Summary
För att förstå en koppling mellan immunförsvaret och beteende, beskriver vi en metod för att mäta motorisk beteende
Abstract
En komplex interaktion mellan immunsvaret och värd beteende har beskrivits i ett brett spektrum av arter. Överskott sömn, i synnerhet, är känd att inträffa som en följd av infektion hos däggdjur 1 och har även nyligen beskrivits i Drosophila melanogaster 2. Det är allmänt accepterat att sömnen är fördelaktigt för värden under en infektion och att det är viktigt för upprätthållandet av ett stabilt immunsystem 3,4. Emellertid är experimentellt bevis som stöder denna hypotes begränsad 4, och funktionen av överskott sömn under ett immunsvar är fortfarande oklart. Vi har använt ett tvärvetenskapligt synsätt för att ta itu med detta komplexa problem, och har genomfört studier i den enkla genetiska modellsystem, den fruktflugan Drosophila melanogaster. Vi använder en vanlig analys för att mäta motorisk beteende och sova i flugor, och visa hur denna analys används för att mäta beteende i flugor infected med en patogen stam av bakterier. Denna analys är också användbar för att övervaka varaktigheten av överlevnad i enskilda flugor under en infektion. Ytterligare åtgärder för immunförsvaret inkluderar möjligheten av flugor för att rensa en infektion och aktivering av NFkB, en viktig transkriptionsfaktor som är central för den medfödda immunsvaret i Drosophila. Både överlevnad och bakteriell clearance vid infektion är tillsammans indikatorer på motstånd och tolerans mot infektioner. Resistens hänför sig till förmågan av flugor för att rensa en infektion, medan toleransen definieras som förmågan hos värden att begränsa skador från en infektion och därigenom överleva trots höga nivåer av patogen inom systemet 5. Realtidsövervakning av NFkB aktivitet under infektion ger en inblick i en molekylär mekanism för överlevnad under infektion. Användningen av Drosophila i dessa enkla analyser underlättar genetiska och molekylära analyser av sömnoch immunförsvaret och hur dessa två komplexa system har motsvarande påverkas.
Protocol
Detta protokoll använder två uppsättningar (figur 1) att förvärva fyra olika avläsningar som samlats in från flugor utsatta för en bakteriell infektion. Dessa utgångar inkluderar 1) sömn / vakna beteende, 2) överlevnad, 3) bakteriell belastning i gylfen, och 4) i realtid mätning av NFKB reporter aktivitet in vivo. I kombination med de genetiska verktyg som är tillgängliga i Drosophila, dessa mätningar ger mekanistiska inblick i den molekylära kopplingen mellan immunförsvar och beteende.
1. Mät rörelseaktivitet och sova i flugor
- Installationsprogrammet används för att mäta rörelseaktivitet och sova i flugor, som inkluderar Drosophila-systemet aktivitet övervakning (DAM2, Trikinetics), inkubatorer, mörkt rum, och beredningen av försöksdjur och rör verksamhet, har beskrivits tidigare 6. Samma tillvägagångssätt används här, med några mindre modifieringar.
- Aktivitet rör rengöras för återanvändning genom kokning på en het platta i avjoniserat vatten. En liten mängd tvättmedel tillsätts för första koka, rören väl sköljdes och kokades två gånger. Om garn används för att ansluta röret kan använda aktivitet rör (innehållande mat, vax, fluga och garn) rengöras utan föregående avlägsnande av garnet.
- Innan initiering ett experiment, iscensatt plats kulturer innehåller sena pupal flugor i kuvöser för 3-4 dagar att anpassa sig till experimentell belysning och andra miljöförhållanden. Ljus: mörker eller konstant villkor har vanligen används för att mäta sömnen beteende. I detta exempel flugor acklimatiserade till konstant ljus för att eliminera inverkan av dygnsrytm klockan på immunsvaret och beteende 2,7,8. Som beskrivs i figur 1A 6, och spela för minst tre dagar före infektion.
2. Infektera Flugor med en patogen stam av bakterier
- Protokollet som beskrivs här är specifik för S. marcescens, som är lätta att odla och underhålla. Protokoll för långsiktig lagring och kultur för andra bakteriearter kommer att variera. S. marcescens lagras i 15-50% glycerol vid -80 ° C. För att förbereda för långsiktig lagring, blanda 2 volymer natten bakteriekultur (OD 600 = 0,5 - 1,0) till 1 volym autoklaverat 50% glycerol i 1,5 ml mikrorör. Detta kommer att resultera i en slutlig glycerolkoncentration av 17%. Lagra rören vid -80 ° C. För att förbereda en kortsiktig vid användning källa bakterier, skrapa den frysta lager med en steril 200 ul pipettspets och utföra en trevägs strimma på en LB-agarplatta. Inkubera plattan över natten vid 37 & dt.ex., C för att få isolerade kolonier. Förvara plattan vid 4 ° C.
En dag före den schemalagda infektion, plocka en enda koloni från LB-agarplatta med en steril 200 pl pipettspetsen och dränka spetsen i ett odlingsrör innehållande 5-medium ml LB. Odla bakterier över natten eller upp till 16 h inuti en inkubator skakapparat vid 37 ° C och 250 rpm tills den når den exponentiella tillväxtfasen. Mät koncentration med en spektrofotometer vid OD 600. Koncentrationen i denna fas varierar från 0,5 till 1. Om koncentrationen är för hög, subkultur bakterierna och växa i ytterligare flera timmar för att få en optimal koncentration. Utföra proceduren nära en flamma källa. Vissa bakteriestammar är konstruerade för antibiotikaresistens och odlas och selekteras för lämplig antibiotika tillsattes till mediet. S. marcescens (ATCC # 8100) är inte antibiotika resistenta och därför odlas i sterilt medium utan antibiotikum. För att kontrollera steril teknik, göra en mock kulture utan bakterier som en kontroll.
Lösningen på infektera flugor innehåller bakterier (utspädd till OD 600 = 0,1) och 1% karamellfärg (Brilliant Blue FCF) i PBS. Bered en lösning för injektion kontroll genom att tillsätta motsvarande mängd LB-medium som används vid infektion lösning och 1% blå karamellfärg i PBS. Butikslösningar på is. - Förbered glas nålar för att injicera flugorna. Drag glaskapillärer (OD = 1 mm, id = 0,58 mm, WPI) till en fin spets med en mikropipett avdragare (Narishige). Under ett dissektionsmikroskop, använd fin pincett för att bryta av spetsen av nålen så att öppningen är tillräckligt stor för att fylla med injektionsvätska genom försiktig sugning med en spruta, men tillräckligt liten för att minimera skador på flugan under injektionsprocessen. Efter att ha brutit spetsen, bör spetsen storlek vara runt 40-50 pm. Glaset Nålen är fäst vid en 3 cm ^ plastspruta med en rörlängd. Flödet av injektionsmedium styrs manuellt applicera positivt tryck eller suktion med sprutan. Undvik att förorena gummislangen med injektionsvätska, då sprutan anordningen används för både infektion och injektioner kontroll.
- Söva flugor genom att sätta dem på en CO 2 pad. CO 2 leds genom en förseglad behållare med vatten för att fukta dynan och att minska statisk elektricitet, som kan komplicera manipulering av flugor på dynan. Injicera flugor genom att peta glas nålen i området ovanför scutellum av den dorsala torax. Tidens injektionsmedium i farten kontrolleras av karamellfärg - flugor blir blå som sprider karamellfärg genom systemet. Dosen av bakterier som flugor får kan kvantifieras enligt beskrivningen i avsnitt 3 nedan. Några experimentella utformningar inkluderar en kontrollgrupp som får aseptisk skada genom att injicera flugor med PBS och karamellfärg men utan bakterier.
3. Bestäm Bakteriell belastning
Ett tillvägagångssätt för evaluating. immunsvaret mot bakteriell infektion är att bestämma den bakteriella infektionen belastningen inlägget. D. melanogaster är en bra modell för att bestämma denna parameter eftersom hela fluga kan homogeniseras för att uppskatta det totala bakteriella nummer inom en individ. Logiken bakom detta protokoll är att när den odlas på ett fast medium, såsom Luria buljong (LB)-agar i en petriskål (LB-platta), bildar en enda bakterie en synlig urskiljbar koloni. Därför, genom homogenisering infekterade flugor i flytande LB-medium, genererar serieutspädningar av homogenatet, och sprida den utspädda homogenatet på LB-plattor, kan antalet bakterieceller infekterar en fluga bestämmas. En kontrollgrupp av flugor som injicerats med PBS och karamellfärg men utan bakterier bör användas för att kontrollera att infektionen inte var förorenad med andra bakteriearter. Det bör inte finnas några kolonier på LB-agarplatta i detta tillstånd.
- Autoklavera alla material som kommer att användas för dettaförfarande innan du utför själva homogeniseringssteget. Detta inkluderar 200 ul pipettspetsar skära med sax, media LB och pestles används för homogenisering. Förbered plåtar genom att hälla autoklaverat LB / agarmedium i 10 cm sterila petriskålar minst 1 dag innan homogenisering flugor.
- Söva och samla flugor i 1,5 ml mikrocentrifugrör och rör lagra på is.
- Utför homogenisering nära en flamma för att förhindra kontaminering. En kontroll homogenisering med flugor utan infektion rekommenderas särskilt när du använder en bakteriestam som S. marcescens, som inte är antibiotikaresistenta. Homogenisera minst 2 grupper om 10 flugor vardera per experimentell betingelse. Antalet flugor som används per homogenat bestäms av försöksledaren. Vissa grupper har använt en fluga per homogenat, vilket är användbart för utvärdering av variationen i bakteriell belastning mellan enskilda flugor 8, medan andra har använt 3 till 10 flugor per homogenatatt jämföra olika genotyp eller experimentell tillstånd 9-12.
- Tillsätt 400 | il LB-medium till varje mikrocentrifugrör innehållande flugor och homogenisera med en liten motor och mortelstöt (Kontes).
- Använda steriliserade skurna pipettspetsar, serienummer späd homogenatet 1:10 genom att tillsätta 20 ^ homogeniserad LB / bakteriell medium till 1,5 pl mikrocentrifugrör innehållande 180 ul LB-medium. Cutting pipettspetsar förhindrar blockering från Fly skräp och ser till att en lämplig volym överförs.
- Utspädningsfaktor bestämmes empiriskt och beror på genotypen av flugan, den bakteriestam som används, och experimentell betingelse. För vildtyp flugor infekterade med S. marcescens använda spädningar av 1:10 2 eller 01:10 3 för flugor homogeniserade omedelbart efter infektion, och spädningar av 1:10 4 eller 1:10 5 för flugor homogeniseras 24 timmar efter infektion.
- Tillsätt 100 ul LB / bakteriellt medium från micenrocentrifuge rör innehållande den slutliga utspädningen och sprida mediet på en LB-platta med användning av glaskulor (VWR) för att säkerställa en jämn fördelning.
- Kassera glaskulor i 100% EtOH-lösning. Placera LB-plattor i en 37 ° C inkubator över natt.
- Som ett valfritt steg, använd ett avbildningssystem med visuell ljus för att få en bild av LB-plattor (FluorChem 8900, Alpha Innotech). Räkna antalet kolonierna antingen på själva plattan eller från bilden av plattan med räknar verktyget på Photoshop programvara (Adobe Photoshop CS3).
- Beräkna antalet kolonibildande enheter per fluga med formeln: [n / (N * D * v)] * V, där n = antal kolonier odlade på LB-platta, N = antalet flugor samlas i en mikrocentrifugrör, D = utspädningsfaktor, och v = volym lösning spreds på varje platta, V = ursprunglig volym av homogenatet.
4. Utvärdera Sömn och överlevnad Varaktighet efter infektion
- Förflugor som inte skördas för att mäta bakteriell belastning, fortsätta att övervaka beteendet i ytterligare 7-10 dagar. Överlevnad varaktighet påverkas av genotyp av i farten, miljöförhållanden och bakteriearter som används för infektion.
- Efter ~ 10 dagar avsluta experimentet hämta och bearbeta beteendedata som tidigare beskrivits 6. Insomniac2 anpassade program som baseras i Matlab, används för att analysera sömn parametrar. Det är viktigt att eliminera döda flugor från beteendeanalys. Normalt begränsar denna analyser inom den första dagen efter infektion, beroende på vilken typ av infektion och flyga genotyp. Död i analysen indikeras av den tidpunkt då samtliga aktivitetsräkningar har nått noll. För att underlätta analysen av överlevnad, Drosonex, anpassade programvara skriven i Microsoft Visual C + + 6,0, används för att behandla rådata filer från Trikinetics DAM-systemet. Programvaran rapporter Excel-filer, överlevnad varaktighet varje fluga (i timmar), sammanställer aktiviteten daten från alla bildskärmar till en enda kalkylblad och rapporterar procent flyger överleva tiden som ställts in av användaren. Excel-filer är utformade för att integreras i andra statistiska programpaket för vidare analys.
5. Mät NFkB aktivitet under infektion med användning en Luciferas reporteranalys
Transgena KB-luc flugor användes vid denna analys genererades tidigare såsom beskrivits i Kuo et al., 2010 2. Kortfattat innehåller KB-luc reporter 8 upprepningar av en NFKB bindningssekvens som insattes i en promotor uppströms om en luciferas öppna läsram.
- Justera flugor till experimentella ljusförhållanden som beskrivs i avsnitt 1,2. I detta exempel är 1-4 dagar gamla KB-luc flugor inrymt i injektionsflaskor innehållande en 5% sackaros, 2% agar mat medium och placeras i konstant ljus (LL) i 2 dagar för att nå samma ålder som andra flugor under infektion.
- Bered en 96-brunnars mikroplatta för flugor. Varje brunn innehåller 2 skikt av livsmedel medium (figur 2), det övre skiktet innehåller luciferin, substratet för luciferas. Lägg 300 pl av en 5% sackaros, 2% agar-lösning till varje brunn och låt stelna. Därefter lägger en 50 pl toppskikt till varje brunn innehållande 5% sukros, 1% agar, och 2 mM luciferin (guld Biotechnology, Inc.). Luciferin koncentrationer som används för mätning reporteraktivitet i Drosophila har varierat i litteraturen, och har varit så låg som 100 pM 13. Den koncentration som krävs kan bestämmas empiriskt. Mellan fördela de livsmedel lagren, täck plattan med ett finmaskigt tyg för att underlätta torkning med bibehållen sterilitet. Plattan ska torka ordentligt, upp till en timme, för att undvika flugor från att fastna i kondens droppar. Eftersom luciferin är ljuskänsligt, undvika att utsätta plattorna för ljus mer än nödvändigt.
- Applicera en klar limfilm (Topp-Seal-A, Perkin Elmer) till en 96-brunnars mikrobrunnsplatta och perforerat med en fin nål vid en mängd av 2 hål per brunn. Dessa hål kommer inte bara att luftväxlingen i varje brunn, men kommer också att ge ett sätt att söva flugor på individuell basis. Med hjälp av en vass kniv och rak, införa ett snitt mellan varje kolumn. Detta kommer att ge ett enkelt sätt att lasta / lossa flugor i grupper om 8 åt gången.
För att ladda flugor i mikrobrunnsplatta, ta bort flaskorna från inkubatorn och söva flugor på en CO 2 pad. Load flyger en och en till varje brunn kolonn-efter-kolonn. Om en flyga oavsiktligt fastnar i limmet tätningen, lämna flugan ensam som de ofta kan frigöra sig utan ingripande. Returnera mikrobrunnsplatta till inkubatorn i LL för 8-24 timmar för att anpassa sig till den nya miljön och att konsumera luciferin substrat. - Kultur bakterier, S. marcescens, och förbereda en lösning för infektion såsom beskrivits ovan.
- Bedöva tHan flyger med hjälp av en mikropipett spets fäst vid ett lågt tryck CO 2 rad. Placera mikropipett spets direkt ovanför ventilationshålen görs för varje brunn. Ta försiktighet för att säkerställa att CO 2 trycket är tillräckligt högt för att bedöva flugan, men tillräckligt låg för att undvika skador på flugan. I grupper om åtta, individuellt överföra varje fluga till en CO 2 dyna, och infektera såsom beskrivits ovan. Efter infektion tillbaka varje fluga till dess ursprungliga väl och återförsluta mikroplattan.
- Mät luminescens (TopCount-NXT Luminescence och scintillationsräknare, Perkin-Elmer). Den TopCount luminiscens Räknaren innehåller en stapling kassett för plattor, vilket ger utrymme för programmerade och automatiska avläsningar kontinuerligt vid önskad steg för någon längre tid (vanligtvis upp till fem dagar). Denna funktion är inte tillgänglig på alla instrument, och datainsamling för experiment utförda med andra instrument kan därför vara mindre frekvent. Den luminiscens Räknaren är inrymt i ett roOM med en kontrollerad temperatur och belysning schema. När du laddar plåtar i stapling kassetten stapla plattorna innehåller flugorna mellan tydliga tomma tallrikar för att säkerställa att flugor får ljus. Programmera luminometern enligt tillverkarens specifikationer för att samla avläsningar varje timme under minst 24 timmar. I detta exempel, är detektorerna programmerade att läsa varje brunn under 10 sek och uttrycka resultatet som räknas (godtyckliga enheter) per sekund. Detta värde genomsnitt över 3 avläsningar per brunn. Exportera datafiler till ett kalkylblad och utföra en vanlig analys grafiska resultat luminiscens.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
- Infektion främjar sömn. I detta exempel, (CS) Canton-S-vildtyp flugor och mutanta flugor som saknar en gen NFkB, Relish (Rel E20) 14, satsades i två DAM2 aktivitet bildskärmar (n = 32 för varje genotyp) och infekterades såsom beskrivits ovan. Flugor hölls i konstant ljus för att eliminera inverkan av dygnsrytm klockan på beteende och infektion 2,7,8. REL E20 mutanterna isogenized till CS som beskrivits tidigare 11. Båda flugor var infekterade med S. marcescens och resultaten visas i Figur 3. I vissa fall är en ytterligare hanteras kontrollgrupp användbar för differentiering effekter av hanteringen från effekterna av infektion 2. Hanteras kontrollgrupper exponeras för samma miljöförändringar som de infekterade grupper, vilket inkluderar avlägsnande från inkubatorer och bedövning under samma tidsperiod, men de inte får en injektion. Emellertid, i detta exempel, är det klart att Rel E20 mutanter upplever mindre sömn än CS kontroll flyger efter infektion (figur 3A). Såsom beskrivits tidigare 6, finns det andra beteendemässiga parametrar som kan mätas från DAMS analysen. Dessa kan innefatta total aktivitet räknas per tidsenhet (Figur 3B). I detta exempel förändringen i aktivitet efter infektion speglar som sömn. Vi rapporterar också förvärvsfrekvens, eller räknas aktivitet per vaken minut (Figur 3C). Denna parameter är en indikator på rörelseapparaten förmåga i flugor. I det här fallet, ändrar vakna förvärvsfrekvensen inte i någon genotyp under infektion, vilket tyder på att minskning av aktiviteten eller ökning i sömnen är inte ett resultat av minskad motorisk förmåga.
- Figur 4A visar graden av överlevnad efter infektion. I överensstämmelse med tidigare resultat 14,15, Rel E20 mutanter snabbt efter för ifection jämfört med vildtyp flugor. De flesta flugor överlevde den aseptiska kontroll injektion (Figur 4B), vilket indikerar att flugor efter för infektionen och inte till skada på grund av injektionen. Eftersom Relish mutanterna dog så snabbt var det endast CS flugor som används för att påvisa bakteriell belastning efter infektion (Figur 5). 5 visar att S. Bild marcescens fortsätter att proliferera i farten 24 timmar efter infektion.
- Luciferas reporteraktivitet avbildas över tiden i analysen i fyra individuella flugor (Figur 6). Stor variation mellan datapunkter och enskilda flugor kan hänföras till flugorna rör runt i brunnarna. Även om signalen kommer från alla vävnader i farten, är det inte troligt att varje vävnad skulle avge samma mängd signal och synlighet vävnaden till detektorn skulle variera då flyga rör sig. I detta exempel, har flugor infekterade och jämfördesmed en hanteras kontrollgrupp. Flugor som dog uteslöts från analysen över en grupp flugor som visas i figur 7A. Döda flugor bestäms genom visuell inspektion. I dessa flugor, finns en kraftig minskning i luciferas signalen, liksom en minskning i signal variation indikerar att flugan inte rör sig. KB-luc reporter aktivitet stadigt stiger efter infektion (figur 7A) och aseptisk skada (figur 7B ). Reportern aktivitet toppar runt 12 h efter skada och efter infektion. Både genetiska och / eller beteendemässiga manipulationer av flugor förväntas ändra KB-luc reporter aktivitet under infektion. Till exempel beskrev vi tidigare 2 att induktionen av KB-luc reporter aktivitet var i stort sett dämpas under infektion i Rel E20 mutanter, vilket indikerar denna KB-luc reporter är specifik för NFkB.
Figur 1. Flödesschema som beskriver de viktigaste stegen i att mäta immunsvar hos Drosophila (A) sekvens av steg beskrivs för att mäta sömn, överlevnad och bakteriell belastning under en infektion,. (B) sekvens av steg beskrivs för mätning av NFKB-beroende luciferas reporter aktivitet under infektion. Experiment kan fortsätta allt från 1-5 dagar, beroende på letaliteten av bakteriella använda arter.
Figur 2. Schematisk bild av en enskild mikroplatta väl. Flugor placeras i ogenomskinliga, 96 brunnar innehållande medium och omfattas som visas. Eftersom flugor kommer individuellt hanteras vara smittade, är det viktigt att to begränsa antalet flugor per platta till ett belopp som rimligen kan hanteras inom en given tidsperiod, beroende på de experimentella förhållandena.
Figur 3. Beteende respons flugor infekterade med S. marcescens. (A) Medelvärde ± SEM procent tid som flyger spenderat sova och (B) medelvärde ± SEM total aktivitet räknas plottas i 4 tim steg för 1 dag före och efter infektion med S. marcescens. (C) medelvärde ± SEM aktivitet räknas per vaken minut före (BL = utgångsvärde) och efter infektion med S. marcescens är avsatt i 8 tim steg. Beteende redovisas för vildtyp CS flugor som överlevde i minst 24 timmar efter infektion, och för immun-brist Rel E20 flyger THAt överlevde i minst 8 timmar efter infektion. n = 13 för CS och Rel E20. ** = P <0,01 och * = p <0,05, Students t - test.
Figur 4. Överlevnad av infekterade och oinfekterade flugor. (A) Representativa Kaplan-Meier överlevnadskurvor plottas för både vild-typ CS och immun-brist Rel flugor E20 som var infekterade med S. marcescens. p = 8.13x 10 -13, log rank test. n = 31 för CS och n = 32 för Rel E20 flugor. (B) Representativa Kaplan-Meier överlevnadskurvor redovisas i (A), med undantag av flugor erhöll aseptisk skada genom injektion med flytande media utan bakterier. Nästan alla flugor överlevde aseptisk skada fram till slutet av experimenten (60 timmar efter skada). p> 0,97, log rank test, n = 32 för CS och Rel E20 flugor.
Figur 5. Kvantifiering av bakteriell belastning i flugor infekterade med S. marcescens. (A) representant bakteriekultur från CS flugor infekterade med S. marcescens som skördats omedelbart efter infektion (vänster panel), eller 24 timmar efter infektion (höger panel). Spädningsfaktorer anges under varje figur. I detta exempel, har 10 flugor homogeniserades i 400 | il lösning för varje grupp. 100 pl av den slutliga utspädningen spreds på varje platta. Den vänstra plattan innehåller 29 kolonibildande enheter (cfu). För att beräkna cfu / flyga, dela 29 cfu av [10 flugor * 0,001 (spädningsfaktor) * 100 pl (volym sprids på plattan)], vilket motsvarar 29, och sedan multiplicera med den ursprungliga volymen 400 pl = 11.600. För denna särskilda plåt, har vi ett genomsnitt av 1,16 x 10 4cfu / fluga. Den högra plattan innehåller 257 kolonier. Med samma formel, finner vi i genomsnitt 1,03 x 10 6 cfu / fluga. (B) Efter beräkning cfu / fluga från varje platta i varje experimentell betingelse, generera box-och morrhår diagram som visas. I detta exempel är den 25: e, 50: e (median) och 75: e percentilen presenteras som botten, mitten och toppen av lådan. Felstaplar representerar standardavvikelse över tre oberoende experiment. ** P <0,01 Students t-test.
Figur 6. NFkB beroende luciferas reporteraktivitet i enskilda flugor infekterade med S. . marcescens Representativa exempel på rådata visas för enskilda oinfekterade flugor (hanteras kontroll, vänster paneler) och infekterade flugor (högra panelerna). En baslinje behandlingen (tid '0 ') samlades omedelbart före infektion eller hantering, alla andratidpunkter uppsamlades efter flugor behandlades. Notera skillnaderna i omfattning i Y-axlarna mellan flugor i den infekterade och hanteras kontroll förhållanden. Stor variation av signalen i varje fluga kan tillskrivas rörelse flugan inom brunn.
Figur 7. Infektion med S. marcescens eller skador med aseptisk injektionsteknik ökar KB-luc reporter aktivitet i levande flugor. Medelvärde ± SEM luciferasaktiviteten (godtyckliga enheter) plottas varje 4 timmar i alla flugor som var infekterade (A) eller skadas av aseptisk injektionsteknik (B) och överlevde upp till 24 i analysen. Envägs ANOVA med upprepade mätningar visade att reporter aktiviteten ökat betydligt under infekterade (p <0,05), skadade (inj, p <0,01), och deras hanterade kontroll (HC, p <0,01) grupper i förhållande till deras baslinje (tid 0 ", Tukeys post-hoc). (Infoga, panel A): är Data från HC-gruppen ritas i en annan skala. Den lilla men signifikant ökning av reporter aktivitet i HC-gruppen föreslår att flugor kan ha upplevt mild stress eller ökad vakenhet vid hantering (överföring till och från mikrobrunnsplatta och bedövning motsvarande infekterade flugor). Både de infekterade och skadade grupper visade starka induktioner av KB-luc reporter aktivitet som var betydligt högre än i HC gruppen vid angivna tidpunkter * = p <0 0,05, ** = p <0 0,01,. Students t - test, för (a) n = 20 HC och n = 13 Infektion, för (B) n = 15 HC och n = 14 skada.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Detta protokoll beskriver en metod för att undersöka hur beteende, särskilt sova, är kopplad till immunsvar parametrar. Dessa parametrar inkluderar bakteriell belastning, överlevnad, och NFkB aktivitet mätt genom en luciferas reporter in vivo. Tillsammans dessa parametrar ger information om hur bra en fluga kan bekämpa en infektion. Bakteriell belastning och överlevnad är immunsvar parametrar som innebär en enkel mätning i Drosophila. Rel E20 mutanter som saknar en NFKB transkriptionsfaktor som är central för immunförsvaret, duka snabbt bakteriell infektion. Genetiska eller andra manipulationer av beteende kan också påverka dessa immunsvar parametrar, eventuellt genom att påverka NFkB aktivitet i sig. Till exempel, sömnbrist före infektion ökar uttryck av Relish-mRNA, och minskar cfu / flyga förhållande till icke-utsatta reglage 11. Mutants av klockan gener, period 7 och tidlös 8, har också rapporterats minska överlevnad under en infektion samt bakteriell clearance 8. Ytterligare studier som använder denna metod förväntas ge mekanistisk insikt i hur beteende kan påverka immunförsvaret.
Injektionen / infektion förfarande vi beskriver här är modifierad från en metod som tidigare beskrivits av Wu et al 16. Detta förfarande är enkelt och billigt. Emellertid är en nackdel som manuell styrning av injektionsvolym med användning av färgämnet som en indikator är rå och kan bidra till variation. Andra grupper har använt en microinjector att möjliggöra en konstant injektionsvolym 17, eller har knivhuggen flugor med en nål doppad i bakteriekultur 18. Ändå har metoden som presenteras här lyckats upptäcka förändringar i bakteriell clearance över experimentella förhållanden 11,19 </ Sup>.
Överlevnad av flugor under infektion vanligtvis kvantifieras genom att räkna de återstående flugor med jämna tidsintervall. Här använder vi Trikinetics DAM system för att övervaka tiden för dödsfallet i enskilda flugor, vilket indikeras av upphörande av verksamheten. Vi har verifierat att överlevnad som bestäms av rörelseaktivitet är densamma som bestämts genom visuell inspektion av flugor i verksamhetsrapporterna rören under infektion (opublicerad). Denna metod har också använts tidigare för att mäta livslängd 20,21. Det är dock viktigt att notera att utvärdering av överlevnad i DAM-systemet är begränsat till det i isolerade flugor, och att resultaten härrör från detta tillstånd förväntas vara annorlunda än de i grupperade förhållanden. Tidiga studier har visat skillnader i överlevnad när värden placeras i grupper kontra isolerade förhållanden 22. Senaste arbete har också bekräftat att livslängden i grupper av flugor är längreän i enstaka flugor 20.
Luciferas reporteraktivitet har använts tidigare för analys av klockan genuttryck i levande flugor (till exempel, ref 23). I dessa fall, andra tekniska överväganden är nödvändigt, i synnerhet utarmning av luciferin substratet som inträffar under flera dagar för att köra analysen. I motsats, beskrivna analysen här är begränsad till överlevnad av infekterade flugor och involverade en enkel mätning över 24 timmar efter infektion. En upprepad åtgärder ANOVA var tillräcklig för att utvärdera förändringar från baslinjen inom varje grupp. Statistiska metoder för analys av en dygnsrytm svängning av luciferas reportrar, tillsammans med normalisering steg för att korrigera för substrat utarmning är helt diskuteras på annat håll 24. I båda fallen, mäter realtid reporteraktivitet i enskilda flugor är en mer effektiv metod för att extrahera information om dess temporal dynamik än standard biokemiska och immunohistokemiska analyser.
Emellertid, är en potentiell nackdel att övervaka luciferas reporter aktivitet in vivo att det är beroende av flugor som äter luciferin substratet. Anorexi har associerats med infektion i flugor, och utfodring kan också variera med vilken typ av infektion eller bland genotyper 25. För att kringgå oro intag av substratet, kan flugor dissekeras i separata kroppsdelar eller vävnader efter infektion, och reporter aktivitet kan mätas i odling, såsom beskrivits tidigare 26. Alternativt, kan resultat från luciferasanalysen också kontrolleras med hjälp av en standardanalys som inte förlitar sig på matning. Till exempel, har kvantitativ PCR varit ett vanligt tillvägagångssätt för att mäta uttrycksnivåer av antimikrobiell peptid (AMP)-mRNA. AMP är kända mål NFkB och därför ange sin aktivitetsnivå.
Den representativa daten beskrivs här rekapitulera tidigare arbete visar att NFkB stiger med immun utmaning och en senare ökning sömnen 2. Men läsarna varnade för att sova i Trikinetics DAM-systemet indikeras av inaktivitet under minst fem minuter i följd 27. Mätning av sömn i farten med videography bygger också på inaktivitet 28. Denna sömn definition flugor kan potentiellt vara problematiskt vid en infektion, eftersom det är också känt att immun utmanade djur blir inaktivt under långa perioder utan att sova 29. För att lösa detta problem, analyser som mäter sensorisk respons är nödvändig för att kontrollera att flugor är verkligen sover. Utredarna har bestämt lyhördhet flyger till sensoriska stimuli, till exempel en penna kran 30, borsta verksamhet rör med en träpinne 31, eller uppvärmning ena änden av ett rör 27. I samtliga fall, sovande flugor är mindre känsliga (mättantingen genom reaktion latens eller procent flugor svara som en grupp) än vakna flugor. Vi har funnit att infekterade flugor som sover verkligen mindre känsliga för sensoriska stimuli upp till 6-8 timmar efter infektion (Th. Kuo och JA Williams, opublicerad observation). Trots de tekniska begränsningar ger Trikinetics DAM-systemet en hög genomströmning fördel som kommer att vara användbar för framtida studier inom flugor som utforskar en genetisk och molekylär länk mellan sömn och immunförsvar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av National Science Foundation i bidrag # IOS-1025627 och av National Institutes of Health i bidrag # 1R21NS078582-01 till JAW
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Incubators | Percival Scientific, Inc. | I30BLLC8 I36VLC8 |
Any incubator capable of running programmed light/temperature schedules is appropriate. |
| Drosophila Activitiy Monitors | Trikinetics Inc., Waltham, MA | DAM2 | As described elsewhere6, this system requires a computer interface, software, and other accessories. |
| Pyrex Glass Tubes | Trikinetics Inc., Waltham, MA | PGT-5x65 | |
| Microplate scintillation and luminescence counter | Perkin Elmer | TopCount NXT 12 detector |
Any microplate reader capable of detecting luminescence can be used for this type of reporter assay. TopCount contains multiple detectors and an automated stacker; it is capable of being programmed to read continuously from multiple plates. |
| FluorChem 8900 | Alpha Innotech | Imaging of bacterial cultures is optional; any digital imaging system with visual light capability is sufficient. | |
| Micropipette Puller | Tritech Research, Inc. | Narishige PC-10 | |
| Supplies | |||
| Borosilicate Glass Capillaries | World Precision Instrument Inc. | 1B100F-4 | |
| 3 ml Syringe | Fisher Scientific | BD 305482 | |
| Syringe Needles | Fisher Scientific | BD 305196 | 18 G - cut off the tip of the needle to prevent damage to the tubing. |
| Silicone Tubing, i.d. (0.030") o.d. (0.065") Wall Thickness (0.018") | VWR | 60985-706 | Used for attaching glass capillary needles to a syringe |
| 3 Way Stopcock | American Pharmaseal Company | K75 | |
| Kontes Pellet Pestle Cordless Motor | Fisher Scientific | K749540-0000 | |
| Kontes Pellet Pestle | Fisher Scientific | K749521-1590 | |
| Glass balls 3mm | VWR | 26396-630 | |
| Microplate Microlite 1+ | Thermo Scientific | 7571 | Select 96-well plates that are appropriate for luminescence - they must be opaque. |
| TopSeal-A:96-well Microplates | PerkinElmer | 6005185 | Microplate Press-On Adhesive Sealing Film |
| D-Luciferin, Potassium Salt | Gold BioTechnology, Inc. | LUCNA | |
| Software | |||
| Insomniac2 | Available upon request to the authors | custom; written by Lesley Ashmore, Ph.D. (Westminster College) | Matlab based software that has been used routinely for analysis of sleep2,6,11 |
| Drosonex | Available upon request to the authors | custom; written by Thomas Coradetti (Sidewalk Software) | A PC MSVC6 program used for survival analysis from raw data files collected with the Trikinetics system |
| Photoshop CS3 | Adobe | Useful for obtaining numbers of cfu/plate from digital images (optional) | |
References
- Majde, J. A., Krueger, J. M. Links between the innate immune system and sleep. J. Allergy Clin. Immunol. 116, 1188-1198 (2005).
- Kuo, T. H., Pike, D. H., Beizaeipour, Z., Williams, J. A. Sleep triggered by an immune response in Drosophila is regulated by the circadian clock and requires the NFkappaB Relish. BMC Neurosci. 11, 1471-2202 (2010).
- Preston, B. T., Capellini, I., McNamara, P., Barton, R. A., Nunn, C. L. Parasite resistance and the adaptive significance of sleep. BMC Evol Biol. 9, 7 (2009).
- Imeri, L., Opp, M. R. How (and why) the immune system makes us sleep. Nat. Rev. Neurosci. 10, 199-210 (2009).
- Ayres, J. S., Schneider, D. S. A Signaling Protease Required for Melanization in Drosophila Affects Resistance and Tolerance of Infections. PLoS Biol. 6, e305 (2008).
- Chiu, J. C., Low, K. H., Pike, D. H., Yildirim, E., Edery, I. Assaying Locomotor Activity to Study Circadian Rhythms and Sleep Parameters in Drosophila. J. Vis. Exp. (43), e2157 (2010).
- Lee, J. E., Edery, I. Circadian Regulation in the Ability of Drosophila to Combat Pathogenic Infections. Curr. Biol. 18, 195-199 (2008).
- Stone, E. F., et al. The circadian clock protein timeless regulates phagocytosis of bacteria in Drosophila. PLoS Pathog. 8, e1002445 (2012).
- Hill-Burns, E. M., Clark, A. G. X-linked variation in immune response in Drosophila melanogaster. Genetics. 183, 1477-1491 (2009).
- Short, S. M., Lazzaro, B. P. Female and male genetic contributions to post-mating immune defence in female Drosophila melanogaster. Proc. Biol. Sci. 277, 3649-3657 (2010).
- Williams, J. A., Sathyanarayanan, S., Hendricks, J. C., Sehgal, A. Interaction between sleep and the immune response in Drosophila: a role for the NFkappaB relish. Sleep. 30, 389-400 (2007).
- Ramsden, S., Cheung, Y. Y., Seroude, L. Functional analysis of the Drosophila immune response during aging. Aging Cell. 7, 225-236 (2008).
- Williams, J. A., Su, H. S., Bernards, A., Field, J., Sehgal, A. A circadian output in Drosophila mediated by neurofibromatosis-1 and Ras/MAPK. Science. 293, 2251-2256 (2001).
- Hedengren, M., et al. Relish, a central factor in the control of humoral but not cellular immunity in Drosophila. Mol. Cell. 4, 827-837 (1999).
- Leulier, F., Rodriguez, A., Khush, R. S., Abrams, J. M., Lemaitre, B. The Drosophila caspase Dredd is required to resist gram-negative bacterial infection. EMBO Rep. 1, 353-358 (2000).
- Wu, L. P., Choe, K. -M., Lu, Y., Anderson, K. V. Drosophila Immunity: Genes on the Third Chromosome Required for the Response to Bacterial Infection. Genetics. 159, 189-199 (2001).
- Dionne, M. S., Ghori, N., Schneider, D. S. Drosophila melanogaster is a genetically tractable model host for Mycobacterium marinum. Infect. Immun. 71, 3540-3550 (2003).
- Romeo, Y., Lemaitre, B. Drosophila immunity: methods for monitoring the activity of Toll and Imd signaling pathways. Methods Mol. Biol. 415, 379-394 (2008).
- Lu, Y., Wu, L. P., Anderson, K. V. The antibacterial arm of the Drosophila innate immune response requires an I{kappa}B kinase. Genes Dev. 15, 104-110 (2001).
- Koh, K., Evans, J. M., Hendricks, J. C., Sehgal, A. A Drosophila model for age-associated changes in sleep:wake cycles. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 103, 13843-13847 (2006).
- Bushey, D., Hughes, K. A., Tononi, G., Cirelli, C. Sleep, aging, and lifespan in Drosophila. BMC Neurosci. 11, 1471-2202 (2010).
- Allee, W. C. The social life of animals. , W.W. Norton & Company, Inc. (1938).
- Stanewsky, R., Jamison, C. F., Plautz, J. D., Kay, S. A., Hall, J. C. Multiple circadian-regulated elements contribute to cycling period gene expression in Drosophila. Embo. J. 16, 5006-5018 (1997).
- Levine, J. D., Funes, P., Dowse, H. B., Hall, J. C. Signal analysis of behavioral and molecular cycles. BMC Neurosci. 3, 1 (2002).
- Ayres, J. S., Schneider, D. S. The role of anorexia in resistance and tolerance to infections in Drosophila. PLoS Biol. 7, e1000150 (2009).
- Plautz, J. D., Kaneko, M., Hall, J. C., Kay, S. A. Independent photoreceptive circadian clocks throughout Drosophila. Science. 278, 1632-1635 (1997).
- Huber, R., et al. Sleep homeostasis in Drosophila melanogaster. Sleep. 27, 628-639 (2004).
- Zimmerman, J. E., Raizen, D. M., Maycock, M. H., Maislin, G., Pack, A. I. A video method to study Drosophila sleep. Sleep. 31, 1587-1598 (2008).
- Toth, L. A., Rehg, J. E., Webster, R. G. Strain differences in sleep and other pathophysiological sequelae of influenza virus infection in naive and immunized mice. J. Neuroimmunol. 58, 89-99 (1995).
- Hendricks, J. C., et al. Rest in Drosophila is a sleep-like state. Neuron. 25, 129-138 (2000).
- Wu, M. N., Koh, K., Yue, Z., Joiner, W. J., Sehgal, A. A genetic screen for sleep and circadian mutants reveals mechanisms underlying regulation of sleep in Drosophila. Sleep. 31, 465-472 (2008).
