marcescens. (A) Mittelwert ± SEM Prozent der Zeit damit verbracht Schlaf-und (B) Mittlere fliegt ± SEM Gesamtaktivität Zählungen werden in 4 h-Schritten für 1 Tag vor und nach der Infektion mit S. aufgetragen marcescens. (C) Mittelwert ± SEM Aktivität Zählungen pro wache Minute vor (BL = Baseline) und nach Infektion mit S. marcescens ist in 8 h-Schritten aufgetragen. Das Verhalten ist für Wildtyp-CS Fliegen, die für mindestens 24 Stunden nach der Infektion überlebt berichtet, und für immundefizienten Rel E20 fliegt that überlebten mindestens 8 Stunden nach der Infektion. n = 13 für CS und Rel E20. ** = P <0,01 und * = p <0,05, Student t - Test.
Abbildung 4. Das Ergebnis des von infizierten und nicht infizierten Fliegen. (A) Repräsentative Kaplan-Meier-Überlebenskurven sind sowohl für Wildtyp-CS und immundefizienten Rel E20 Fliegen, die mit S. infiziert wurden aufgetragen marcescens. p = 8.13x 10 -13, Log-Rank-Test. n = 31 für CS und n = 32 für Rel E20 Fliegen. (B) Repräsentative Kaplan-Meier-Überlebenskurven sind wie in (A) angegeben, sofern nicht entfernt empfangenen aseptischen Verletzung durch Injektion mit flüssigem Medium ohne Bakterien. Nahezu alle Fliegen überlebt aseptischen Verletzungen bis zum Ende der Versuche (60 h nach der Verletzung). p> 0,97, log rank-Test, n = 32 für CS und Rel E20 Fliegen.
Abbildung 5. Quantifizierung der bakteriellen Belastung in Fliegen mit S. infiziert marcescens. (A) Repräsentative Bakterienkultur von CS fliegt mit S. infiziert marcescens, die unmittelbar nach der Infektion (links) oder 24 Stunden nach der Infektion (rechts) geerntet wurden. Verdünnungsfaktoren sind unter jeder Abbildung angegeben. In diesem Beispiel wurden 10 Fliegen in 400 ul Lösung für jede Gruppe homogenisiert. 100 ul der letzten Verdünnung wurde auf jeder Platte verteilt. Die linke Platte enthält 29 Kolonie bildende Einheiten (KBE). Um cfu Berechnung / fliegen, teilen 29 cfu von [10 Fliegen * 0,001 (Verdünnungsfaktor) * 100 ul (Volumen Ausbreitung auf die Platte)], die 29 entspricht, und dann multiplizieren mit dem ursprünglichen Volumen von 400 ul = 11.600. Für diese spezielle Platte, haben wir einen Durchschnitt von 1,16 x 10 4cfu / fly. Die richtige Platte enthält 257 Kolonien. Mit der gleichen Formel, finden wir einen Durchschnitt von 1,03 x 10 6 cfu / fly. (B) Nach der Berechnung cfu / fly von jeder Platte in jeder experimentellen Bedingung erzeugen Box-and-Whisker-Plots, wie dargestellt. In diesem Beispiel sind der 25., 50. (Median) und 75. Perzentil als die untere, mittlere und obere der Box vorgestellt. Fehlerbalken stellen die Standardabweichung über drei unabhängigen Experimenten. ** P <0,01 Student-t-Test.
Abbildung 6. NFKB abhängigen Luciferase-Reporter-Aktivität in einzelnen Fliegen mit S. infiziert . und infizierten Fliegen (rechte Felder); marcescens Repräsentative Beispiele von Rohdaten werden für einzelne nichtinfizierten Fliegen (linke Felder gehandhabt Kontrolle) dargestellt. Eine Basislinie (Zeit '0 ') wurde unmittelbar vor Infektion oder Handhabung gesammelt, alle anderenZeitpunkten erhoben wurden nach Fliegen behandelt wurden. Beachten Sie die Unterschiede in der Skala in den y-Achsen zwischen Fliegen in den infiziert und behandelt Kontrollbedingungen. Große Variation des Signals innerhalb jedes fly kann, um die Bewegung der Fliege im Inneren der Mikrovertiefung zurückzuführen.
Abbildung 7. Eine Infektion mit S. marcescens oder Verletzungen mit aseptischen Injektion erhöht KB-luc-Reporter Aktivität in lebenden Fliegen. Mittelwert ± SEM Luciferaseaktivität (willkürliche Einheiten) wird alle 4 h über alle Fliegen, die infiziert wurden aufgetragen (A) oder verletzt durch Injektion unter aseptischen Bedingungen (B) und überlebte bis bis 24 im Assay. One-way ANOVA mit wiederholten Messungen zeigten, dass Reporter-Aktivität deutlich erhöht in infizierten (p <0,05), verletzt (inj; p <0,01), und ihre Handhabung control (HC; p <0,01) Gruppen bezogen auf den Ausgangszustand (Zeit '0 '; Tukey post-hoc). (Insert, Panel A): Daten aus dem HC-Gruppe auf einem anderen Maßstab aufgetragen. Der kleine, aber signifikante Erhöhung der Reporter-Aktivität in der HC-Gruppe schlägt vor, dass Fliegen kann milden Stress erlebt haben oder erhöhte Wachheit vom Handling (Transfer zu und von der Mikrotiterplatte und Betäubung entspricht infizierten entfernt). Sowohl die infizierten und verletzten Gruppen zeigten starke Induktionen kappaB-luc Reporteraktivität, die signifikant höher als der in der HC-Gruppe waren angegebenen Zeitpunkten * = p <0,05 0; ** = p <0,01 0;. Student-t - Test; Für (A) n = 20 und n = HC 13 Infektion, für (B) n = 15 und n = HC 14 Verletzungen.
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Discussion
Dieses Protokoll beschreibt einen Ansatz zu untersuchen, wie Verhalten, insbesondere schlafen, um die Immunantwort Parametern verknüpft. Zu diesen Parametern gehören bakterielle Belastung, Überleben Ergebnis und NFkB-Aktivität, wie durch eine Luciferase-Reporter in vivo gemessen. Zusammen stellen diese Parameter liefern Informationen darüber, wie gut eine Fliege kann eine Infektion zu bekämpfen. Bakterielle Belastung und Überleben Ergebnis sind Immunantwort Parameter, die eine einfache Messung in Drosophila beinhalten. Rel E20 Mutanten, die eine Transkriptionsfaktor NFkB, die zentral für die Immunantwort, erliegen rasch auf bakterielle Infektion fehlt. Genetische oder andere Manipulationen von Verhalten kann auch Einfluss auf diese Immunantwort Parameter, möglicherweise durch Wirkung NFKB Tätigkeit beruht. Beispielsweise Schlafentzug vor der Infektion erhöht die Expression von mRNA Relish und reduziert cfu / fly relativ zu nicht-benachteiligten Bedienelemente 11. Mutants der Uhren-Gene, Periode 7 und zeitlos 8, wurden ebenfalls berichtet, um das Überleben während einer Infektion sowie bakterielle Clearance 8 zu reduzieren. Weitere Studien, die diesen Ansatz verwenden sollen mechanistische Einblicke in Verhalten kann Immunfunktion auswirken bieten.
Die Injektion / Infektion Prozedur beschreiben wir hier von einer zuvor beschriebenen Verfahren von Wu et al 16 modifiziert. Dieses Verfahren ist einfach und kostengünstig. Jedoch ist ein Nachteil, dass die manuelle Steuerung der Einspritzmenge mit der Verwendung von Farbstoff als ein Indikator ist Roh und kann an Variabilität beitragen. Andere Gruppen haben eines Mikroinjektorkopfs verwendet werden, um einen konstanten Injektionsvolumen 17 zu aktivieren, oder haben erstochen Fliegen mit einer Nadel eingetaucht in Bakterienkultur 18. Dennoch hat die hier vorgestellte Methode wurde bei der Aufdeckung von Veränderungen in der bakteriellen Clearance auf experimentellen Bedingungen 11,19 erfolgreich </ Sup>.
Survival of Fliegen während der Infektion wird in der Regel durch das Zählen der verbleibenden Fliegen in regelmäßigen zeitlichen Abständen quantifiziert. Hier verwenden wir die Trikinetics DAM-System, um den Zeitpunkt des Todes in den einzelnen Fliegen, die durch die Einstellung der Tätigkeit angegeben wird überwachen. Wir haben festgestellt, dass das Überleben Ergebnis als durch Bewegungsaktivität ermittelt die gleiche wie die durch visuelle Inspektion von Fliegen in der Aktivität Rohre während der Infektion (unveröffentlicht) bestimmt wird. Diese Methode wurde auch bisher zur Messung Lebensdauer 20,21 verwendet. Es ist jedoch wichtig zu beachten, dass die Bewertung des Überlebens in der DAM-System zu der in isolierten entfernt ist begrenzt, und die sich aus dieser Bedingung abgeleitet werden voraussichtlich von denen in gruppierten Bedingungen. Frühe Studien haben Unterschiede in der Überlebensrate, wenn der Host in Gruppen gegenüber isolierten Bedingungen 22 angeordnet gezeigt. Neuere Arbeiten haben auch bestätigt, dass Lebensdauer in Gruppen von Fliegen mehrals die in isolierten Fliegen 20.
Luciferase-Reporter-Aktivität wurde bisher zur Analyse von Takt-Genexpression in lebenden Fliegen (zB Lit. 23) verwendet. In diesen Fällen sind auch andere technische Überlegungen notwendig, insbesondere der Abbau der Luciferinsubstrat die sich über mehrere Tage für die Testdurchführung erfolgt. Im Gegensatz beschriebene Assay Hier wird für das Überleben der infizierten entfernt begrenzt und beinhaltete eine direkte Messung über 24 Stunden nach der Infektion. Eine ANOVA mit wiederholten Messungen war ausreichend, um Veränderungen gegenüber dem Ausgangswert in jeder Gruppe zu beurteilen. Statistische Ansätze zur Analyse eine zirkadiane Oszillation Luciferase Reporter, zusammen mit einer Normalisierung Schritte um das Substrat Erschöpfung korrigieren sind vollständig an anderer Stelle diskutiert 24. In jedem Fall wird die Messung in Echtzeit Reporteraktivität in einzelnen entfernt ist ein effizienteres Verfahren zum Extrahieren von Informationen über seine zeitliche Dynamik als standard biochemische und immunhistochemische Assays.
Jedoch ist ein möglicher Nachteil der Überwachung Luciferase-Reporter-Aktivität in vivo, dass es abhängig von Fliegen isst das Luciferin-Substrat ist. Anorexiebehandlung mit Infektion in Fliegen in Verbindung gebracht, und Fütterung kann auch mit der Art der Infektion oder zwischen Genotypen 25 variieren. Besorgnis über Einnahme des Substrats zu umgehen, können Fliegen in separate Körperteile oder Gewebe nach der Infektion seziert werden, und Reporter Aktivität in Kultur gemessen werden, wie zuvor beschrieben 26. Alternativ können die Ergebnisse aus dem Luciferase-Assay auch überprüft mit einem Standard-Test, der nicht auf Fütterung angewiesen werden. Zum Beispiel wurde eine quantitative PCR wurde ein häufig verwendeter Ansatz zur Expression von antimikrobiellen Peptids (AMP) mRNA messen. AMPs sind bekannte Ziele NFKB, und deshalb geben den Grad der Aktivität.
Der Vertreter data hier beschriebenen rekapitulieren früheren Arbeiten zeigen, dass NFKB mit Immun-Herausforderung und eine anschließende Erhöhung im Schlaf 2 steigt. Allerdings sollte sich der Leser, dass der Schlaf in der Trikinetics DAM-System durch Inaktivität wird für mindestens fünf aufeinander folgenden Minuten 27 angegeben. Messung der Schlaf in der Fly-by-Videografie setzt auch bei Inaktivität 28. Dieser Schlaf Definition Fliegen kann möglicherweise während einer Infektion problematisch, weil es auch bekannt ist, dass Immunsystem herausgefordert Tieren wird inaktiv für längere Zeit ohne Schlaf 29. Um dieses Problem zu überwinden, Assays zur Messung von sensorischen Reaktionsfähigkeit zu prüfen, ob Fliegen tatsächlich schlafen. Forscher haben Reaktionsfähigkeit von Fliegen auf sensorische Reize, wie einen Bleistift Abgriff 30, Bürsten der Aktivität Rohre mit einem Holzstab 31 oder Erhitzen eines Endes eines Rohres 27 bestimmt. In allen Fällen sind schlafenden Fliegen weniger auf (gemessenentweder durch Latenz oder Prozent fliegt reagiert als Gruppe) als wach Fliegen. Wir haben festgestellt, dass infizierte Fliegen, schlafen ja weniger auf sensorische Reize gibt es bis 08.06 h nach der Infektion (TH. Kuo und JA Williams, unveröffentlichte Beobachtung). Trotz der technischen Einschränkungen stellt die Trikinetics DAM-System einen hohen Durchsatz Vorteil, die nützlich sind für zukünftige Studien in Fliegen, die eine genetische und molekulare Verbindung zwischen Schlaf und Immunfunktion erforschen.
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Disclosures
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde von der National Science Foundation unter dem Förderkennzeichen # IOS-1025627 unterstützt und von den National Institutes of Health unter dem Förderkennzeichen # 1R21NS078582-01 bis JAW
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Incubators | Percival Scientific, Inc. | I30BLLC8 I36VLC8 |
Any incubator capable of running programmed light/temperature schedules is appropriate. |
| Drosophila Activitiy Monitors | Trikinetics Inc., Waltham, MA | DAM2 | As described elsewhere6, this system requires a computer interface, software, and other accessories. |
| Pyrex Glass Tubes | Trikinetics Inc., Waltham, MA | PGT-5x65 | |
| Microplate scintillation and luminescence counter | Perkin Elmer | TopCount NXT 12 detector |
Any microplate reader capable of detecting luminescence can be used for this type of reporter assay. TopCount contains multiple detectors and an automated stacker; it is capable of being programmed to read continuously from multiple plates. |
| FluorChem 8900 | Alpha Innotech | Imaging of bacterial cultures is optional; any digital imaging system with visual light capability is sufficient. | |
| Micropipette Puller | Tritech Research, Inc. | Narishige PC-10 | |
| Supplies | |||
| Borosilicate Glass Capillaries | World Precision Instrument Inc. | 1B100F-4 | |
| 3 ml Syringe | Fisher Scientific | BD 305482 | |
| Syringe Needles | Fisher Scientific | BD 305196 | 18 G - cut off the tip of the needle to prevent damage to the tubing. |
| Silicone Tubing, i.d. (0.030") o.d. (0.065") Wall Thickness (0.018") | VWR | 60985-706 | Used for attaching glass capillary needles to a syringe |
| 3 Way Stopcock | American Pharmaseal Company | K75 | |
| Kontes Pellet Pestle Cordless Motor | Fisher Scientific | K749540-0000 | |
| Kontes Pellet Pestle | Fisher Scientific | K749521-1590 | |
| Glass balls 3mm | VWR | 26396-630 | |
| Microplate Microlite 1+ | Thermo Scientific | 7571 | Select 96-well plates that are appropriate for luminescence - they must be opaque. |
| TopSeal-A:96-well Microplates | PerkinElmer | 6005185 | Microplate Press-On Adhesive Sealing Film |
| D-Luciferin, Potassium Salt | Gold BioTechnology, Inc. | LUCNA | |
| Software | |||
| Insomniac2 | Available upon request to the authors | custom; written by Lesley Ashmore, Ph.D. (Westminster College) | Matlab based software that has been used routinely for analysis of sleep2,6,11 |
| Drosonex | Available upon request to the authors | custom; written by Thomas Coradetti (Sidewalk Software) | A PC MSVC6 program used for survival analysis from raw data files collected with the Trikinetics system |
| Photoshop CS3 | Adobe | Useful for obtaining numbers of cfu/plate from digital images (optional) | |
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