Summary
Para comprender un enlace entre la respuesta inmunitaria y el comportamiento, se describe un método para medir el comportamiento locomotor en
Abstract
Una compleja interacción entre la respuesta inmunitaria y el comportamiento del sistema se ha descrito en una amplia gama de especies. Exceso de sueño, en particular, se sabe que ocurre como respuesta a la infección en mamíferos 1 y también ha sido descrito recientemente en Drosophila melanogaster 2. En general se acepta que el sueño es beneficiosa para el huésped durante una infección y que es importante para el mantenimiento de un sistema inmune robusto 3,4. Sin embargo, la evidencia experimental que apoya esta hipótesis es limitada 4, y la función de exceso de sueño durante una respuesta inmune sigue siendo poco clara. Hemos utilizado un enfoque multidisciplinario para abordar este complejo problema, y se han llevado a cabo estudios en el sistema modelo genético simple, la mosca de la fruta Drosophila melanogaster. Nosotros utilizamos un ensayo estándar para medir el comportamiento locomotor y el sueño en las moscas, y demostrar cómo este ensayo se utiliza para medir el comportamiento en las moscas infected con una cepa patógena de las bacterias. Este ensayo también es útil para controlar la duración de la supervivencia de las moscas individuales durante una infección. Medidas adicionales de la función inmune incluyen la habilidad de las moscas para eliminar una infección y la activación de NF-kB, un factor de transcripción clave que es central en la respuesta inmune innata en Drosophila. Tanto los resultados de supervivencia y el aclaramiento de bacterias durante la infección juntos son indicadores de la resistencia y la tolerancia a la infección. Resistencia se refiere a la habilidad de las moscas para eliminar una infección, mientras que la tolerancia se define como la capacidad del huésped para limitar los daños de una infección y por lo tanto sobrevivir a pesar de los altos niveles de patógenos en el sistema 5. Monitoreo en tiempo real de la actividad de NF-kB durante la infección da una idea de un mecanismo molecular de la supervivencia durante la infección. El uso de Drosophila en estos ensayos sencillos facilita los análisis genéticos y moleculares de sueñoy la respuesta inmune y cómo estos dos sistemas complejos están recíprocamente influenciados.
Protocol
Este protocolo utiliza dos configuraciones (Figura 1) para adquirir cuatro lecturas de datos distintas de las moscas recogidas sometidos a una infección bacteriana. Estos productos incluyen: 1) sueño / vigilia comportamiento, 2) los resultados de supervivencia, y 3) la carga bacteriana en la mosca, y 4) medición en tiempo real de la actividad de reportero NFkB en vivo. En combinación con las herramientas genéticas que están disponibles en Drosophila, estas mediciones proporcionan información mecanicista en el enlace molecular entre la función inmune y el comportamiento.
1. Medida de la actividad locomotora y del sueño en moscas
- La configuración utilizada para medir la actividad locomotora y dormir en moscas, que incluye la actividad de Drosophila sistema de supervisión (DAM2, Trikinetics), incubadoras, oscuro, y la preparación de los animales experimentales y los tubos de la actividad, se ha descrito previamente 6. El mismo enfoque se usa aquí, con algunas modificaciones menores.
- Actividad tubos se limpian para su reutilización por ebullición en una placa caliente en agua desionizada. Una pequeña cantidad de detergente es añadido para la ebullición primero, los tubos se enjuagan bien y se hirvió dos veces más. Si el hilo se utiliza para conectar el tubo, los tubos utilizados actividad (que contiene los alimentos, de cera, y los hilados de mosca) se puede limpiar sin eliminación previa del hilo.
- Antes de iniciar un experimento, culturas lugar que contengan tarde pupal etapas moscas en incubadoras durante tres a cuatro días para adaptarse a la iluminación experimental y otras condiciones ambientales. Luz: condiciones de oscuridad constante o se han usado comúnmente para medir el comportamiento del sueño. En este ejemplo, las moscas se aclimataron a la luz constante para eliminar la influencia del reloj circadiano en la respuesta inmune y el comportamiento 2,7,8. Como se describe en la Figura 1A 6, y registro para un mínimo de tres días antes de la infección.
2. Infect moscas con una cepa patógena de las bacterias
- El protocolo aquí descrito es específico para S. marcescens, que son fáciles de cultivar y mantener. Protocolos para el almacenamiento a largo plazo y condiciones de cultivo para otras especies bacterianas pueden variar. S. marcescens se almacenan en 15-50% de glicerol a -80 ° C. Para prepararse para almacenamiento a largo plazo, mezclar 2 volúmenes de cultivo bacteriano durante la noche (OD 600 = 0,5 - 1,0) a 1 volumen de glicerol esterilizado en autoclave 50% en tubos de 1,5 ml de microcentrífuga. Esto dará lugar a una concentración final de glicerol de 17%. Almacene los tubos a -80 ° C. Para preparar un corto plazo en el uso de código de bacterias, raspar el stock congelado con una punta de pipeta estéril 200 l y realizar una serie de tres vías en una placa de agar LB. Incubar la placa durante la noche a 37 & dpor ejemplo, C para obtener colonias aisladas. Guarde la placa a 4 ° C.
Un día antes de la infección programada, recoger una única colonia de la placa de agar LB con una punta de pipeta estéril 200 l y sumergir la punta en un tubo de cultivo que contiene 5 ml de medio LB. Crecer las bacterias durante la noche, o hasta 16 horas en el interior de un agitador incubador a 37 ° C y 250 rpm hasta que se alcanza la fase de crecimiento exponencial. Medir la concentración con un espectrofotómetro a OD 600. La concentración de esta fase varía de 0,5 a 1. Si la concentración es demasiado alta, subcultivar las bacterias y crecer durante otras varias horas para conseguir una concentración óptima. Lleve a cabo el procedimiento cerca de una fuente de llama. Algunas cepas bacterianas están diseñados para resistencia a los antibióticos y se cultivan y se seleccionan para antibiótico apropiado añadir al medio. S. marcescens (ATCC # 8100) no son resistentes a los antibióticos y por lo tanto se desarrollaron en medio estéril sin antibiótico. Para verificar una técnica estéril, hacer un simulacro de culsin volver a bacterias como un control.
La solución para infectar las moscas contiene bacterias (diluido a OD 600 = 0,1) y 1% de colorantes de alimentos (Azul Brillante FCF) en PBS. Preparar una solución de control de la inyección mediante la adición de una cantidad equivalente de medio LB utiliza en solución infección y 1% colorante azul en PBS. Store Solutions en hielo. - Preparar agujas de vidrio para la inyección de las moscas. Tire capilares de vidrio (OD = 1 mm, id = 0,58 mm, WPI) a una punta fina usando un extractor de micropipeta (Narishige). Bajo un microscopio de disección, utilizar unas pinzas finas para romper la punta de la aguja para que la abertura sea suficientemente grande para llenar con fluido de inyección a una aspiración mediante una jeringa, pero lo suficientemente pequeño para minimizar el daño a la marcha durante el proceso de inyección. Después de romper la punta, el tamaño de la punta debe estar alrededor de 40-50 micras. La aguja de vidrio está unido a una jeringa de plástico de 3 cc con una longitud de tubería. El flujo de medio de inyección se controla manualmente aplicando presión positiva o succión con la jeringa. Evitar la contaminación del tubo de goma con inyección de fluido, como el aparato de jeringuilla se utiliza tanto para la infección y las inyecciones de control.
- Anestesie moscas poniéndolos en una plataforma de CO 2. CO 2 se pasa a través de un recipiente sellado de agua para humidificar la almohadilla y para reducir la electricidad estática, lo que puede complicar la manipulación de las moscas en la almohadilla. Inyectar moscas por meter la aguja de vidrio en la región por encima del escutelo del tórax dorsal. El paso del medio de inyección en la marcha se verifica por el colorante de alimentos - las moscas se vuelven azules como los spreads de alimentos para colorear través del sistema. La dosis de bacterias que reciben las moscas se pueden cuantificar como se describe en la Sección 3, a continuación. Algunos diseños experimentales incluyen un grupo de control que recibe lesión aséptico mediante la inyección de moscas con el colorante PBS y comida, pero sin bacterias.
3. Determinar la carga bacteriana
Un enfoque para evaluating de la respuesta inmune contra la infección bacteriana es determinar la infección después de la carga bacteriana. D. melanogaster es un gran modelo para determinar este parámetro porque la marcha todo se puede homogeneizar para estimar el número total de bacterias en un individuo. La lógica detrás de este protocolo es que cuando se cultivan en un medio sólido tal como caldo de Luria (LB) agar en una placa de Petri (placa de LB), una sola bacteria forma una colonia visible distinguible. Por lo tanto, por homogeneización de las moscas infectadas en medio LB líquido, generando diluciones en serie del homogeneizado, y la difusión del homogeneizado diluido en placas LB, el número de células bacterianas que infectan una mosca se puede determinar. Un grupo de control de moscas inyectadas con PBS y colorante de alimentos, pero sin las bacterias deben ser utilizados para verificar que la infección no estaba contaminado con otras especies bacterianas. No debe haber colonias en la placa de agar LB en esta condición.
- Autoclave todos los materiales que se utilizarán para esteprocedimiento antes de realizar la etapa de homogeneización real. Esto incluye 200 puntas de pipeta mu l cortar con tijeras, medio LB, y morteros usados para la homogeneización. Preparar placas por vertido autoclave LB / agar en platos de 10 cm de Petri estériles al menos 1 día antes de homogeneizar las moscas.
- Anestesiar y colectar las moscas en tubos de microcentrífuga 1,5 ml y tubos Almacenar en hielo.
- Lleve a cabo la homogeneización cerca de una llama para evitar la contaminación. Una homogeneización de control que contiene las moscas sin infección se recomienda especialmente cuando se utiliza una cepa bacteriana, tal como S. marcescens, que no son resistentes a los antibióticos. Homogeneizar un mínimo de 2 grupos de 10 moscas por cada condición experimental. El número de moscas utilizadas por homogeneizado se determina por el experimentador. Algunos grupos han utilizado una mosca por homogeneizado, que es útil para la evaluación de la variación en la carga bacteriana entre las moscas individuales 8, mientras que otros han usado 3 a 10 moscas por homogeneizadohacer comparaciones entre genotipo o condición experimental 9-12.
- Añadir 400 l de medio LB a cada tubo de microcentrífuga que contiene moscas y homogeneizar utilizando un motor pequeño y mano de mortero (Kontes).
- Utilizando puntas de pipeta esterilizadas cortadas, serial diluir la 1:10 homogeneizado mediante la adición de 20 l LB homogeneizada / medio bacteriano a 1,5 tubo de microcentrífuga que contiene 180 l de medio LB l. Cortar las puntas de pipeta evita el bloqueo de los desechos volantes y asegura que un volumen apropiado está siendo transferido.
- Factor de dilución se determina empíricamente y depende del genotipo de la mosca, la cepa bacteriana utilizada, y las condiciones experimentales. Para el tipo salvaje moscas infectadas con S. marcescens, utilizar diluciones de 1:10 2 o 1:10 3 para moscas homogeneizadas inmediatamente después de la infección, y las diluciones de 1:10 o 1:10 4 5 para moscas de la homogeneizaron 24 horas después de la infección.
- Añadir 100 l de LB / media bacteriana del micrófonorocentrifuge tubos que contienen la dilución final y se extendió el medio en una placa de LB con bolas de vidrio (VWR) para asegurar una distribución uniforme.
- Deseche las bolas de vidrio en 100% de solución de EtOH. Colocar las placas de LB en una incubadora a 37 ° C durante la noche.
- Como un paso opcional, utilizar un sistema de formación de imágenes con luz visual para obtener una imagen de las placas LB (FluorChem 8900; Alpha Innotech). Contar el número de colonias ya sea en la propia placa o de la imagen de la placa utilizando la herramienta de recuento en el software Photoshop (Adobe Photoshop CS3).
- Calcular el número de unidades formadoras de colonias por mosca usando la fórmula: [N / (N * D * v)] * V, donde n = número de colonias crecidas en la placa de LB, N = el número de las moscas agrupado en uno tubo de microcentrífuga, D = factor de dilución, y v = volumen de la solución se extendió sobre cada placa; V = volumen inicial del homogeneizado.
4. Evaluar sueño y duración de la supervivencia después de la infección
- Paramoscas que no se cosechan para medir la carga bacteriana, continuar el monitoreo del comportamiento durante otros 7-10 días. Duración de la supervivencia se ve influida por el genotipo de las condiciones ambientales de ventanas, y las especies bacterianas utilizado para la infección.
- Después de ~ 10 días, dar por terminado el experimento, descargar y procesar los datos de comportamiento como se describió previamente 6. Insomniac2 software a medida, que se basa en Matlab, se utiliza para analizar los parámetros del sueño. Es importante eliminar las moscas muertas del análisis de comportamiento. Normalmente, esto restringe el análisis a dentro del primer día después de la infección, dependiendo del tipo de infección y el genotipo mosca. Muerte en el ensayo se indica por el tiempo todos los recuentos de actividad han llegado a cero. Para facilitar el análisis de la supervivencia, Drosonex, software personalizado escrito en Microsoft Visual C + + 6.0, se utiliza para procesar archivos de datos brutos del sistema DAM Trikinetics. Los informes de software como archivos de Excel, la duración de supervivencia de cada vuelo (en horas), recoge la actividad de datuna desde todos los monitores en una sola hoja de cálculo, y notifica el porcentaje de moscas supervivientes con el tiempo establecido por el usuario. Los archivos de Excel están diseñadas para integrarse en otros paquetes de software estadístico para su posterior análisis.
5. Medir la actividad de NF-kB durante la infección utilizando un ensayo luciferase reportero
Transgenic kappa B-luc moscas utilizadas en este ensayo se generaron como se describe anteriormente en Kuo et al., 2010 2. Brevemente, el reportero kappa B-luc contiene 8 repeticiones de una secuencia de unión a NF-kB que se insertaron en un promotor aguas arriba de un marco de lectura abierto de luciferasa.
- Ajuste las moscas a las condiciones de luz experimentales que se describen en la sección 1.2. En este ejemplo, 1-4 días de edad * B-luc moscas están alojadas en viales que contienen una solución de sacarosa al 5%, el 2% a medio agar alimento y se coloca en luz constante (LL) durante 2 días para llegar a la misma edad de otras moscas durante la infección.
- Preparar una microplaca de 96 pocillos para las moscas. Cada pocillo contiene 2 capas de medio de alimentación (Figura 2), la capa superior contiene luciferina, el sustrato de la luciferasa. Añadir 300 l de un 5% de sacarosa, 2% de solución de agar a cada pocillo y dejar que se solidifique. A continuación, añadir una capa superior 50 l a cada pocillo que contenía sacarosa al 5%, 1% de agar, y 2 mM de luciferina (Gold Biotechnology, Inc.). Concentraciones luciferina utilizadas para la actividad del indicador de medida en Drosophila han variado en la literatura, y han sido tan baja como 100 mM 13. La concentración necesaria puede ser determinada empíricamente. Entre las capas de distribución de alimentos, cubrir la placa con un paño de malla fina para facilitar el secado, mientras que se mantiene la esterilidad. La placa deberá dejarse secar por completo, hasta una hora, con el fin de evitar que las moscas se queda pegada en gotas de condensación. Porque luciferina es sensible a la luz, evite exponer las placas a la luz más de lo necesario.
- Aplique una capa adhesiva transparente (Top-Seal-A; Perkin Elmer) a una placa de 96 pocillos de microplaca y perforar con una aguja fina en una cantidad de 2 agujeros por pocillo. Estos orificios no sólo permite el intercambio de aire a cada pocillo, sino que también proporcionan una forma para anestesiar moscas sobre una base individual. Uso de una hoja afilada y el borde recto, introducir un corte entre cada columna. Esto proporcionará una forma fácil de cargar / descargar las moscas en grupos de 8 a la vez.
Para cargar las moscas a la microplaca, retirar los viales del incubador y moscas anestesiar a un CO 2 pad. Carga vuela uno por uno a cada pocillo columna por columna. Si una mosca sin darse cuenta se bloquea al sello adhesivo, deje volar solo, ya que a menudo son capaces de liberarse sin intervención. Devuelva la microplaca a la incubadora en LL durante 8-24 horas para adaptarse al nuevo entorno y para consumir el sustrato luciferina. - Bacterias Cultura, S. marcescens, y preparar una solución para la infección como se describió anteriormente.
- Anestesiar tvuela con una punta de micropipeta unido a una baja presión de CO 2 líneas. Colocar la punta de la micropipeta directamente encima de los agujeros de ventilación realizados para cada pocillo. Tenga cuidado para asegurar que el CO 2 la presión es lo suficientemente alta para anestesiar a la mosca, pero suficientemente baja para evitar daños a la mosca. En grupos de ocho, individualmente transferir cada mosca a un CO 2 pad, e infectar a como se ha descrito anteriormente. Después de la infección, volveos cada una mosca a su estado original y ciérrelo bien la microplaca.
- Luminiscencia medida (TopCount NXT-luminiscencia y contador de centelleo; Perkin-Elmer). El contador de luminiscencia TopCount contiene un casete de apilamiento de las placas, lo que permite lecturas programadas y automatizado continuamente en incrementos deseados para cualquier periodo de tiempo (normalmente de hasta cinco días). Esta característica no está disponible en todos los instrumentos, y la recogida de datos para los experimentos realizados con otros instrumentos por lo tanto puede ser menos frecuente. El contador de luminiscencia se encuentra en un room con una temperatura controlada y programa de iluminación. Coloque los platos en la bandeja de apilamiento, apilar las placas que contienen las moscas claras entre las placas en blanco para que las moscas de recibir la luz. Programa del luminómetro de acuerdo con las especificaciones del fabricante para recoger lecturas cada hora durante un mínimo de 24 horas. En este ejemplo, los detectores están programados para leer cada pocillo durante 10 seg y se expresa el resultado como recuentos (unidades arbitrarias) por segundo. Este valor es un promedio entre 3 lecturas por pocillo. Exportar los archivos de datos a una hoja de cálculo y realizar un análisis estándar, graficando los resultados de luminiscencia.
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Representative Results
- La infección favorece el sueño. En este ejemplo, Canton-S (CS) moscas de tipo salvaje y las moscas mutantes que carecen de un gen NF-kB, Relish (Rel E20) 14, se cargaron en dos DAM2 monitores de actividad (n = 32 para cada genotipo) y se infectaron como se describió anteriormente. Las moscas se mantuvieron en luz constante para eliminar la influencia del reloj circadiano en el comportamiento y la infección 2,7,8. Los mutantes E20 Rel se isogenized a CS como se ha descrito previamente 11. Ambos conjuntos de moscas fueron infectadas con S. marcescens y los resultados se representan en la Figura 3. En algunos casos, un grupo adicional maneja el control es útil para diferenciar los efectos de la manipulación de los efectos de la infección 2. Procesadas grupos de control se exponen a los mismos cambios ambientales como los grupos infectados, lo que incluye la eliminación de las incubadoras y anestesia para la misma duración de tiempo, pero no reciben una inyección. Sin embargo, en este ejemplo, es claro que los mutantes E20 Rel experimentar menos sueño que vuela CS de control después de la infección (Figura 3A). Como se ha descrito previamente 6, hay otros parámetros de comportamiento que pueden ser medidas a partir del ensayo DAMS. Estos pueden incluir recuentos totales de actividad por unidad de tiempo (Figura 3B). En este ejemplo, el cambio en la actividad después de la infección que los espejos de sueño. También informamos tasa de actividad, o de actividad por cuenta minuto del día (Figura 3C). Este parámetro es un indicador de la capacidad locomotora en moscas. En este caso, las tasas de actividad de vigilia no cambian en cualquier genotipo durante la infección, lo que sugiere que la reducción de la actividad o aumento en el sueño no es un resultado de la capacidad locomotora reducida.
- La Figura 4A representa la tasa de supervivencia después de la infección. De acuerdo con resultados anteriores 14,15, Rel E20 mutantes rápidamente sucumben a la deinfección en comparación con las moscas de tipo salvaje. Mayoría de las moscas sobrevivieron a la inyección de control aséptico (Figura 4B), indicando que las moscas sucumbieron a la infección y no a la lesión debida a la inyección. Debido a que los mutantes Relish muerto tan rápidamente, sólo moscas CS se utilizaron para demostrar la carga bacteriana después de la infección (Figura 5). Figura 5 muestra que S. marcescens continúa proliferando en la mosca de 24 h después de la infección.
- Reportero de la actividad de luciferasa se representa a través del tiempo en el ensayo en cuatro moscas individuales (figura 6). Gran variación entre los puntos de datos individuales y las moscas se puede atribuir a las moscas que se desplazan por el interior de los pocillos. Aunque la señal se deriva de todos los tejidos dentro de la marcha, no se espera que todos los tejidos se emiten la misma cantidad de señal, y la visibilidad del tejido para el detector podría variar debido al movimiento de ventanas. En este ejemplo, las moscas se infectaron y se comparócon un grupo de control manejado. Las moscas que murieron fueron excluidos del análisis a través de un grupo de moscas que se muestran en la Figura 7A. Las moscas muertas se determinó por inspección visual. En estas moscas, hay una fuerte caída de la señal de luciferasa, así como una disminución en la variación de la señal, lo que indica que la mosca no se está moviendo. Kappa B-luc reportero de la actividad aumenta constantemente después de la infección (Figura 7A) y la lesión aséptico (Figura 7B ). Los picos de actividad reportero alrededor de 12 horas después de la lesión y después de la infección. Manipulaciones genéticas Tanto y / o de comportamiento de las moscas se espera que modificar kappa B-luc actividad de reportero durante la infección. Por ejemplo, se ha descrito previamente 2 que la inducción de la actividad de reportero kappa B-luc fue atenuada en gran parte durante la infección en Rel mutantes E20, que indica que este reportero kappa B-luc es específico de NFKB.
Figura 1. Diagrama de flujo que describe los pasos principales de la medición de la respuesta inmune en Drosophila (A) La secuencia de pasos se describe para la medición de sueño, la supervivencia, y carga bacteriana durante una infección;. (B) La secuencia de pasos se describe para la medición dependiente de NF-kB actividad luciferase reportero durante la infección. Experimentos puede continuar en cualquier lugar de 1-5 días, dependiendo de la letalidad de las especies bacterianas usadas.
Figura 2. Moscas esquemática de una microplaca de pocillo individual. Se colocan en opaco, placas de 96 pocillos que contienen medio y cubierta como se muestra. Debido a que las moscas se maneja de forma individual a la infección, es importante to restringir el número de moscas por placa a una cantidad que puede ser razonablemente gestionadas dentro de un período dado de tiempo, dependiendo de las circunstancias experimentales.
Figura 3. Comportamiento de respuesta de las moscas infectadas con S. marcescens. (A) Media ± SEM tiempo que vuela por ciento dormir gastado y media (B) ± SEM recuentos de actividad total se representan gráficamente en incrementos de 4 h durante 1 día antes y después de la infección con S. marcescens. (C) Media ± SEM de actividad por cuenta minuto del día antes (BL = línea de base) y después de la infección con S. marcescens se representa en incrementos de 8 hr. El comportamiento es reportado para moscas de tipo silvestre CS que sobrevivieron durante al menos 24 horas después de la infección, y por inmuno-deficiente Rel E20 vuela THAt sobrevivieron durante al menos 8 horas después de la infección. n = 13 para CS y para Rel E20. ** = P <0,01 y * = p <0,05, t de Student - prueba.
Figura 4. Supervivencia resultado de las moscas infectadas y no infectadas. (A) representante de Kaplan-Meier curvas de supervivencia se trazan para ambos de tipo salvaje y CS inmunodeficientes moscas E20 Rel que estaban infectados con S. marcescens. p = 8.13x 10 -13, test de rangos logarítmicos. n = 31 para CS yn = 32 para las moscas E20 Rel. (B) representante de Kaplan-Meier de supervivencia se presentan como en (A), excepto moscas recibido lesión aséptico por inyección con medios líquidos sin bacterias. Casi todas las moscas sobrevivieron lesión aséptico hasta el final de los experimentos (60 h después de la lesión). p> 0,97, log rank ensayo, n = 32 para CS y Rel moscas E20.
Figura 5. La cuantificación de la carga bacteriana en las moscas infectadas con S. marcescens. (A) Representante de cultivo bacteriano de CS moscas infectadas con S. marcescens que fueron recolectadas inmediatamente después de la infección (panel izquierdo), o 24 h después de la infección (panel derecho). Los factores de dilución se indican debajo de cada figura. En este ejemplo, 10 moscas se homogeneizaron en solución 400 l para cada grupo. 100 l de la dilución final se extendió sobre cada placa. La placa de la izquierda contiene 29 unidades formadoras de colonias (ufc). Para calcular ufc / volar, divida 29 ufc por [10 moscas * 0,001 (factor de dilución) * 100 l (spread volumen en la placa)], que es igual a 29, y luego se multiplica por el volumen inicial de l 400 = 11.600. Para este plato en particular, tenemos un promedio de 1,16 x 10 4ufc / mosca. La placa de la derecha contiene 257 colonias. Usando la misma fórmula, nos encontramos con un promedio de 1,03 x 10 6 ufc / mosca. (B) Después de calcular ufc / mosca de cada placa en cada condición experimental, generar caja y bigotes como se muestra. En este ejemplo, el percentil 25, 50 (mediana) y 75a se presentan como la parte inferior, media y superior de la caja. Las barras de error representan la desviación estándar a través de tres experimentos independientes. ** P <0,01 t de Student prueba.
Figura 6. NFkB luciferasa dependiente de la actividad de reportero en las moscas individuales infectados con S. marcescens. Ejemplos representativos de los datos brutos se muestran para moscas individuales no infectadas (control manejado; paneles de la izquierda) y moscas infectados (paneles de la derecha). Una lectura de referencia (tiempo 0 ") se recogió inmediatamente antes de la infección o la manipulación; todos los demáspuntos de tiempo fueron recogidos después de moscas fueron tratados. Tenga en cuenta las diferencias en la escala de los ejes y entre las moscas en las condiciones de control infectados y manipulados. Gran variación de la señal dentro de cada mosca se puede atribuir a la circulación de la marcha en el interior del pocillo.
Figura 7. La infección con S. marcescens o lesión con inyección aséptica aumenta kappa B-luc reportero de la actividad de las moscas que viven. Media ± SEM actividad de luciferasa (unidades arbitrarias) se representa gráficamente cada 4 horas a través de todas las moscas que fueron infectados (A) o heridas por inyección aséptica (B) y sobrevivieron hasta a 24 en el ensayo. ANOVA de una vía con medidas repetidas indicó que la actividad de reportero aumentado significativamente en los infectados (p <0,05), heridos (inj, p <0,01), y con su manejadascontrol (HC, p <0,01) en relación con los grupos de su línea de base (tiempo 0 "; Tukey post-hoc). (Insert, panel A): Los datos del grupo HC se representan en una escala diferente. El pequeño pero significativo aumento en la actividad del indicador en el grupo HC sugiere que las moscas pueden haber experimentado estrés leve aumento de la vigilia o de manipulación (transferencia hacia y desde la placa de micropocillos y equivalente anestesia a las moscas infectadas). Ambos grupos de los infectados y perjudicado ha inducciones fuertes de la actividad de reportero kappa B-luc que eran significativamente más alta que en el grupo de HC en los puntos de tiempo indicados * = p <0 .05; ** = p <0 .01;. T de Student - prueba; para (a) n = 20 y n = HC 13 Infección; para (B) n = 15 n = HC y 14 lesiones.
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Discussion
Este protocolo describe un enfoque para investigar cómo el comportamiento, particularmente dormir, está vinculado a los parámetros de la respuesta inmune. Estos parámetros incluyen la carga bacteriana, los resultados de supervivencia, y la actividad de NF-kB, medido por un indicador de luciferasa in vivo. En conjunto, estos parámetros proporcionan información sobre la capacidad de una mosca puede luchar contra una infección. La carga bacteriana y los resultados de supervivencia son parámetros de la respuesta inmune que implican una medición directa en Drosophila. Rel E20 mutantes, que carecen de un factor de transcripción NFkB que es central en la respuesta inmune, sucumben rápidamente a la infección bacteriana. Manipulaciones genéticas o de otro tipo de comportamiento también puede influir en estos parámetros de la respuesta inmune, posiblemente al afectar a la actividad de NFkB en sí. Por ejemplo, la privación de sueño antes de la infección aumenta la expresión del ARNm de condimento, y reduce ufc / volar con relación a la falta de controles privados 11. Mutants de los genes del reloj, plazo de 7 y 8, sin tiempo también se ha informado a reducir la supervivencia durante una infección, así como la eliminación de bacterias 8. Otros estudios que utilizan este enfoque se espera que proporcione una visión mecanicista de cómo puede influir en el comportamiento de la función inmune.
El procedimiento de inyección / infección que describimos aquí es una modificación de un método descrito previamente por Wu et al 16. Este procedimiento es sencillo y barato. Sin embargo, una desventaja es que el control manual del volumen de inyección con el uso de un colorante como indicador es crudo y puede contribuir a la variabilidad. Otros grupos han utilizado un microinyector para permitir un volumen de inyección constante de 17, o han apuñalado moscas con una aguja sumergida en la cultura bacteriana 18. No obstante, el método presentado aquí ha tenido éxito en la detección de cambios en la eliminación de bacterias a través de condiciones experimentales 11,19 </ Sup>.
Supervivencia de las moscas durante la infección normalmente se cuantificó contando las moscas que quedan a intervalos regularmente programados. Aquí se utiliza el sistema DAM Trikinetics para controlar el momento de la muerte de las moscas individuales, que se indica por el cese de actividad. Hemos comprobado que el resultado de supervivencia como se determina por la actividad locomotora es el mismo que el determinado por inspección visual de las moscas en los tubos de la actividad durante la infección (no publicado). Este método también se ha usado previamente para medir la duración de la vida 20,21. Sin embargo, es importante notar que la evaluación de la supervivencia en el sistema DAM se limita a que en las moscas aisladas, y que los resultados derivados de esta condición se espera que sean diferentes de aquellos en condiciones agrupados. Estudios preliminares han demostrado diferencias en la supervivencia cuando el anfitrión se coloca en grupos frente a condiciones de aislamiento 22. Trabajos recientes han confirmado también que esperanza de vida en los grupos de moscas es más largode que en las moscas aisladas 20.
Reportero de la actividad de luciferasa se ha utilizado previamente para el análisis de la expresión génica en las moscas de reloj de vida (por ejemplo, ref 23). En estos casos, otras consideraciones técnicas son necesarias, particularmente el agotamiento del sustrato luciferina que se produce en varios días de realizar el ensayo. En contraste, el ensayo descrito aquí se limita a la supervivencia de las moscas infectadas y consistió en una medición directa de más de 24 horas después de la infección. Un ANOVA de medidas repetidas fue suficiente para evaluar cambios desde el inicio dentro de cada grupo. Enfoques estadísticos para el análisis de una oscilación circadiana de luciferase reporteros, junto con las medidas de normalización para corregir el desgaste del sustrato se examinan en detalle en otra parte 24. En cualquier caso, la medición en tiempo real de la actividad del indicador en las moscas individuales es un método más eficiente para extraer información acerca de su dinámica temporal que standard ensayos bioquímicos e inmunohistoquímicos.
Sin embargo, una desventaja potencial para supervisar la actividad de reportero de luciferasa in vivo es que es dependiente de las moscas que comen el sustrato luciferina. Anorexia se ha asociado con la infección en las moscas, y la alimentación también puede variar con el tipo de infección o entre los genotipos 25. Para eludir la preocupación acerca de la ingestión del sustrato, las moscas pueden ser diseccionado en partes del cuerpo separadas o tejidos después de la infección, y la actividad del indicador se puede medir en cultivo como se ha descrito previamente 26. Alternativamente, los resultados del ensayo de luciferasa también se puede verificar usando un ensayo convencional que no se basa en la alimentación. Por ejemplo, la PCR cuantitativa ha sido un método que se usa para medir los niveles de expresión de péptido antimicrobiano (AMP) mRNA. AMP son objetivos conocidos de NFkB, y por lo tanto indicar su nivel de actividad.
El representante datA descrito aquí recapitular trabajos anteriores que muestran que NFkB se eleva con el desafío inmunológico y el consiguiente aumento en el sueño 2. Sin embargo, se advierte a los lectores que duermen en el sistema DAM Trikinetics se indica por inactividad durante un mínimo de cinco minutos consecutivos 27. Medición de sueño en la mosca de la videografía también se basa en inactividad 28. Esta definición del sueño en moscas potencialmente puede ser problemática durante una infección, ya que también se sabe que los animales expuestos inmunes se vuelven inactivas durante largos períodos sin dormir 29. Para superar este problema, los ensayos que la sensibilidad sensorial medida necesarias para verificar que las moscas son realmente dormido. Los investigadores han determinado la capacidad de respuesta de las moscas a los estímulos sensoriales, tales como un lápiz grifo 30, el cepillado de los tubos de la actividad con un palo de madera 31, o calefacción un extremo de un tubo 27. En todos los casos, las moscas de dormir son menos sensibles (medidoya sea por la latencia de respuesta o por ciento vuela responder como grupo) que las moscas despiertos. Se ha encontrado que las moscas infectadas que están durmiendo son de hecho menos sensible a los estímulos sensoriales hasta 6-8 horas después de la infección (Th. Kuo y Williams JA, observación no publicada). A pesar de las limitaciones técnicas, el sistema DAM Trikinetics proporciona una ventaja de alto rendimiento que será útil para futuros estudios en moscas que exploran un vínculo genético y molecular entre el sueño y la función inmune.
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Disclosures
No hay conflictos de interés declarado.
Acknowledgments
Este trabajo fue financiado por la National Science Foundation bajo la subvención # IOS-1025627 y por los Institutos Nacionales de Salud, bajo la concesión # 1R21NS078582-01 a MORDAZA
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Incubators | Percival Scientific, Inc. | I30BLLC8 I36VLC8 |
Any incubator capable of running programmed light/temperature schedules is appropriate. |
| Drosophila Activitiy Monitors | Trikinetics Inc., Waltham, MA | DAM2 | As described elsewhere6, this system requires a computer interface, software, and other accessories. |
| Pyrex Glass Tubes | Trikinetics Inc., Waltham, MA | PGT-5x65 | |
| Microplate scintillation and luminescence counter | Perkin Elmer | TopCount NXT 12 detector |
Any microplate reader capable of detecting luminescence can be used for this type of reporter assay. TopCount contains multiple detectors and an automated stacker; it is capable of being programmed to read continuously from multiple plates. |
| FluorChem 8900 | Alpha Innotech | Imaging of bacterial cultures is optional; any digital imaging system with visual light capability is sufficient. | |
| Micropipette Puller | Tritech Research, Inc. | Narishige PC-10 | |
| Supplies | |||
| Borosilicate Glass Capillaries | World Precision Instrument Inc. | 1B100F-4 | |
| 3 ml Syringe | Fisher Scientific | BD 305482 | |
| Syringe Needles | Fisher Scientific | BD 305196 | 18 G - cut off the tip of the needle to prevent damage to the tubing. |
| Silicone Tubing, i.d. (0.030") o.d. (0.065") Wall Thickness (0.018") | VWR | 60985-706 | Used for attaching glass capillary needles to a syringe |
| 3 Way Stopcock | American Pharmaseal Company | K75 | |
| Kontes Pellet Pestle Cordless Motor | Fisher Scientific | K749540-0000 | |
| Kontes Pellet Pestle | Fisher Scientific | K749521-1590 | |
| Glass balls 3mm | VWR | 26396-630 | |
| Microplate Microlite 1+ | Thermo Scientific | 7571 | Select 96-well plates that are appropriate for luminescence - they must be opaque. |
| TopSeal-A:96-well Microplates | PerkinElmer | 6005185 | Microplate Press-On Adhesive Sealing Film |
| D-Luciferin, Potassium Salt | Gold BioTechnology, Inc. | LUCNA | |
| Software | |||
| Insomniac2 | Available upon request to the authors | custom; written by Lesley Ashmore, Ph.D. (Westminster College) | Matlab based software that has been used routinely for analysis of sleep2,6,11 |
| Drosonex | Available upon request to the authors | custom; written by Thomas Coradetti (Sidewalk Software) | A PC MSVC6 program used for survival analysis from raw data files collected with the Trikinetics system |
| Photoshop CS3 | Adobe | Useful for obtaining numbers of cfu/plate from digital images (optional) | |
References
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