Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Immunology and Infection

İmmün Yanıt ve Uyku içinde kantitatif ölçümü Published: December 4, 2012 doi: 10.3791/4355

Summary

Immün yanıt ve davranış arasındaki bağlantıyı anlamak için, lokomotor davranışları ölçmek için bir yöntem tarif

Abstract

Immün yanıtı ve konak davranış arasında karmaşık bir etkileşim tür geniş bir biçimde tarif edilmiştir. Aşırı uyku, özellikle, memelilerde 1 enfeksiyonuna yanıt olarak oluştuğu bilinmektedir ve ayrıca son zamanlarda Drosophila melanogaster 2'de tarif edilmiştir. Bu, genel olarak uyku bir enfeksiyon sırasında ana için yararlı olan ve bir güçlü bağışıklık sistemi 3,4 korunması için önemli olduğu kabul edilir. Ancak, bu hipotezi destekleyen deneysel kanıtlar 4 sınırlıdır ve bir bağışıklık yanıtı sırasında aşırı uyku fonksiyonu belirsizdir. Biz bu karmaşık sorunu çözmek için multidisipliner bir yaklaşım kullanmış ve basit bir genetik model sistem, meyve sineği Drosophila melanogaster de çalışmalar yapmıştır. Biz, sinekler lokomotor davranışlar ve uyku ölçülmesi için bir standart tahlil kullanmak, ve bu tahlil sinekler infecte davranış ölçmek için nasıl kullanıldığını göstermekbir bakteri patojen d. Bu test aynı zamanda bir enfeksiyon sırasında bireysel sinekler sağkalım süresini izlemek için yararlıdır. Bağışıklık işlevi ek önlemler enfeksiyon ve NFKB, Drosophila doğal immün yanıtı için merkezi bir anahtar transkripsiyon faktörünün aktivasyonu temizlemek için sinekler yeteneğini içerir. Enfeksiyon sırasında sağkalım sonuçları ve bakteriyel klirense Hem birlikte direniş ve enfeksiyona hoşgörü göstergeleridir. Toleransı sistem 5 içinde patojen yüksek seviyelerde olmasına rağmen bir enfeksiyon hasarı sınırlamak ve böylece hayatta kalmak için ana yeteneği olarak tanımlanır iken Direniş, bir enfeksiyon temizlemek için sinekler yeteneğini ifade eder. Enfeksiyon sırasında NFKB faaliyet Gerçek zamanlı izleme enfeksiyon sırasında hayatta bir moleküler mekanizma fikir sağlar. Bu apaçık deneylerinde Drosophila kullanımı uyku genetik ve moleküler analizler kolaylaştırırve immün yanıt ve nasıl bu iki kompleks sistemlerin karşılıklı etkilenir.

Protocol

Bu protokol, bir bakteriyel enfeksiyona maruz kalan sinek toplandı dört farklı okuma elde etmek için iki düzeneklerinin (Şekil 1) kullanır. 2) sağkalım sonuçları;; 3) sinek bakteri yükü ve 4) in vivo NFKB muhabiri aktivitesinin gerçek zamanlı ölçümü Bu çıkışlar) uyku / uyanıklık davranışları 1 içerir. Drosophila mevcuttur genetik araçları ile birlikte, bu ölçümler bağışıklık fonksiyonu ve davranışı arasındaki moleküler bağlantıyı içine mekanistik bakış açısı sağlar.

1. Sinekler Tedbir Lokomotor Aktivite ve Uyku

  1. Lokomotor aktivitesini ölçmek ve Drosophila etkinliği izleme sistemi (DAM2, Trikinetics), inkübatör, karanlık oda ve deney hayvanları ve aktivite tüplerin hazırlanması içeren, sinekler uyku için kullanılan kurulum, daha önce 6 tarif edilmiştir. Aynı yaklaşım, bazı küçük değişikliklerle, burada kullanılır.
    1. Aktivite tüpler de-iyonize su bir sıcak plaka üzerinde kaynatarak yeniden kullanım için temizlenir. Deterjan küçük bir miktar ilk kaynama ilave edilir, tüp yanı sıra iki kere durulanmış ve daha kaynatılır. Iplik tüp takmak için kullanılması durumunda, ikinci faaliyet tüpler (gıda, balmumu, sinek ve iplik içeren) iplik çıkarma işleminden önce olmaksızın temizlenebilir.
  2. Önce bir deneme başlatmak için geç pupa içeren yer kültürleri deneysel aydınlatma ve diğer çevre koşullarına uyum sağlamak için üç dört gün için kuluçka sinekler düzenledi. Işık: koyu veya sabit koşullar sık ​​uykusu davranış ölçmek için kullanılmaktadır. Bu örnekte, sinekler immün yanıt ve davranış 2,7,8 ilgili sirkadiyen saat etkisini ortadan kaldırmak için sabit ışık acclimated edilmektedir. Şekil 1A açıklandığı gibi 6, ve kayıt açıklanan izler.

2. Bakteriler bir patojen ile Sinekler Infect

  1. Burada açıklanan protokol S. için spesifiktir büyümek ve bakımı kolay olan marcescens. Diğer bakteri türleri için uzun vadeli depolama ve kültür koşulları için Protokoller. S. değişir marcescens -80 ° C 'de% 15-50 gliserol depolanır 1,5 ml mikrosantrifüj tüpleri içinde otoklavlanmış% 50 gliserol 1 hacim - uzun vadeli depolama için hazırlamak için, bir gecede bakteri kültürü 2 cilt (1.0 OD 600 = 0.5) karıştırın. Bu,% 17 gliserol nihai konsantrasyon neden olur. -80 ° C'de saklayın tüpleri Bakteri kaynağı kullanımı kısa vadeli hazırlamak için steril bir 200 ul pipet ucu ile dondurulmuş stok kazıyın ve LB agar plaka üzerinde üç yönlü bir çizgi gerçekleştirin. 37 & d gecede plaka inkübeörneğin; C izole koloniler elde etmek. 4 ° C'de depolayın plaka
    Planlanan enfeksiyondan önce bir gün, 5 ml LB ortamı içeren bir kültür tüpüne steril bir 200 ul pipet ve batığın ucuyla LB agar plaka tek bir koloni seçin. Bakteri gecede büyümek, ya kadar 37 küvöz çalkalayıcı içinde 16 saat ° C ve 250 rpm de üstel büyüme safhasına kadar. OD 600 bir spektrofotometre ile konsantrasyonunu ölçün. Bu aşamada yoğunluğu 0,5 ile 1 arasında değişir. Konsantrasyonu çok yüksek ise, alt kültür bakteri ve optimal bir konsantrasyon elde etmek için başka bir kaç saat için büyür. Bir alev kaynağının yakınında prosedürü uygulayın. Bazı bakteri suşları antibiyotik direnç için tasarlanmıştır ve büyümüş ve uygun bir antibiyotik için seçilen orta eklendi. S. marcescens (ATCC # 8100) antibiyotik dirençli değildir ve bu nedenle antibiyotik olmaksızın, steril ortamda yetiştirilen. Steril teknik doğrulamak için, bir aldatma cultu yapınkontrol olarak bakteri olmadan yeniden.
    Sinekler bulaştırmak için çözüm bakteriler (= 0,1 OD 600 seyreltilmiş) ve PBS içinde% 1 gıda boyası (Parlak Mavi FCF) içerir. PBS içinde enfeksiyon çözeltisi ve% 1 mavi renklendirici olarak kullanılan gıda LB ortamı eşdeğer miktarda eklenmesi ile enjeksiyon için bir kontrol çözeltisi hazırlayın. Buz üzerinde çözümler saklayın.
  2. Sinekler enjekte için cam iğneler hazırlayın. Bir mikropipet çektirmesi (Narishige) kullanılarak ince bir ucu cam kapilerleri (od = 1 mm, id = 0.58 mm, TEFE) çekin. Diseksiyon mikroskobu altında açılış bir şırınga ile emme uygulanarak enjeksiyon sıvı ile doldurmak için yeterince büyük, ancak enjeksiyon işlemi sırasında sinek hasarı en aza indirmek için yeterli küçük olduğunu böylece iğne ucu kopmak ince forseps kullanın. Ucu kırdıktan sonra, ucu boyutu 40-50 mikron civarında olmalıdır. Iğne cam tüp bir uzunluğa sahip bir 3 cc plastik şırınga ile eklenmiştir. Enjeksiyon ortamının akış elle pozitif bir basınç uygulanması ya da s kontrol edilirşırınga ile uction. Şırınga cihaz ve enfeksiyon kontrol enjeksiyonlar için kullanılmış olduğu gibi, enjeksiyon sıvı ile kauçuk borudan yapılmış kirletici kaçının.
  3. Bir CO 2 pad üzerinde koyarak sinekler uyuştur. CO 2 ped nemlendirmek için ve ped üzerinde uçan bir manipülasyon olarak gelişebilen statik elektrik, su azaltmak için bir kapalı kap içinden geçirilir. Dorsal toraks scutellum Yukarıdaki bölgeye cam iğne alay tarafından sinekler enjekte. Sinek içine enjeksiyon orta geçen gıda boyası ile de doğrulanmaktadır - sinekler sistemi yoluyla gıda boyası yayıldıkça maviye döner. Kısım 3 'de tanımlanan sinekler almak bakteri doz altında, ölçülebilir. Bazı deneysel tasarımlar PBS ve gıda boyası ile ancak bakteri olmadan sinek enjekte edilerek aseptik yaralanma alan bir kontrol grubu yer almaktadır.

3. Bakteriyel Yük belirleyin

Evaluatin için bir yaklaşımg bakteriyel enfeksiyona karşı bağışıklık yanıtı bakteri yük sonrası enfeksiyon belirlemektir. D. melanogaster bütün uçucu bir birey içinde toplam bakteri sayısını belirlemek için homojenize edilebilir, çünkü bu parametreleri belirlemek için bir çok iyi bir modeldir. Bu protokol arkasındaki mantık gibi Luria broth (LB) bir Petri kabı agar (LB plaka) olarak sağlam bir ortamda yetiştirilen zaman, tek bir bakterinin görünür ayırt koloni oluşturmasıdır. Bu nedenle, Homojenat seri dilüsyonları üreten ve LB plakaları üzerine seyreltilmiş homojenat yayma, LB sıvı ortam içinde enfekte sinekler homojenleştirici ile, bir uçucu enfekte bakteri hücrelerinin sayısını tespit edilebilir. PBS ve gıda boyası ile ancak bakteri olmadan enjekte sinekler bir kontrol grubu enfeksiyonu diğer bakteriyel türleri ile kontamine olmadığını doğrulamak için kullanılmalıdır. Bu durumda LB agar plakası üzerinde hiçbir koloni olmamalıdır.

  1. Bunun için kullanılacak olan malzemelerin otoklavGerçek homojenizasyon adımı gerçekleştirmeden önce prosedürü. Bu homojenizasyon için kullanılan makas, LB medya ve havan ile kesilmiş 200 ul pipet uçları içerir. Sinekler homojenleştirici önce en az 1 gün 10 cm steril Petri kutularına otoklavlanmış LB / agar besiyeri dökülerek tabak hazırlayın.
  2. Anestezisi ve buz üzerinde 1,5 ml mikrosantrifüj tüpleri ve mağaza tüpler sinekler toplamak.
  3. Kontaminasyonu önlemek için bir alev yakınında homojenizasyon gerçekleştirin. Böyle S. gibi bir bakterinin kullanırken özellikle enfeksiyon olmadan sinekleri içeren bir denetim homojenizasyon önerilir Antibiyotiğe dayanıklı değildir marcescens. 10 sinekler her başı deney koşulunda 2 grup en az homojenize. Homojenat başına kullanılan sineklerin sayısı deneyi ile belirlenir. Diğerleri Homojenat başına 3-10 sinekler kullanmış Bazı gruplar, bireysel sinekler 8 arasında bakteri yükü değişimi değerlendirmek için yararlı olduğu Homojenat başına bir sinek kullanmış9-12 genotip veya deneysel durum karşısında karşılaştırmaktır.
    1. Sinekleri içeren her mikrosantrifüj tüp 400 ul LB ortamı ekleyin ve küçük bir motor ve havaneli (Kontes) kullanılarak homojenize.
    2. Sterilize kesilmiş pipet uçları kullanarak, seri 180 ul LB ortamı içeren 1.5 ul mikrosantrifüj tüpe 20 ul homojenize LB / bakteriyel orta ekleyerek homojenat 01:10 sulandırmak. Pipet uçları Kesme anında enkaz tıkanmaları önler ve uygun bir ses aktarılıyor sağlar.
    3. Seyreltme faktörü ampirik olarak belirlenir ve sinek genotip, kullanılan bakteri suşu ve deneysel koşula bağlıdır. Vahşi tip S. ile enfekte sinekler için marcescens, enfeksiyon sonrası hemen homojenize sinekler için 01:10 2 veya 1:10 3 dilüsyonları kullanmak ve sinekler için 01:10 4 veya 1:10 5 dilüsyonları 24 saat sonrası enfeksiyon homojenize.
    4. Mikrofon 100 ul LB / bakteriyel orta Ekleve son seyreltme içeren rocentrifuge tüpleri eşit dağılımını sağlamak için cam bilyalar (VWR) kullanarak bir LB plaka üzerinde orta yayıldı.
    5. % 100 EtOH solüsyonu içine cam topları atın. Bir gece boyunca 37 ° C inkübatör LB plakaları yerleştirin.
    6. Isteğe bağlı bir adım olarak, LB plakaları (; Alpha Innotech FluorChem 8900) bir görüntü elde etmek için görsel ışık ile bir görüntüleme sistemi kullanın. Plaka kendisi ya da Photoshop yazılımı (Photoshop CS3) üzerinde sayım aracı kullanılarak levhanın görüntü ya da kolonilerini sayın.
    7. Sayısı koloni oluşturan formül kullanılarak sinek başı üniteleri hesaplayın: [n / (N * D * v)] * V, n LB plaka üzerinde yetiştirilen koloni = sayı; N = sineklerin sayısı birinde toplanmış mikrosantrifüj tüp; D = seyreltme faktörü ve v Her plaka üzerine yayılmış çözüm = hacmi V Homojenat = başlangıç ​​hacmi.

4. Enfeksiyon Sonrası Uyku ve Sağkalım Süresi Değerlendirin

  1. Içinbakteri yükü ölçmek için hasat değil sinekler, başka bir 7-10 gün davranışını izlemeye devam. Sağkalım süresi sinek, çevresel koşulların genotip etkilenmiştir ve bakteriyel türler enfeksiyon için kullanılır.
  2. ~ 10 gün sonra, deney sona indirebilir ve daha önce 6 açıklandığı gibi davranışsal verileri işlemek. Matlab dayanır Insomniac2 özel yazılım, uyku parametrelerin analiz etmek için kullanılır. Bu davranış analizden ölü sinekler ortadan kaldırmak için önemlidir. Normal olarak, bu enfeksiyon ve uçucu genotip türüne bağlı olarak, enfeksiyondan sonra ilk gün içinde için analiz kısıtlar. Tahlil Ölüm tüm etkinlik sayıları sıfıra ulaşmış süresi belirtilir. Sağkalım analizi kolaylaştırmak için, Drosonex, Microsoft Visual yazılmış özel yazılım C + + 6.0, Trikinetics DAM sistemi ham veri dosyaları işlemek için kullanılır. Excel dosyaları, her bir sineğin sağkalım süresi (saat olarak), hem yazılım raporları aktivite dat derlertek bir elektronik tabloya tüm monitörleri bir ve yüzde uçar raporlar kullanıcı tarafından belirlenen zaman içinde hayatta. Excel dosyaları ayrıntılı analiz için diğer istatistik yazılım paketleri içine entegre etmek için tasarlanmıştır.

5. Bir Lusiferaz Reporter Assay kullanma Enfeksiyon sırasında NFKB Aktivite ölçün

Transgenik KB'yi-luc Bu tahlilde kullanılan önceden sinekleri gibi Kuo ve ark tarif elde edildi., 2010 2. Kısaca, kappa B-luc lusiferaz raportör bir açık okuma çerçevesinin üst akışında bir promotör içine yerleştirildi bir NFKB bağlayıcı sekans 8 tekrarlar içerir.

  1. Olarak bölüm 1.2 'de açıklanan deney aydınlatma koşullarına sinekler ayarlayın. Bu örnekte, 1-4 günlük KB'yi-luc kara sinekler,% 5 sukroz,% 2 agar gıda ve orta enfeksiyon sırasında diğer sinekler gibi aynı yaş ulaşmak için 2 gün boyunca sürekli ışık (LL) yerleştirilir ihtiva eden küçük şişeler içine yerleştirildi.
  2. Sinekler için 96-çukurlu bir mikrolevhadaki hazırlayın. Her iyi gıda orta 2 kat (Şekil 2) içerir; üst tabaka luciferase, lusiferaz ve substrat içerir. % 5 sukroz, her oyuğa% 2 agar çözeltisi 300 ul ekle ve katılaşmasına izin verir. Daha sonra, her bir sıra içeren% 5 sukroz,% 1 agar, ve 2 mM lusiferin (Gold Biotechnology, Inc) ile bir 50 ul üst tabaka ekleyin. Drosophila ölçüm raportör etkinliği için kullanılan lusiferin konsantrasyonlarda literatürde değişiklik göstermektedir, ve 100 uM 13 gibi düşük olmuştur. Gerekli konsantrasyon ampirik olarak saptanabilir. Gıda katmanları dağıtım arasında, sterilite korurken kurutma kolaylaştırmak için ince örgü kumaş ile plaka kapağı. Plaka yoğunlaşma damlacıkları sıkışmış uçar önlemek için, bir saat kadar, iyice kurumasına izin verilmelidir. Luciferase ışığa duyarlı olduğundan, gereğinden fazla ışığa plakalar maruz bırakmayın.
  3. Açık yapışkan film (En Uygula-Seal-A, Perkin Elmer) kuyu başına 2 adet delik bir miktarda ince bir iğne kullanılarak bir 96-gözlü mikro levha ve perfore. Bu delikler sadece her iyi hava değişimi izin vermez, aynı zamanda bireysel bazda sinekler uyutmak için bir yol sağlayacaktır. Keskin bir bıçak ve straight edge kullanarak, her sütun arasında bir kesim tanıtmak. Bu bir seferde yüklemek / 8 kişilik gruplar halinde sinekler boşaltmak için kolay bir yol sağlar.
    Mikro plaka içine sinekler yüklemek için, bir CO 2 pad üzerinde kuvöz ve uyutmak sinekler şişeleri çıkarın. Yük sütun-by-sütunu, her iyi bir-tek uçar. Genellikle müdahalesi olmadan kurtulmaları mümkün olduğu gibi bir yapıştırıcı mühür takılıp yanlışlıkla uçması gerektiğini, yalnız sinek bırakın. 8-24 saat yeni ortama alışması için ve luciferase substrat tüketmek için LL olarak inkübatör Mikro plaka dön.
  4. Kültür bakteriler, S. marcescens, ve yukarıda tarif edildiği gibi enfeksiyon için bir solüsyon hazırlanır.
  5. Anesteziyoloji to bir düşük basınçlı CO2 hattına bağlı bir mikropipet ucu kullanarak uçuyor. Doğrudan her kuyu için yapılan havalandırma delikleri yukarıda mikropipet ucu yerleştirin. CO 2 basınç sinek uyuşturan için yeterince yüksek, ama sinek yaralanmasını önlemek için yeterince düşük olduğundan emin olmak için dikkatli atın. Sekiz gruplar halinde, ayrı ayrı bir CO2 ped için her bir uçucu aktarmak ve yukarıda açıklandığı gibi enfekte. Enfeksiyon sonra, iyi orijinal her sinek dönmek ve mikroplak kapatın.
  6. Tedbir lüminesans (TopCount-NXT Lüminesans ve Sintilasyon Sayıcı; Perkin-Elmer). TopCount lüminesans sayacı herhangi bir süre (genellikle en fazla beş gün) için istenilen aralıklarla sürekli olarak programlanmış ve otomatik okuma sağlayan plakalar için bir istifleme kaset içerir. Bu özellik, tüm enstrümanlar mevcut değildir, ve diğer enstrümanlar ile yapıldı deneyler için veri toplama dolayısıyla daha az sık olabilir. Işıldama sayacı bir ro housedkontrollü bir sıcaklık ve aydınlatma programı ile om. Istifleme kasete plakaları yüklerken, sinekler ışık almasını sağlamak için açık boş plakaları arasındaki sinekleri içeren plakalar yığını. Okumalar 24 saat en az saatte toplamak için üreticinin spesifikasyonlarına göre Programı luminometre. Bu örnekte, detektörler 10 saniye için her bir kuyu okumak için ve saniye başına sayımları (isteğe bağlı birimleri) sonuç olarak ifade etmek için programlanmıştır. Bu değer, kuyu başına 3 okumalar karşısında ortalaması alınır. Bir elektronik veri dosyalarını verme ve bir standart analiz, lüminesans sonuçlarının grafik.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

  1. Enfeksiyon uyku teşvik. Bu örnekte, Canton-S (CS), vahşi tip sinekler ve bir NFKB gen, Relish (İ E20) 14 eksik mutant sinekleri, iki DAM2 aktivite monitörleri dolduruldu (n = her bir genotip için 32) ve yukarıda açıklandığı gibi enfekte. Sinekler davranış ve enfeksiyon 2,7,8 üzerinde sirkadiyen saat etkisini ortadan kaldırmak için sürekli ışık altında tutuldu. Daha önce anlatıldığı gibi 11 İ E20 mutant CS isogenized edildi. Sinekler Hem setleri S. ile enfekte edildi marcescens ve sonuçlar Şekil 3 'te gösterilmektedir. Bazı durumlarda, bir ilave işlenen kontrol grubu enfeksiyon 2 etkilerinden taşıma etkisi ayırt etmek için yararlıdır. Kulplu kontrol grupları aynı zaman süresi için kuluçka ve anestezisi çıkarıldıktan içeren enfekte gruplarıyla aynı çevresel değişiklikler, maruz kalan ama bir enjeksiyon almıyorsunuz. Bununla birlikte, bu örnekte, bu Rel E20 mutantlar CS kontrol enfeksiyon (Şekil 3A) sonra sinekler daha az uyku deneyim olduğu açıktır. 6. Daha önce tarif edildiği gibi, BARAJLAR testte ölçülebilir başka davranış parametrelerini vardır. Bu birim zamanda toplam etkinlik sayısı (Şekil 3B) içerebilir. Bu örnekte, enfeksiyon ayna uyku sonra aktivite değişir. Ayrıca etkinlik oranı, ya da uyanırken dakikada aktivite sayımları (Şekil 3C) rapor. Bu parametre, sinekler lokomotor yeteneğinin bir göstergesidir. Bu durumda, uyanma aktivite oranları aktivite veya uyku artışı bu Redükte lokomotor yeteneğinin bir sonucu değildir anlaşılacağı enfeksiyonu sırasında ya genotipinde değişmez.
  2. Şekil 4A enfeksiyon sonrası yaşama oranını göstermektedir. In önceki bulguları 14,15 ile uyumlu olarak, İ E20 mutantlar hızla yenikInfeksiyon gibi vahşi tip sinekleri ile karşılaştırıldığında. Çoğu enfeksiyon değil, enjeksiyon nedeniyle yaralanma yenik sinekleri belirten, aseptik kontrol enjeksiyon (Şekil 4B) hayatta sinekler. Relish mutantlar çok çabuk öldüğü için, sadece CS sinekler sonra enfeksiyon bakteri yükü (Şekil 5) göstermek için kullanılmıştır. Şekil 5 bu S. marcescens enfeksiyonu sonrası sinek 24 saat içinde çoğalmaya devam ediyor.
  3. Lusiferaz raportör etkinliği dört ayrı sinekler (Şekil 6) olarak tahlil karşıya süre içinde tasvir edilmiştir. Veri noktaları ve bireysel sinekler arasında büyük farklılıklar kuyuların içine dolaşırım sinekler isnat edilebilir. Sinyal sinek içindeki tüm dokularından elde edilen olmasına rağmen, her bir doku sinyalinin, aynı miktarda yayarlar olur, ve detektör ile doku görünürlük sinek hareket ettikçe değişecektir beklenmemektedir. Bu örnekte, sinekler ve enfekte karşılaştırıldıBir işlenen kontrol grubu ile. Öldü Sinekler Şekil 7A gösterilen sinekler bir grup genelinde değerlendirmeye alınmadı. Ölü sinekler görsel inceleme ile tespit edilir. Bu sinekler olarak, lusiferaz sinyal keskin bir düşüş, hem de sinyal varyasyon bir azalma sinek hareketli olmadığını belirten vardır. KB'yi-luc raportör faaliyet sürekli enfeksiyon (Şekil 7A) ve aseptik yaralanma sonrası yükselir (Şekil 7B ). Muhabir aktivitesi 12 saat sonrası yaralanma ve enfeksiyon sonrası çevresindeki doruklarına. Sinekler genetik ve / veya davranış Hem manipülasyonlar enfeksiyon sırasında KB'yi-luc muhabiri faaliyeti değiştirmek için bekleniyor. Örneğin, daha önce bu KB'yi-luc muhabiri NFKB özgüdür gösteren, İ E20 mutantlar enfeksiyon sırasında KB'yi-luc muhabiri faaliyet indüksiyonu büyük ölçüde azaltılmış olduğunu 2 nitelendirdi.


Şekil 1. . (B) adımlar dizisi NFKB bağımlı ölçmek için ana hatlarıyla; Drosophila immun yanıtları ölçmede önemli adımlar özetlenir (A) adımlar dizisi ölçme uyku, hayatta kalma ve enfeksiyon sırasında bakteri yükü için ana hatlarıyla Akış Şeması enfeksiyon sırasında lusiferaz muhabiri aktivite. Deneyler kullanılan bakteri türlerinin öldürücü bağlı olarak, 1-5 gün yerden devam edebilirsiniz.

Şekil 2,
Şekil 2. Iyi bir bireysel mikroplaka şematik. Sinekler opak, orta ve gösterildiği gibi kapalı ihtiva eden 96 oyuklu plakalar yerleştirilir. Sinekleri tek tek enfekte olduğu ele alınacaktır Çünkü, bu önemli tmakul deneysel koşullara bağlı olarak, belirli bir zaman süresi içinde idare edilebilir bir miktara plaka başına sinekler sayısını sınırlamak o.

Şekil 3
Şekil 3,. S. ile enfekte sinekler davranışı tepki marcescens. (A) Ortalama ± geçirdi uyku ve (B) ortalama uçar SEM yüzde zamanlı ± SEM toplam aktivite sayımları S ile enfeksiyon öncesi ve sonrasında 1 gün 4 saat aralıklarla çizilen marcescens. (C) Ortalama ± uyanıkken dakikada SEM aktivite sayımları S ile enfeksiyon öncesi (BL = bazal) ve sonrası marcescens 8 saat aralıklarla çizilir. Davranış en az 24 saat sonrası enfeksiyon hayatta yabani tip CS sinekler için rapor ve bağışıklık eksikliği İ E20 için tha uçar edilirt en az 8 saat sonrası enfeksiyon atlattı. CS ve İ E20 için n = 13. ** = P <0.01 ve * = p <0.05, Student t - testi.

Şekil 4,
Şekil 4. Enfekte olan ve olmayan sinekler Survival sonucu. (A) Temsilcisi Kaplan-Meier sağkalım eğrileri S. ile enfekte yabani tip CS ve bağışıklık eksikliği İ E20 sinekler hem çizilmiştir marcescens. p = 8.13x 10 -13, rank testi yapın. n CS ve n = 31 İ E20 sinekler için = 32. Sinekler bakteri olmadan sıvı ortam ile enjeksiyon yoluyla aseptik yaralanma alınan hariç (B) Örnek Kaplan-Meier sağkalım eğrileri, (A) olarak bildirilmiştir. Neredeyse tüm sinekler deneyler sonunda (60 saat sonrası yaralanma) kadar aseptik yaralanma atlattı. p> 0.97, günlük rank testi; n CS ve İ E20 sinekler için = 32.

Şekil 5,
Şekil 5,. S. ile enfekte sinekler bakteriyel yük miktarının marcescens. CS (A) Örnek bakteri kültürü S. ile enfekte sinekler hemen enfeksiyon (Sol panel) veya enfeksiyon (Sağ panel) sonra 24 saat sonra hasat edildi marcescens. Seyreltme faktörü her rakam aşağıda belirtilmiştir. Bu örnekte, 10 sinekler her bir grup için 400 ul solüsyon içinde homojenize edildi. Nihai seyreltme 100 ul her bir levha üzerine yayıldı. Sol plakası 29 koloni oluşturan birim (kob) içerir. Kob hesaplamak / uçmak tarafından 29 kob bölmek [10 sinekler * 0.001 (seyreltme faktörü) * 100 ul (plaka üzerine ses yayılma)], 29 eşittir, ve sonra 400 ul = 11.600 ilk hacmiyle çarpın. Bu özel plaka için, 1.16 x olarak ortalama 10 4kob / sinek. Sağ plaka 257 kolonileri içerir. Aynı formül kullanılarak, 1.03 x 10 6 cfu / sinek bir ortalama bulmak. Gösterildiği gibi (B) her deney koşulunda, her plaka kob / sinek hesapladıktan sonra, box-and-whisker grafikleri oluşturabilirsiniz. Bu örnekte, 25, 50 (ortanca) ve 75. yüzdelik alt, orta ve kutunun üst olarak sunulmaktadır. Hata çubukları üç bağımsız deneyi üzerinde standart sapmayı temsil etmektedir. ** P <0.01 student t-testi.

Şekil 6
Şekil 6. S. ile enfekte bireysel sinekler NFKB bağımlı lusiferaz muhabiri aktivite . ve enfekte sinekler (sağ panel); ham veri marcescens Temsilcisi örnekleri bireysel bulaşmamış sinekler (sol panelleri ele kontrolü) için gösterilmiştir. Bir temel okuma (zaman '0 ') hemen enfeksiyon veya taşıma öncesinde toplandı; diğer tümsinekler muamele edildikten sonra zaman noktalarında toplanmıştır. Enfekte ve ele Kontrol koşullarında sinekler arasındaki y-eksenleri ölçek farklılıkları unutmayın. Her uçucu içinde sinyalinin geniş varyasyon mikro içindeki uçucu hareketi ile ilişkili olabilir.

Şekil 7
Şekil 7. S. ile enfeksiyon aseptik enjeksiyon marcescens veya yaralanma yaşayan sinekler KB'yi-luc muhabiri aktivitesini arttırır. ± SEM lusiferaz aktivitesi (keyfi birimler) enfekte olan tüm sinekler genelinde her 4 saat çizilen (A) veya aseptik enjeksiyon (B) ile yaralanan ve yukarı hayatta olduğunu Mean tahlil 24 için. Tekrarlanan ölçümlerde tek yönlü ANOVA muhabiri aktivite (inj; p <0.01) yaralandı, (p <0.05) enfekte anlamlı bir artış olduğunu göstermiştir ve bunların ele control (HC, p <0.01) başlangıçtaki göre gruplar (zamanı '0 '; Tukey post-hoc). (Ekle, panel A): HC grubunda Veri farklı bir ölçekte çizilir. HC grubunda muhabiri aktivite küçük ama önemli bir artış olduğunu sinekler hafif stres yaşamış veya işleme (ve mikro plaka ve anestezisi eşdeğer enfekte sinekler transfer) dan uyanıklık artış olabileceğini göstermektedir. Hem virüslü ve yaralı gruplar Belirtilen zaman noktalarında HC grubuna göre anlamlı olarak yüksek bulunmuştur KB'yi-luc muhabiri aktivitesinin güçlü indüksiyon gösterdi * = p <0 .05; ** = p <0 .01;. Öğrenci t - Test, (A) n = 20 ve n = HC 13 Enfeksiyon için, (B) n = 15, HC ve n = 14 yaralanması.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Bu protokol davranış, özellikle uyku, bağışıklık yanıtı parametreleri nasıl bağlantılı olduğuna araştırmak için bir yaklaşım belirlemektedir. Bu parametreler in vivo bir lusiferaz muhabir tarafından ölçülen bakteri yükü, sağkalım sonuçları ve NFKB aktivite içerir. Birlikte bu parametreler bir sinek bir enfeksiyonla mücadele ne kadar iyi hakkında bilgi sağlar. Bakteriyel yük ve sağkalım sonuçları Drosophila basit ölçümü dahil bağışıklık yanıtı parametrelerdir. Yenik hızla bakteriyel enfeksiyona bağışıklık yanıtı için merkezi bir NFKB transkripsiyon faktörü eksikliği Rel E20 mutantlar,. Davranışın genetik veya diğer manipülasyonlar da muhtemelen NFKB faaliyetinin kendisini etkileyen, bu bağışıklık yanıtı parametreleri etkileyebilir. Örneğin, Relish mRNA enfeksiyon artışları ifade öncesinde uyku yoksunluğu ve kob azaltır / non-yoksun kontroller 11 göreli uçmak. Mutansaat genler, dönem 7 ve zamansız 8, ts da bir enfeksiyon sırasında hayatta kalma yanı sıra, bakteriyel açıklık 8 azaltmak için rapor edilmiştir. Bu yaklaşımı kullanmak daha ileri çalışmalar davranışı bağışıklık fonksiyonunu etkileyebilir nasıl içine mekanistik anlayış sağlaması beklenmektedir.

Burada tarif enjeksiyon / enfeksiyon prosedürü Wu ve arkadaşları 16 tarafından önceden tanımlanan bir yöntem değiştirilmiş. Bu işlem basit ve ucuzdur. Bununla birlikte, bir dezavantaj bir göstergesi kaba ve değişkenlik katkıda bulunabileceği gibi boya kullanımı ile enjeksiyon hacmi o manuel kontrol edilmesidir. Diğer gruplar sürekli bir enjeksiyon hacmi 17 etkinleştirmek için bir mikroenjektör kullanmış veya bir iğne ile sinekler bakteri kültürü 18 batırılmış bıçakladı var. Bununla birlikte, burada sunulan yöntem deneysel koşullara 11,19 genelinde bakteriyel klirensi değişiklikleri tespit etmede başarılı olmuştur </> Sup.

Enfeksiyon sırasında sinek Survival genellikle düzenli zaman aralıklarında kalan sinekler sayılarak ölçülür. Burada etkinlik kesimi ile gösterilir bireysel sinekleri, ölüm zaman izlemek için Trikinetics DAM sistemi kullanır. Biz lokomotor aktivite tarafından belirlenen sağkalım sonuçlarını enfeksiyonu (yayımlanmamış) sırasında aktivite tüplerde sinekler görsel muayene ile belirlenen aynı olduğunu teyit ettik. Bu yöntem aynı zamanda ömrü 20,21 ölçmek için önceden kullanılmıştır. Bununla birlikte, DAM sistemi içinde hayatta kalma değerlendirme içinde izole sinekler ile sınırlıdır, ve bu durum elde edilen sonuçlar gruplandırılmış koşullarda daha farklı olması beklenmektedir ki dikkat etmek önemlidir. Yakın zamandaki çalışmalar, ana izole koşullar 22'ye gruplar halinde yerleştirilir sağkalım farklılıklar göstermiştir. Son çalışmalar ayrıca sinekler gruplar halinde ömrü daha uzun olduğunu onaylamıştırİzole sinekler 20 daha dardır.

Lusiferaz raportör etkinliği oturma sinekler saat gen ifadesi (örneğin, ref 23) analizi için önceden kullanılmıştır. Bu durumlarda, diğer hususlar teknik özellikle, tahlil çalışan birkaç gün içinde ortaya çıkar lusiferin substratının azalması gereklidir. Buna karşılık, burada tahlil enfekte sinekler hayatta kalma ile sınırlıdır tarif edilen ve enfeksiyondan sonra 24 saat boyunca bir açık ölçüm içeriyordu. Bir tekrarlanan ölçümler için ANOVA her grup içinde başlangıca değişiklikleri değerlendirmek için yeterli oldu. Substrat tükenmesi düzeltmek için normalleştirme adımları birlikte lusiferaz gazetecilere bir sirkadiyen salınım, analiz istatistiksel yaklaşımlar başka yerlerde tam 24 tartışılmıştır. Her iki durumda da, bireysel sinekler gerçek-zamanlı raportör etkinliği ölçmek istasyon daha kendi zamansal dinamiği konusunda bilgi çıkarmak için daha verimli bir yöntem olupndard biyokimyasal ve immünohistokimyasal analizler.

Ancak, in vivo lusiferaz muhabiri etkinliği izleme için bir potansiyel dezavantajı luciferase substrat yeme sinekler üzerinde bağımlı olmasıdır. Anoreksiya sinekler enfeksiyon ile ilişkili olduğu ve besleme de enfeksiyon türüyle veya genotipler 25 arasında değişebilir. Substratın yenmesi endişeyi aşmak için, sinek enfeksiyonunu takiben ayrı vücut parçaları ya da doku içine disseke edilebilir ve daha önce 26 açıklandığı gibi muhabiri aktivitesi kültürü ölçülebilir. Alternatif olarak, lusiferaz elde edilen sonuçlar aynı zamanda besleme bağlı olmayan, standart bir yöntem kullanılarak doğrulanabilir. Örneğin, nicel PCR antimikrobiyal peptit (AMP) mRNA ekspresyonu seviyesini ölçmek için yaygın olarak kullanılan bir yaklaşım olmuştur. AMP'lerin NFKB bilinen maruz kalırlar, ve bu nedenle faaliyet seviyesini gösterir.

Temsilcisi datNFKB bağışıklık meydan ve uyku 2 bir sonraki artış ile yükselir olduğunu gösteren önceki çalışmaları özetlemek burada bir tarif. Ancak, okuyucuların Trikinetics DAM sistemi o uyku beş ardışık dakika 27 en az hareketsizlik ile gösterilir uyarıyoruz. Videografisi tarafından sinek uyku Ölçümü hareketsizlikten 28. dayanır. Aynı zamanda bağışıklık meydan hayvanlar 29 uyku olmadan uzun süre etkin olacağı bilinmektedir, çünkü sinekler Bu uyku tanımı potansiyel, bir enfeksiyon sırasında sorunlu olabilir. , Ölçü duyusal yanıt sinekler gerçekten uykuda olduğunu doğrulamak için gerekli olduğu deneyleri bu sorunu aşmak için. Müfettişler bir tahta sopa 31, kalorifer ya da bir tüp 27 bir ucu aktivite tüpler fırçalama, kalem musluk 30 gibi duyusal uyaranlara, kara sinek yanıt tespit ettik. Tüm durumlarda, uyku sinekler az duyarlı (ölçülenYa cevap gecikmesi veya yüzde uyanık sinekler dışında) bir grup olarak yanıt uçar. Biz uyku enfekte sinekler kadar duyusal uyaranlara karşı gerçekten daha az duyarlı olduğunu bulduk 6-8 saat sonrası enfeksiyon (Kalınlık Kuo ve JA Williams, yayınlanmamış gözlem). Teknik sınırlamalara rağmen, Trikinetics DAM sistemi uyku ve bağışıklık fonksiyonu arasındaki genetik ve moleküler bağlantıyı keşfetmek sinekler gelecek çalışmalar için yararlı olacak bir yüksek verimlilik avantajı sağlamaktadır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Çıkar çatışması ilan etti.

Acknowledgments

Bu eser hibe # IOS-1025627 altında Ulusal Bilim Vakfı tarafından desteklenen ve hibe kapsamında Ulusal Sağlık Enstitüleri # 1R21NS078582-01 tarafından ÇENE etmek edildi

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Equipment
Incubators Percival Scientific, Inc. I30BLLC8
I36VLC8
Any incubator capable of running programmed light/temperature schedules is appropriate.
Drosophila Activitiy Monitors Trikinetics Inc., Waltham, MA DAM2 As described elsewhere6, this system requires a computer interface, software, and other accessories.
Pyrex Glass Tubes Trikinetics Inc., Waltham, MA PGT-5x65
Microplate scintillation and luminescence counter Perkin Elmer TopCount NXT
12 detector
Any microplate reader capable of detecting luminescence can be used for this type of reporter assay. TopCount contains multiple detectors and an automated stacker; it is capable of being programmed to read continuously from multiple plates.
FluorChem 8900 Alpha Innotech Imaging of bacterial cultures is optional; any digital imaging system with visual light capability is sufficient.
Micropipette Puller Tritech Research, Inc. Narishige PC-10
Supplies
Borosilicate Glass Capillaries World Precision Instrument Inc. 1B100F-4
3 ml Syringe Fisher Scientific BD 305482
Syringe Needles Fisher Scientific BD 305196 18 G - cut off the tip of the needle to prevent damage to the tubing.
Silicone Tubing, i.d. (0.030") o.d. (0.065") Wall Thickness (0.018") VWR 60985-706 Used for attaching glass capillary needles to a syringe
3 Way Stopcock American Pharmaseal Company K75
Kontes Pellet Pestle Cordless Motor Fisher Scientific K749540-0000
Kontes Pellet Pestle Fisher Scientific K749521-1590
Glass balls 3mm VWR 26396-630
Microplate Microlite 1+ Thermo Scientific 7571 Select 96-well plates that are appropriate for luminescence - they must be opaque.
TopSeal-A:96-well Microplates PerkinElmer 6005185 Microplate Press-On Adhesive Sealing Film
D-Luciferin, Potassium Salt Gold BioTechnology, Inc. LUCNA
Software
Insomniac2 Available upon request to the authors custom; written by Lesley Ashmore, Ph.D. (Westminster College) Matlab based software that has been used routinely for analysis of sleep2,6,11
Drosonex Available upon request to the authors custom; written by Thomas Coradetti (Sidewalk Software) A PC MSVC6 program used for survival analysis from raw data files collected with the Trikinetics system
Photoshop CS3 Adobe Useful for obtaining numbers of cfu/plate from digital images (optional)

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Majde, J. A., Krueger, J. M. Links between the innate immune system and sleep. J. Allergy Clin. Immunol. 116, 1188-1198 (2005).
  2. Kuo, T. H., Pike, D. H., Beizaeipour, Z., Williams, J. A. Sleep triggered by an immune response in Drosophila is regulated by the circadian clock and requires the NFkappaB Relish. BMC Neurosci. 11, 1471-2202 (2010).
  3. Preston, B. T., Capellini, I., McNamara, P., Barton, R. A., Nunn, C. L. Parasite resistance and the adaptive significance of sleep. BMC Evol Biol. 9, 7 (2009).
  4. Imeri, L., Opp, M. R. How (and why) the immune system makes us sleep. Nat. Rev. Neurosci. 10, 199-210 (2009).
  5. Ayres, J. S., Schneider, D. S. A Signaling Protease Required for Melanization in Drosophila Affects Resistance and Tolerance of Infections. PLoS Biol. 6, e305 (2008).
  6. Chiu, J. C., Low, K. H., Pike, D. H., Yildirim, E., Edery, I. Assaying Locomotor Activity to Study Circadian Rhythms and Sleep Parameters in Drosophila. J. Vis. Exp. (43), e2157 (2010).
  7. Lee, J. E., Edery, I. Circadian Regulation in the Ability of Drosophila to Combat Pathogenic Infections. Curr. Biol. 18, 195-199 (2008).
  8. Stone, E. F., et al. The circadian clock protein timeless regulates phagocytosis of bacteria in Drosophila. PLoS Pathog. 8, e1002445 (2012).
  9. Hill-Burns, E. M., Clark, A. G. X-linked variation in immune response in Drosophila melanogaster. Genetics. 183, 1477-1491 (2009).
  10. Short, S. M., Lazzaro, B. P. Female and male genetic contributions to post-mating immune defence in female Drosophila melanogaster. Proc. Biol. Sci. 277, 3649-3657 (2010).
  11. Williams, J. A., Sathyanarayanan, S., Hendricks, J. C., Sehgal, A. Interaction between sleep and the immune response in Drosophila: a role for the NFkappaB relish. Sleep. 30, 389-400 (2007).
  12. Ramsden, S., Cheung, Y. Y., Seroude, L. Functional analysis of the Drosophila immune response during aging. Aging Cell. 7, 225-236 (2008).
  13. Williams, J. A., Su, H. S., Bernards, A., Field, J., Sehgal, A. A circadian output in Drosophila mediated by neurofibromatosis-1 and Ras/MAPK. Science. 293, 2251-2256 (2001).
  14. Hedengren, M., et al. Relish, a central factor in the control of humoral but not cellular immunity in Drosophila. Mol. Cell. 4, 827-837 (1999).
  15. Leulier, F., Rodriguez, A., Khush, R. S., Abrams, J. M., Lemaitre, B. The Drosophila caspase Dredd is required to resist gram-negative bacterial infection. EMBO Rep. 1, 353-358 (2000).
  16. Wu, L. P., Choe, K. -M., Lu, Y., Anderson, K. V. Drosophila Immunity: Genes on the Third Chromosome Required for the Response to Bacterial Infection. Genetics. 159, 189-199 (2001).
  17. Dionne, M. S., Ghori, N., Schneider, D. S. Drosophila melanogaster is a genetically tractable model host for Mycobacterium marinum. Infect. Immun. 71, 3540-3550 (2003).
  18. Romeo, Y., Lemaitre, B. Drosophila immunity: methods for monitoring the activity of Toll and Imd signaling pathways. Methods Mol. Biol. 415, 379-394 (2008).
  19. Lu, Y., Wu, L. P., Anderson, K. V. The antibacterial arm of the Drosophila innate immune response requires an I{kappa}B kinase. Genes Dev. 15, 104-110 (2001).
  20. Koh, K., Evans, J. M., Hendricks, J. C., Sehgal, A. A Drosophila model for age-associated changes in sleep:wake cycles. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 103, 13843-13847 (2006).
  21. Bushey, D., Hughes, K. A., Tononi, G., Cirelli, C. Sleep, aging, and lifespan in Drosophila. BMC Neurosci. 11, 1471-2202 (2010).
  22. Allee, W. C. The social life of animals. , W.W. Norton & Company, Inc. (1938).
  23. Stanewsky, R., Jamison, C. F., Plautz, J. D., Kay, S. A., Hall, J. C. Multiple circadian-regulated elements contribute to cycling period gene expression in Drosophila. Embo. J. 16, 5006-5018 (1997).
  24. Levine, J. D., Funes, P., Dowse, H. B., Hall, J. C. Signal analysis of behavioral and molecular cycles. BMC Neurosci. 3, 1 (2002).
  25. Ayres, J. S., Schneider, D. S. The role of anorexia in resistance and tolerance to infections in Drosophila. PLoS Biol. 7, e1000150 (2009).
  26. Plautz, J. D., Kaneko, M., Hall, J. C., Kay, S. A. Independent photoreceptive circadian clocks throughout Drosophila. Science. 278, 1632-1635 (1997).
  27. Huber, R., et al. Sleep homeostasis in Drosophila melanogaster. Sleep. 27, 628-639 (2004).
  28. Zimmerman, J. E., Raizen, D. M., Maycock, M. H., Maislin, G., Pack, A. I. A video method to study Drosophila sleep. Sleep. 31, 1587-1598 (2008).
  29. Toth, L. A., Rehg, J. E., Webster, R. G. Strain differences in sleep and other pathophysiological sequelae of influenza virus infection in naive and immunized mice. J. Neuroimmunol. 58, 89-99 (1995).
  30. Hendricks, J. C., et al. Rest in Drosophila is a sleep-like state. Neuron. 25, 129-138 (2000).
  31. Wu, M. N., Koh, K., Yue, Z., Joiner, W. J., Sehgal, A. A genetic screen for sleep and circadian mutants reveals mechanisms underlying regulation of sleep in Drosophila. Sleep. 31, 465-472 (2008).

Tags

İmmünoloji Sayı 70 Nörobilim Tıp Fizyoloji Patoloji Mikrobiyoloji immün yanıt uyku, Enfeksiyon bakteri lusiferaz muhabiri tahlil hayvan modeli
İmmün Yanıt ve Uyku içinde kantitatif ölçümü<em&gt; Drosophila</em
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kuo, T. H., Handa, A., Williams, J.More

Kuo, T. H., Handa, A., Williams, J. A. Quantitative Measurement of the Immune Response and Sleep in Drosophila. J. Vis. Exp. (70), e4355, doi:10.3791/4355 (2012).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter