Summary
Чтобы понять связь между иммунной реакции и поведение, мы опишем метод измерения опорно-двигательного поведения в
Abstract
Сложное взаимодействие между иммунным ответом и принимающей поведения был описан в широком диапазоне видов. Превышение сна, в частности, как известно, происходит в ответ на инфекцию в организме млекопитающих 1 и также недавно были описаны в дрозофилы 2. Принято считать, что сон приносит пользу принимающей во время инфекции и, что очень важно для поддержания надежной иммунной системы 3,4. Однако экспериментальные доказательства того, что поддерживает эту гипотезу ограничено 4, а функция избыточного сна во время иммунного ответа остается неясным. Мы использовали комплексный подход к решению этой сложной проблемы, и провели исследования в простую генетическую модель системы, fruitfly дрозофилы. Мы используем стандартный тест для измерения опорно-двигательного поведения и сна у мух, и продемонстрировать, как этот анализ используется для оценки поведения мух infecteD с патогенным штаммом бактерии. Этот анализ также полезен для мониторинга продолжительность жизни в отдельных мухи во время инфекции. Дополнительные меры иммунной функции включают в себя возможность мух для очистки инфекции и активации NFκB, ключевой фактор транскрипции, который играет центральную роль в врожденного иммунного ответа у дрозофилы. Оба результата выживания и бактериальные инфекции во время оформления вместе являются показателями устойчивости и толерантности к инфекции. Сопротивление относится к способности мух для очистки инфекции, в то время как толерантность определяется как способность принимающего ограничить ущерб от инфекции и тем самым выжить, несмотря на высокий уровень возбудителя в рамках системы 5. В режиме реального времени мониторинг активности NFκB во время инфекции обеспечивает понимание молекулярного механизма выживания во время инфекции. Использование Drosophila в этих анализах просто облегчает генетические и молекулярные анализы снаи иммунного ответа и, как эти две сложные системы взаимно влияют.
Protocol
Этот протокол использует две установки (рис. 1) приобрести четыре разных показаний собранных от мух подвергается бактериальной инфекции. Эти мероприятия включают: 1) Режим сна / Пробуждение поведения; 2) выживаемостью, 3) бактериальной нагрузки в лету, и 4) в режиме реального времени измерения NFκB репортер деятельности в естественных условиях. В сочетании с генетическими инструментов, которые имеются у дрозофилы, эти измерения дают механистического понимания молекулярных связей между иммунной функции и поведение.
1. Измерение двигательной активности и сна у мух
- Установка для измерения двигательной активности и сна у мух, который включает в себя контроль Drosophila деятельности системы (DAM2, Trikinetics), инкубаторы, темная комната, и подготовка экспериментальных животных и деятельностью трубы, была описана ранее 6. Такой же подход используется здесь, с некоторыми незначительными изменениями.
- Деятельность трубы очищены для повторного использования путем кипячения на горячей плите в деионизированной воде. Небольшое количество моющего средства добавляют в первом кипения, трубы, хорошо промывают и варят в два раза больше. Если пряжа используется для подключения трубки, используемые деятельности труб (с едой, воск, мухи и пряжа) могут быть очищены без предварительного удаления пряжи.
- До начала эксперимента, место культур, содержащих поздней постановке куколки мухи в инкубаторе в течение трех-четырех дней, чтобы адаптироваться к экспериментальным освещения и других условий окружающей среды. Света: темный или постоянные условия были широко используется для измерения сна поведения. В этом примере мух приспособиться к постоянным светом для устранения влияния циркадных часов на иммунную реакцию и поведение 2,7,8. Как показано на рисунке 1а 6, и запись как минимум за три дня до заражения.
2. Infect мух с патогенный штамм бактерий
- Протокол, описанный здесь, является специфической для S. marcescens, которые легко выращивать и поддерживать. Протоколы для длительного хранения и культура условия для других видов бактерий будет меняться. С. marcescens хранятся в 15-50% глицерина при температуре -80 ° C. Для подготовки к длительному хранению, смешать 2 объема ночь бактериальной культуры (OD 600 = 0,5 - 1,0) на 1 объем автоклавного 50% глицерина в пробирки на 1,5 мл микроцентрифуге. Это приведет к конечной концентрации глицерина 17%. Хранить трубы при температуре -80 ° C. Для подготовки краткосрочных в использовании источник бактерий, очистить замороженного сырья с 200 мкл стерильной кончика пипетки и выполняют трехсторонний подряд на пластины агара LB. Инкубировать в течение ночи при 37 и Dнапример, C, чтобы получить изолированные колонии. Храните пластины при температуре 4 ° C.
За день до запланированной инфекции, выбрать одну колонию с пластинки агара LB с 200 мкл стерильной кончика пипетки и погрузите наконечник в пробирку, содержащую 5 мл LB среды. Рост бактерий на ночь, или до 16 часов в инкубаторе шейкере при 37 ° C и 250 оборотов в минуту, пока не достигнет экспоненциальной фазе роста. Измерение концентрации с помощью спектрофотометра при OD 600. Концентрация на этом этапе составляет от 0,5 до 1. Если концентрация слишком высока, субкультура бактерий и расти еще несколько часов, чтобы получить оптимальную концентрацию. Выполните процедуру, вблизи источника пламени. Некоторые штаммы бактерий разработаны для устойчивости к антибиотикам и выращиваются и выбраны соответствующие антибиотики добавляют в среду. С. marcescens (АТСС 8100), не устойчивых к антибиотикам, и поэтому, выращенные в стерильной среде без антибиотиков. Чтобы убедиться в стерильности, сделать макет cultuповторно без бактерий в качестве контроля.
Решение заражают мухи содержит бактерии (разбавляют до OD 600 = 0,1) и 1% пищевых красителей (бриллиантовый синий FCF) в PBS. Приготовьте раствор для инъекций контроль, добавляя эквивалентное количество LB среды, используемой в решении инфекции и 1% голубого пищевого красителя в PBS. Хранить решений на льду. - Подготовка стеклянной иглы для инъекций мух. Потяните стеклянных капилляров (OD = 1 мм, ID = 0,58 мм, WPI) в виде штрафа чаевые помощью микропипетки съемник (Narishige). В рассекает микроскопом, использовать тонкий пинцет, чтобы разорвать кончике иглы так, чтобы отверстие достаточно большой, чтобы заполнить с впрыском жидкости с применением всасывающих с помощью шприца, но достаточно маленький, чтобы свести к минимуму ущерб лету во время процесса впрыска. После разрыва кончик, наконечник размер должен быть около 40-50 мкм. Стекло игла прикреплена к 3 мл пластиковый шприц с длиной труб. Поток инъекции среды управляться вручную применения положительного давления или сuction со шприцем. Избегайте загрязнения резиновой трубки с впрыском жидкости, как шприц аппарате используется как для инфекций и контроль инъекций.
- Anesthetize мух, поставив их на CO 2 площадки. CO 2 проходит через герметичный контейнер с водой для увлажнения площадки и уменьшить статическое электричество, которое может затруднить манипуляции мухи на площадку. Inject мух, тыкая стекла иглы в область над щитком спинного грудной клетки. Принятие инъекции среды в лету проверяется пищевой краситель - мухи синей как пищевой краситель распространяется через систему. Доза бактерий, которые получают мухи могут быть определены, как описано в разделе 3 ниже. Некоторые экспериментальные проекты включают контрольную группу, которая получает асептической травмы, вводя мух с окраской PBS и еда, но без бактерий.
3. Определение бактериальной нагрузки
Один из подходов к evaluatinг иммунного ответа на бактериальные инфекции является определение бактериальной инфекции сообщение нагрузки. D. MELANOGASTER большой модели, чтобы определить этот параметр, потому что вся муха может быть гомогенизируют для оценки общей бактериальной номера внутри человека. Смысл этого протокола является то, что при выращивании на твердой среде, таких как бульон Лурия (LB) агара на чашки Петри (LB пластины), одна бактерия образует видимый различимые колонии. Таким образом, путем гомогенизации инфицированных мух в жидкой среде LB, создавая серийные разведения гомогената, а также распространение разбавленный гомогената на LB пластины, количество бактериальных клеток заражения муха может быть определена. Контрольную группу мух вводили PBS окраску и еда, но без бактерий следует использовать для проверки того, что инфекция не была загрязнена другими видами бактерий. Там не должно быть колоний на пластину LB агар в этом состоянии.
- Автоклав все материалы, которые будут использоваться для этогоПроцедура Перед выполнением реальный шаг гомогенизации. Это включает в себя 200 мкл наконечники вырезать ножницами, LB средства массовой информации, и пестики, используемых для гомогенизации. Подготовка пластин путем заливки автоклавного LB / агаровой среды в 10 см стерильные чашки Петри по крайней мере за 1 день до гомогенизации мух.
- Anesthetize и собирать мух в 1,5 мл микроцентрифужных труб и труб магазина на льду.
- Выполните гомогенизации вблизи пламени для предотвращения загрязнения. Контроль гомогенизации содержащие мухи без инфекции рекомендуется, особенно при использовании бактериальных штаммов, таких как S. marcescens, которые не являются устойчивых к антибиотикам. Однородный минимум на 2 группы по 10 мух каждый в экспериментальных условиях. Количество мух использоваться в гомогенат определяется экспериментатором. Некоторые группы использовали одну муху в гомогенат, что полезно для оценки изменений в бактериальной нагрузки между отдельными мухи 8, в то время как другие использовали от 3-10 мух на гомогенатдля сравнения по генотипу или экспериментальных условиях 9-12.
- Добавить 400 мкл среды LB, чтобы каждый микроцентрифужных пробирку с мухами и гомогенизации с помощью небольшого мотора и пестик (Kontes).
- Использование стерилизованных сократить наконечники, серийные разбавления гомогената 1:10 добавлением 20 мкл гомогенизированных LB / бактериальной среде до 1,5 мкл трубки микроцентрифужных содержащие 180 мкл среде LB. Резка наконечники предотвращает блокировку от мух мусора и гарантирует, что соответствующий объем передаются.
- Коэффициент разведения определяется опытным путем и зависит от генотипа лету, бактериальный штамм используется, и экспериментальные условия. Для дикого типа мухи инфицированных S. marcescens, используйте разведения 1:10 2 или 1:10 3 для мух гомогенизируют сразу после заражения, а также разведение 1:10 4 или 1:10 5 для мух гомогенизируют 24 часов после инфицирования.
- Добавить 100 мкл LB / бактериальной среды от микрофонаrocentrifuge пробирки, содержащие конечное разведение и распространение среды на LB пластины с использованием стеклянных шариков (VWR), чтобы обеспечить равномерное распределение.
- Откажитесь от стеклянных шариков в 100%-ном растворе этанола. Поместите LB пластины в 37 ° C инкубаторе в течение ночи.
- В качестве дополнительного шага, используйте системы формирования изображения с визуальными света для получения изображения LB пластины (FluorChem 8900; Альфа Innotech). Подсчет числа колоний либо на самой пластинки или из образа диск с помощью подсчета инструмент Photoshop программного обеспечения (Adobe Photoshop CS3).
- Рассчитайте количество колониеобразующих единиц на лету, используя формулу: [N / (N * D * V)] * V, где N = количество колоний, выросших на LB пластины, N = количество мух объединенных в одну микроцентрифужных трубы, D = коэффициент разбавления, и V = объем раствора наносили на каждую пластину, V = начальный объем гомогената.
4. Оцените сна и выживания Длительность после заражения
- Длямух, которые не собирают для измерения бактериальной нагрузки, продолжить мониторинг поведения для другого 7-10 дней. Выживание продолжительность зависит от генотипа лету, условия окружающей среды, и бактериальных видов, используемых для инфекции.
- После ~ 10 дней, прекратить эксперимент, загружать и обрабатывать данные о поведении, как описано выше 6. Insomniac2 заказного программного обеспечения, которая базируется в Matlab, используется для анализа сна параметров. Важно, чтобы устранить мертвые мухи от поведенческого анализа. Как правило, это ограничивает анализов в течение первых суток после заражения, в зависимости от типа инфекции и летать генотипа. Смерть в анализе указывается время вся деятельность считается достигла нуля. Для облегчения анализа выживания, Drosonex, пользовательских программ, написанных в Microsoft Visual C + + 6.0, используется для обработки файлов необработанных данных из системы DAM Trikinetics. Программное обеспечение отчеты в виде файлов Excel, выживание продолжительность каждого лету (в часах), компилирует деятельности DATиз всех мониторов в единую таблицу, и сообщает процентов летит выжить в течение долгого времени, установленного пользователем. Excel файлов, предназначенных для интеграции в другие статистические программные пакеты для дальнейшего анализа.
5. Измерение активности NFκB во время инфекции с помощью люциферазы Reporter
Трансгенные кВ-Люк мух, используемых в этом анализе были получены ранее, как описано в Го и соавт., 2010 2. Короче говоря, кВ-Люк репортер содержит 8 повторов NFκB обязательной последовательности, которые были вставлены в промоутер перед люциферазы открытые рамки считывания.
- Отрегулируйте мух экспериментальных условиях освещения, как описано в разделе 1.2. В этом примере, 1-4 дневных кВ-Люк мух расположены во флаконах, содержащих 5% сахарозы, 2% агар пищи и помещены в постоянный свет (LL) в течение 2 дней, чтобы достичь того же возраста, другие мухи во время инфекции.
- Подготовка 96-ю лунками для мух. Каждая лунка содержит 2 слоя пищевой среды (рис. 2), верхний слой содержит люциферин, субстрат люциферазы. Добавить 300 мкл 5% сахарозы, 2% агара раствора в каждую лунку и дать затвердеть. Затем добавьте 50 мкл верхнего слоя в каждую лунку, содержащую 5% сахарозы, 1% агара и 2 мМ люциферин (Gold биотехнологии, Inc.) Luciferin концентрациях, используемых для измерения активности репортера в Drosophila менялись в литературе, и были столь же низко как 100 мкм 13. Концентрация, необходимая может быть определен эмпирически. Между выдачи пищи слои, покрытия пластины с тонкой тканью сетки для облегчения сушки при сохранении стерильности. Пластина должна быть предоставлена возможность полностью высохнуть, до одного часа, для того, чтобы предотвратить мух от застревания в конденсацию капель. Потому что люциферин является светочувствительным, не подвергать плиты на свет больше, чем нужно.
- Применить прозрачная пленка клея (Top-Seal-A; Perkin Elmer) в 96-а микролуночные перфорированные пластины и с помощью тонкой иглы в количестве 2 отверстия на лунку. Эти отверстия не только позволит воздухообмен в каждую лунку, но и дают возможность обезболить мухи на индивидуальной основе. Используя острый нож и прямые края, ввести разрез между колонками. Это обеспечит простой способ загрузки / выгрузки мух в группах по 8 одновременно.
Чтобы загрузить мухи в пластину микролуночные, удалить пузырьки из инкубатора и Anesthetize мухи на CO 2 площадки. Нагрузка летит одна за одной в каждую лунку столбец за столбцом. Если покупать случайно застрял на клей уплотнения, оставьте лету в одиночку, как часто они смогли освободиться без вмешательства. Вернуться пластины микролуночные в инкубатор в LL течение 8-24 часов, чтобы приспособиться к новой среде и потреблять люциферин подложки. - Культуры бактерий, С. marcescens и подготовить решение для инфекции, как описано выше.
- Анестезировать тон летает с помощью пипетки наконечник прикреплен к низким давлением CO 2 линии. Поместите кончик микропипетки непосредственно над вентиляционными отверстиями сделаны для каждой скважины. Будьте осторожны, чтобы убедиться, что давление CO 2 является достаточно высоким для обезболивания лету, но достаточно низко, чтобы избежать травмы в лету. В группах из восьми индивидуально передавать друг к лету CO 2 площадки, и заражают как описано выше. После заражения, возвратитесь каждая муха в исходное хорошо и запечатайте планшет.
- Измерение люминесценции (TopCount-NXT люминесценции и сцинтилляционных счетчиков; Perkin-Elmer). TopCount счетчика люминесценции содержит укладки кассеты для пластин, что позволяет запрограммированные и автоматизированных показания непрерывно в нужное шагом для любого отрезка времени (обычно до пяти дней). Эта функция доступна не на всех инструментах, и сбор данных для экспериментов с другими инструментами, следовательно, менее частыми. Люминесценции счетчик находится в роОМ с контролируемой температурой и освещением графику. При загрузке плит в укладке кассеты, стек пластин, содержащих мухи между ясно пустые пластины, чтобы мухи получают свет. Программа люминометра в соответствии со спецификацией производителя, чтобы собрать показания каждый час в течение как минимум 24 часов. В этом примере, детекторы запрограммирован на чтение каждой лунки в течение 10 секунд и выразить результат в виде счета (в произвольных единицах) в секунду. Это значение усредненных по 3 показания на лунку. Экспорт файлов данных в электронную таблицу и выполнить стандартный анализ, графические результаты люминесценции.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
- Инфекция способствует сну. В этом примере, Canton-S (CS) диких мух типа и мутантных мух не хватает NFκB ген, Смак (Rel E20) 14, были погружены на две DAM2 деятельности мониторы (п = 32 для каждого генотипа) и инфицированных как описано выше. Мухи были сохранены в постоянном свете, чтобы устранить влияние на циркадные часы на поведение и инфекции 2,7,8. Мутанты Отн E20 были isogenized в CS, как описано выше 11. Оба набора мухи были заражены S. marcescens и результаты представлены на рисунке 3. В некоторых случаях дополнительно обрабатываются контрольной группе полезна для дифференциации эффектов обработки от последствий заражения 2. Handled контрольных групп подвергаются тем же изменениям окружающей среды, как зараженные группы, которая включает в себя удаление из инкубаторов и обезболивание за тот же период времени, но они не получают инъекции. Однако, в данном примере ясно, что Rel E20 мутантов испытывать меньше сна, чем CS управления летает после заражения (рис. 3А). Как описано выше 6, есть и другие поведенческие параметры, которые можно измерить с анализом плотин. Они могут включать в общий подсчет активности в единицу времени (рис. 3В). В этом примере изменения активности после заражения зеркала, сна. Мы также сообщаем уровень активности или деятельности импульсов в минуту бодрствования (рис. 3). Этот параметр является одним из показателей опорно-двигательной способности у мух. В этом случае, проснувшись уровень экономической активности не меняется в любом генотипе во время инфекции, которая предполагает, что снижение активности или увеличение сна не является результатом снижения опорно-двигательной способности.
- На рисунке 4а показана выживаемость после заражения. В соответствии с предыдущими выводами 14,15, Rel E20 мутанты быстро поддались наинфекцией по сравнению с диким типом мух. Большинство мух пережил асептических управления впрыском (рисунок 4B), указывая, что мухи поддался на инфекцию, а не к травме вследствие инъекции. Потому что Relish мутантов умер так быстро, только CS мухи были использованы, чтобы продемонстрировать бактериальной нагрузки после заражения (рис. 5). 5 показано, что С. marcescens продолжает распространяться в лету 24 часов после заражения.
- Активность люциферазы репортера изображен во времени в анализе, в четырех отдельных мух (рис. 6). Большие различия между данными точками и отдельные мухи могут быть отнесены к мухам передвигаться внутри скважины. Хотя сигнал выводится из всех тканей в лету, он не ожидал, что каждая ткань будет излучать столько же сигнал, и видимость ткани на детектор будет меняться, как муха движется. В этом примере, мухи были инфицированы и по сравнениюс обрабатываться контрольной группы. Мухи, которые умерли, были исключены из анализа всей группы мух показано на рисунке 7А. Мертвые мухи определяется путем визуального осмотра. В этих мух, происходит резкое падение люциферазы сигнала, а также снижение изменение сигнала, указывая, что муха не движется. КВ-Люк репортер деятельности неуклонно возрастает после заражения (рис. 7а) и асептической травмы (рис. 7B ). Репортер деятельности пики около 12 ч после травмы и после инфицирования. Оба генетических и / или поведенческих манипуляций с мухами, как ожидается, изменить кВ-Люк репортер деятельности в течение инфекции. Например, мы описанной ранее 2 следует, что индукция кВ-Люк репортер деятельность была в значительной степени ослабленной во время инфекции в Отн E20 мутантов, указывая на этой кВ-Люк репортера является специфическим для NFkB.
Рисунок 1. Блок-схема в котором излагаются основные этапы измерения иммунного ответа у дрозофилы (А) последовательность шагов, изложенных для измерения сна, выживание и бактериальной нагрузки в течение инфекции;. (B) последовательность шагов, изложенных для измерения NFκB-зависимых активность люциферазы репортера во время инфекции. Эксперименты могут продолжаться где-то от 1-5 дней, в зависимости от летальность видов бактерий используется.
Рисунок 2. Схематическое изображение отдельных лунку. Мух помещают в непрозрачную, 96 луночные планшеты, содержащие средние и покрыты, как показано на рисунке. Потому что мухи будут обрабатываться индивидуально, чтобы быть заражены, важно, тØ ограничить количество мух на пластину сумма, которая может быть разумно управлять в течение определенного периода времени, в зависимости от экспериментальных условий.
Рисунок 3. Поведение реакцию мух инфицированных S. marcescens. (A) Среднее значение ± SEM процент времени, который летит провел спальные и (B) Среднее ± SEM общего счета деятельности приведены в 4 часа шаг за 1 день до и после заражения S. marcescens. (C) среднее ± SEM деятельности импульсов в свободную минуту до (BL = базовый) и после инфицирования S. marcescens строится с шагом 8 часов. Поведение сообщает дикого типа мухи CS, которые выжили по крайней мере 24 часа после заражения, а также для иммунной дефицитом Отн E20 летит тхат выжил, по крайней мере, 8 часов после заражения. п = 13 для CS и для Отн E20. ** = Р <0,01 и х = р <0,05, т студента - тест.
Рисунок 4. Выживание результат инфицированных и неинфицированных мух. (A) представителя Kaplan-Meier кривые выживаемости построены для дикого типа CS и иммунной-дефицитных мух Отн E20, которые были инфицированы С. marcescens. р = 8.13x 10 -13, войдите ранга теста. п = 31 для CS и N = 32 для мух Отн E20. (B) представителя Kaplan-Meier кривые выживаемости, как сообщается, как и в (A), кроме мух получили травмы асептических путем инъекции жидкой среде без бактерий. Почти все мухи выжил асептической травмы до конца эксперимента (60 ч после травмы). р> 0,97, журнал гАНК испытаний; п = 32 для CS и явления E20 мух.
Рисунок 5. Количественной оценки бактериальной нагрузки у мух инфицированных S. marcescens. (A) представитель бактериальные культуры из CS мухи инфицированных S. marcescens, которые были собраны сразу после заражения (левая панель), или 24 часа после заражения (правая панель). Разведение факторов, указанных ниже каждой фигуры. В этом примере, 10 мух гомогенизировали в 400 мкл раствора для каждой группы. 100 мкл конечного разведения было распространено на каждую пластину. Левая пластина содержит 29 колониеобразующих единиц (КОЕ). Для расчета КОЕ / летать, разделите 29 КОЕ [10 мух * 0,001 (коэффициент разбавления) * 100 мкл (объем распространения на пластину)], что составляет 29, а затем умножить на начальном объеме 400 мкл = 11600. Для этой конкретной пластины, у нас есть в среднем 1,16 х 10 4КОЕ / лету. Правая пластина содержит 257 колоний. Используя ту же формулу, получим, в среднем 1,03 х 10 6 КОЕ / лету. (B) После подсчета КОЕ / мух от каждой пластины в каждой экспериментальной условия, создавать окна-и-усами, как показано на рисунке. В этом примере, 25, 50 (в среднем) и 75-й процентиль представлены как нижней, средней и верхней части окна. Планки погрешностей представляют стандартное отклонение в трех независимых экспериментах. ** Р <0,01 Стьюдента-тест.
Рисунок 6. NFκB зависимых деятельности репортера люциферазы в отдельных мух инфицированных S. . marcescens Типичные примеры исходные данные приведены для отдельных неинфицированных мух (обработано контроля; левая панель) и инфицированных мух (правая панель). Базовый чтении (время '0 '), была собрана непосредственно перед инфекцией или обращения, а все остальныемоменты времени были собраны после мухи лечение. Обратите внимание на различия в масштабах в Y-оси между мух в инфицированных и обрабатываются условиях контроля. Большие изменения сигнала в пределах каждого лету может быть связано с движением лету внутри микролуночные.
Рисунок 7. Заражение S. marcescens или травма с асептическим инъекции увеличивается кВ-Люк репортер деятельность в живых мух. среднее ± SEM активности люциферазы (условных единицах) строится каждые 4 часа во всех мух, которые были инфицированы (A) или ранены асептических инъекций (B) и выжила до до 24 лет в анализе. В одну сторону ANOVA с повторными измерениями указано, что репортер деятельности значительно увеличились в инфицированных (р <0,05), ранения (инъекцию, р <0,01), и их обработки конуправления (HC, р <0,01) групп по отношению к их базовой (время '0 '; Тьюки сообщению сеть). (Вставки, панно): Данные из группы HC нанесены на различных масштабах. Небольшое, но значительное увеличение репортер деятельности в HC группа предполагает, что мухи, возможно, испытали легкий стресс или увеличение бодрствования из обращения (трансфер от пластины микролуночные и обезболивания эквивалентно инфицированных мух). Оба инфицированных и пострадавших групп показали сильную индукцией кВ-Люк репортер деятельности, которые были значительно выше, чем в группе HC по указанной моменты времени * = р <0 0,05; ** = р <0 .01;. Стьюдента - испытания; для (а) N = 20 HC и п = 13 Инфекции, для (б) п = 15 HC и п = 14 травме.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Этот протокол описывает подход, чтобы исследовать, как поведение, особенно во время сна, связан с иммунной параметры ответа. Эти параметры включают бактериальную нагрузку, выживаемостью, и NFκB деятельности как измеряется с помощью люциферазы репортера в естественных условиях. Вместе эти параметры дают информацию о том, как хорошо муха может бороться с инфекцией. Бактериальная нагрузка и выживаемостью являются иммунные параметры ответа, который включает Непосредственное измерение у дрозофилы. Отн E20 мутанты, у которых нет NFκB фактора транскрипции, который играет центральную роль в иммунной реакции, быстро гибли к бактериальной инфекции. Генетическая или других манипуляций поведение может также влиять на эти иммунные параметры ответа, возможно, влияя на NFκB самой деятельности. Например, лишение сна до инфицирования увеличивается экспрессия мРНК Relish, а также снижает КОЕ / летать по отношению к не-лишена контроля 11. MutanПС часовые гены, период 7 и вневременной 8, также сообщили сократить выживания во время инфекции, а также бактериальных оформлению 8. Дальнейшие исследования, которые используют этот подход, как ожидается, обеспечит механистического понимания, как поведение может влиять на иммунную функцию.
Инъекций / инфекции процедуру мы опишем здесь изменяется от метода, описанного ранее Ву и др. 16. Эта процедура является простой и недорогой. Однако недостатком является то, что ручное управление объемом впрыска с использованием красителя в качестве индикатора является грубым и может внести вклад в изменчивость. Другие группы используют микроинъектор чтобы постоянном объеме инъекций 17, или ножом мух с иглой, смоченной в бактериальную культуру 18. Тем не менее, метод, представленный здесь была успешной в выявлении изменений в бактериальных оформление по условиям эксперимента 11,19 </ SUP>.
Выживание мухи во время инфекции, как правило, количественно путем подсчета оставшихся мух на регулярные интервалы времени. Здесь мы используем систему Trikinetics DAM контролировать время смерти в отдельных мух, о чем свидетельствует прекращение деятельности. Мы убедились, что выживаемостью, как это определено двигательная активность является такой же, как определяли путем визуального осмотра мух в деятельности трубах во время инфекции (не опубликован). Этот метод также использовался ранее для измерения продолжительности жизни 20,21. Тем не менее, важно отметить, что оценка выживаемости в DAM системы ограничены, что в изолированной мухи, и что результаты, полученные от этого состояния как ожидается, будут отличаться от тех, в групповых условиях. Ранние исследования показали различия в выживаемости, когда хозяин находится в группах по сравнению с изолированным условиях 22. Недавние исследования также подтвердили, что продолжительность жизни в группах мух больше,, чем в изолированных мух 20.
Активность люциферазы репортера была использована ранее для анализа экспрессии гена часов в живых мух (например, в ссылке 23). В этих случаях, других технических соображений необходимо, в частности, истощение субстрата люциферин, которая происходит в течение нескольких дней ведения анализа. В отличие от анализа описанных здесь ограничен для выживания инфицированных мух и участвует Непосредственное измерение в течение 24 часов после заражения. Повторных измерений ANOVA было достаточно, чтобы оценить изменения по сравнению с исходным внутри каждой группы. Статистические подходы к анализу циркадные колебания люциферазы журналистам, наряду с нормализацией шаги для исправления подложки истощения полностью обсуждается в другом месте 24. В любом случае, измерения в режиме реального времени репортер деятельности в отдельных мух является более эффективным методом для получения информации о его временной динамике, чем станцииndard биохимических и иммуногистохимических анализов.
Тем не менее, потенциальным недостатком для мониторинга активности люциферазы репортера в естественных условиях является то, что она зависит от мух едят подложки люциферин. Анорексия была связана с инфекцией в мух, и кормление также может варьироваться в зависимости от типа инфекции или среди генотипы 25. Чтобы обойти озабоченность по поводу приема подложки, мух может быть разбит на отдельные части тела или тканей после инфицирования, и репортер активность может быть измерена в культуре, как описано выше 26. Кроме того, результаты анализа люциферазы также могут быть проверены с помощью стандартного анализа, который не полагаться на кормление. Например, количественный ПЦР была широко используемый подход к измерению уровня экспрессии антимикробных пептидов (АМП) мРНК. Усилители известны цели NFκB, и поэтому указывать его уровня активности.
Представитель DATописанные здесь повторять предыдущие работы показали, что NFκB поднимается с иммунной вызов и последующее увеличение 2 чел. Тем не менее, читатели предупредили, что сон в системе DAM Trikinetics указывается бездействия в течение как минимум пяти последовательных минут 27. Измерение сна в лету видеосъемка также опирается на бездействие 28. Этот сон определение мухи потенциально может быть проблематичным во время инфекции, потому что оно известно также, что иммунная вызов животных станет неактивным в течение длительного времени без сна 29. Чтобы решить эту проблему, анализы, которые измеряют сенсорные реакции необходимо убедиться, что мухи действительно спал. Следователи определили реакцию мух на сенсорные стимулы, такие как карандаш крана 30, чистка труб деятельность с деревянной палкой 31, или отопление одного конца трубки 27. Во всех случаях, спальные мух менее чувствительны (измеряемаялибо задержки ответа или ответ процентов летит как группа), чем спать мух. Мы обнаружили, что инфицированные мухи, которые спят действительно являются менее чувствительными к сенсорных стимулов до 6-8 часов после заражения (тыс. Куо и Дж. Уильямс, неопубликованные наблюдения). Несмотря на технические ограничения, система Trikinetics DAM обеспечивает высокую пропускную преимущества, которые будут полезны для будущих исследований в мух, которые исследуют генетические и молекулярные связи между сном и иммунной функции.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Эта работа была выполнена при поддержке Национального научного фонда, грант # IOS-1025627 и Национального института здоровья в рамках гранта # 1R21NS078582-01 в челюсть
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Incubators | Percival Scientific, Inc. | I30BLLC8 I36VLC8 |
Any incubator capable of running programmed light/temperature schedules is appropriate. |
| Drosophila Activitiy Monitors | Trikinetics Inc., Waltham, MA | DAM2 | As described elsewhere6, this system requires a computer interface, software, and other accessories. |
| Pyrex Glass Tubes | Trikinetics Inc., Waltham, MA | PGT-5x65 | |
| Microplate scintillation and luminescence counter | Perkin Elmer | TopCount NXT 12 detector |
Any microplate reader capable of detecting luminescence can be used for this type of reporter assay. TopCount contains multiple detectors and an automated stacker; it is capable of being programmed to read continuously from multiple plates. |
| FluorChem 8900 | Alpha Innotech | Imaging of bacterial cultures is optional; any digital imaging system with visual light capability is sufficient. | |
| Micropipette Puller | Tritech Research, Inc. | Narishige PC-10 | |
| Supplies | |||
| Borosilicate Glass Capillaries | World Precision Instrument Inc. | 1B100F-4 | |
| 3 ml Syringe | Fisher Scientific | BD 305482 | |
| Syringe Needles | Fisher Scientific | BD 305196 | 18 G - cut off the tip of the needle to prevent damage to the tubing. |
| Silicone Tubing, i.d. (0.030") o.d. (0.065") Wall Thickness (0.018") | VWR | 60985-706 | Used for attaching glass capillary needles to a syringe |
| 3 Way Stopcock | American Pharmaseal Company | K75 | |
| Kontes Pellet Pestle Cordless Motor | Fisher Scientific | K749540-0000 | |
| Kontes Pellet Pestle | Fisher Scientific | K749521-1590 | |
| Glass balls 3mm | VWR | 26396-630 | |
| Microplate Microlite 1+ | Thermo Scientific | 7571 | Select 96-well plates that are appropriate for luminescence - they must be opaque. |
| TopSeal-A:96-well Microplates | PerkinElmer | 6005185 | Microplate Press-On Adhesive Sealing Film |
| D-Luciferin, Potassium Salt | Gold BioTechnology, Inc. | LUCNA | |
| Software | |||
| Insomniac2 | Available upon request to the authors | custom; written by Lesley Ashmore, Ph.D. (Westminster College) | Matlab based software that has been used routinely for analysis of sleep2,6,11 |
| Drosonex | Available upon request to the authors | custom; written by Thomas Coradetti (Sidewalk Software) | A PC MSVC6 program used for survival analysis from raw data files collected with the Trikinetics system |
| Photoshop CS3 | Adobe | Useful for obtaining numbers of cfu/plate from digital images (optional) | |
References
- Majde, J. A., Krueger, J. M. Links between the innate immune system and sleep. J. Allergy Clin. Immunol. 116, 1188-1198 (2005).
- Kuo, T. H., Pike, D. H., Beizaeipour, Z., Williams, J. A. Sleep triggered by an immune response in Drosophila is regulated by the circadian clock and requires the NFkappaB Relish. BMC Neurosci. 11, 1471-2202 (2010).
- Preston, B. T., Capellini, I., McNamara, P., Barton, R. A., Nunn, C. L. Parasite resistance and the adaptive significance of sleep. BMC Evol Biol. 9, 7 (2009).
- Imeri, L., Opp, M. R. How (and why) the immune system makes us sleep. Nat. Rev. Neurosci. 10, 199-210 (2009).
- Ayres, J. S., Schneider, D. S. A Signaling Protease Required for Melanization in Drosophila Affects Resistance and Tolerance of Infections. PLoS Biol. 6, e305 (2008).
- Chiu, J. C., Low, K. H., Pike, D. H., Yildirim, E., Edery, I. Assaying Locomotor Activity to Study Circadian Rhythms and Sleep Parameters in Drosophila. J. Vis. Exp. (43), e2157 (2010).
- Lee, J. E., Edery, I. Circadian Regulation in the Ability of Drosophila to Combat Pathogenic Infections. Curr. Biol. 18, 195-199 (2008).
- Stone, E. F., et al. The circadian clock protein timeless regulates phagocytosis of bacteria in Drosophila. PLoS Pathog. 8, e1002445 (2012).
- Hill-Burns, E. M., Clark, A. G. X-linked variation in immune response in Drosophila melanogaster. Genetics. 183, 1477-1491 (2009).
- Short, S. M., Lazzaro, B. P. Female and male genetic contributions to post-mating immune defence in female Drosophila melanogaster. Proc. Biol. Sci. 277, 3649-3657 (2010).
- Williams, J. A., Sathyanarayanan, S., Hendricks, J. C., Sehgal, A. Interaction between sleep and the immune response in Drosophila: a role for the NFkappaB relish. Sleep. 30, 389-400 (2007).
- Ramsden, S., Cheung, Y. Y., Seroude, L. Functional analysis of the Drosophila immune response during aging. Aging Cell. 7, 225-236 (2008).
- Williams, J. A., Su, H. S., Bernards, A., Field, J., Sehgal, A. A circadian output in Drosophila mediated by neurofibromatosis-1 and Ras/MAPK. Science. 293, 2251-2256 (2001).
- Hedengren, M., et al. Relish, a central factor in the control of humoral but not cellular immunity in Drosophila. Mol. Cell. 4, 827-837 (1999).
- Leulier, F., Rodriguez, A., Khush, R. S., Abrams, J. M., Lemaitre, B. The Drosophila caspase Dredd is required to resist gram-negative bacterial infection. EMBO Rep. 1, 353-358 (2000).
- Wu, L. P., Choe, K. -M., Lu, Y., Anderson, K. V. Drosophila Immunity: Genes on the Third Chromosome Required for the Response to Bacterial Infection. Genetics. 159, 189-199 (2001).
- Dionne, M. S., Ghori, N., Schneider, D. S. Drosophila melanogaster is a genetically tractable model host for Mycobacterium marinum. Infect. Immun. 71, 3540-3550 (2003).
- Romeo, Y., Lemaitre, B. Drosophila immunity: methods for monitoring the activity of Toll and Imd signaling pathways. Methods Mol. Biol. 415, 379-394 (2008).
- Lu, Y., Wu, L. P., Anderson, K. V. The antibacterial arm of the Drosophila innate immune response requires an I{kappa}B kinase. Genes Dev. 15, 104-110 (2001).
- Koh, K., Evans, J. M., Hendricks, J. C., Sehgal, A. A Drosophila model for age-associated changes in sleep:wake cycles. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 103, 13843-13847 (2006).
- Bushey, D., Hughes, K. A., Tononi, G., Cirelli, C. Sleep, aging, and lifespan in Drosophila. BMC Neurosci. 11, 1471-2202 (2010).
- Allee, W. C. The social life of animals. , W.W. Norton & Company, Inc. (1938).
- Stanewsky, R., Jamison, C. F., Plautz, J. D., Kay, S. A., Hall, J. C. Multiple circadian-regulated elements contribute to cycling period gene expression in Drosophila. Embo. J. 16, 5006-5018 (1997).
- Levine, J. D., Funes, P., Dowse, H. B., Hall, J. C. Signal analysis of behavioral and molecular cycles. BMC Neurosci. 3, 1 (2002).
- Ayres, J. S., Schneider, D. S. The role of anorexia in resistance and tolerance to infections in Drosophila. PLoS Biol. 7, e1000150 (2009).
- Plautz, J. D., Kaneko, M., Hall, J. C., Kay, S. A. Independent photoreceptive circadian clocks throughout Drosophila. Science. 278, 1632-1635 (1997).
- Huber, R., et al. Sleep homeostasis in Drosophila melanogaster. Sleep. 27, 628-639 (2004).
- Zimmerman, J. E., Raizen, D. M., Maycock, M. H., Maislin, G., Pack, A. I. A video method to study Drosophila sleep. Sleep. 31, 1587-1598 (2008).
- Toth, L. A., Rehg, J. E., Webster, R. G. Strain differences in sleep and other pathophysiological sequelae of influenza virus infection in naive and immunized mice. J. Neuroimmunol. 58, 89-99 (1995).
- Hendricks, J. C., et al. Rest in Drosophila is a sleep-like state. Neuron. 25, 129-138 (2000).
- Wu, M. N., Koh, K., Yue, Z., Joiner, W. J., Sehgal, A. A genetic screen for sleep and circadian mutants reveals mechanisms underlying regulation of sleep in Drosophila. Sleep. 31, 465-472 (2008).
