Summary
وقد أنشئت فعال الجينوم على نطاق طفرة جين واحد باستخدام طريقة
Abstract
ينقول الطفرات والحذف واحد الجينات طريقتان في تطبيق خروج المغلوب الجينات في الجينوم على نطاق 1،2 البكتيريا. على الرغم من الطفرات ينقول أقل مضيعة للوقت، أقل تكلفة، ولا تحتاج إلى استكمال المعلومات الجينوم، وهناك نوعان نقاط الضعف في هذه الطريقة: (1) إمكانية حدوث طفرات متباينة في مكتبة متحولة مختلطة مكافحة يختار المسوخ مع تقليل المنافسة؛ و (2) إمكانية تعطيل الجين جزئية حيث الجينات لا تفقد وظيفتها بالكامل بعد ادراج ينقول. قد أحادية الجين التحليل حذف التعويض عن العيوب المرتبطة الطفرات ينقول. لتحسين كفاءة الجينوم على نطاق حذف جين واحد، ونحن نحاول اقامة تقنية عالية الإنتاجية للالجينوم على نطاق حذف جين واحد باستخدام الدم العقدية باعتباره النموذج الحي. كل حذف الجينات في بناء S. تم تصميم الجينوم الدم لتشمل 1-KB المنبع من الجينات المستهدفة، الجين APHA-3، ترميز البروتين المقاومة الكانامايسين، و1-KB المصب من الجينات المستهدفة. ثلاث مجموعات من الاشعال F1/R1، F2/R2، وF3/R3، على التوالي، فقد تم تصميم وتجميعها في شكل لوحة 96-PCR-جيدا لالتكبير من تلك المكونات الثلاثة للحذف كل بناء. الاشعال R1 وتحتوي على 25-F3 بي بي متواليات التي هي مكملة لمناطق الجينات-3 APHA في نهاية ال 5 هم '. يتم تنفيذ A التضخيم PCR كبيرة الحجم من الجين-3 APHA مرة واحدة لخلق بنيات كل واحد حذف الجينات. في البداية تم استبعاد المروج من الجينات APHA-3 للتقليل من التأثير المحتمل للكاسيت الكاناميسين القطبية. لإنشاء بنيات حذف الجينات، يتم تنفيذ عالية الإنتاجية PCR التضخيم والتنقية في شكل لوحة 96-أيضا. وسيبذل الخطية AMPLICON PCR لكل المؤتلف حذف الجينات من خلال ردود الفعل PCR 4 عالية الدقة باستخدام البلمرة DNA. وexpon الأوليةential مرحلة نمو S. تستكمل الدم مثقف في مرق تود هيويت مع 2.5٪ يستخدم المصل الحصان المعطل لزيادة الكفاءة لتحويل PCR-المؤتلف يبني. تحت هذا الشرط، وتصل إلى 20٪ من S. يمكن أن تتحول الخلايا الدم ~ 50 نانوغرام باستخدام الحمض النووي. استنادا إلى هذا النهج، في نهاية المطاف تم الحصول على 2048 المسوخ مع احد الجينات الحذف من الجينات في 2270 S. الواردة الدم باستثناء 4 ORFs الجينات بالكامل داخل ORFs أخرى في S. الدم SK36 و 218 الجينات الأساسية المحتملة. هذه التقنية على خلق بنيات حذف الجين هو إنتاجية عالية، ويمكن أن تكون سهلة الاستخدام في الجينوم على نطاق الحذف جين واحد لأي بكتيريا التحويلية.
Protocol
1. تصميم التمهيدي
- تم تصميم الاشعال باستخدام البرامج النصية في المنزل استنادا إلى S. الدم تسلسل الجينوم SK36. تم تصميم ثلاث مجموعات من الاشعال، F1/R1، F2/R2، وF3/R3 لتضخيم التسلسل-1 ك المنبع من الجين المستهدف، وترميز الجين APHA-3 الكاناميسين المقاومة (كم ص) البروتين 3 و 1 في تسلسل-KB المصب من الجين المستهدف، على التوالي (الشكل 1). ومن بين هذه الاشعال، فقد تم تصميم R3 باستخدام F1 وePrimer3 في جناح برامج زخرف ( http://emboss.sourceforge.net/apps/cvs/emboss/apps/index.html ) لتضخيم المناطق المحيطة رئيسية أو فرعية للهدف الجينات. تم تصميم الاشعال جين معين، R1 وF3، على أساس 5 'و 3' تسلسل الجين المستهدف. وR1 F3 الاشعال تحتوي على تسلسل محول 25-BP في نهاية ال 5 هم 'التي هي مكملة لAPHA-3الجينات. تم تصميم كل درجات الحرارة ذوبان التمهيدي لتكون أقرب ما يمكن إلى 60 ° C لتمكين استخدام زي درجة الحرارة الصلب لجميع ردود الفعل PCR في 96-جيدا الشكل.
- وقد تم تجميع F1، R1، F3 والاشعال في 96-R3 وحات جيدة تستند إلى أمر الجينات. كل لوحة تحتوي على نوع واحد من الاشعال في ترتيب نفس الجين. تخفيف الاشعال في 96-وحة جيدا التمهيدي تعمل على تركيز النهائي من 10 ميكرومتر لتضخيم PCR باستخدام ماصة الأقنية.
2. عالية الإنتاجية PCR التضخيم والتنقية
- عالية الإنتاجية لتضخيم 1-KB المنبع أو المصب من S. الهدف الجينات الدم، تجميع خليط كوكتيل PCR على الجليد في أنبوب مخروطي 15-مل تحتوي على 1640 ميكرولتر DDH 2 O، 250 ميكرولتر العازلة 10xHigh الإخلاص PCR، 200 ميكرولتر من 10 ملي dNTP خليط، 100 ميكرولتر من 50 ملي MgSO 4، 100 ميكرولتر من 10 نانوغرام / ميكرولتر S. الدم الحمض النووي الجيني SK36 و 10 ميكرولتر البلاتين طق polyme DNArase عالية الدقة ونقل 23 ميكرولتر من الخليط في كل بئر على 96-PCR باستخدام لوحة جيدا ماصة الأقنية. نقل 1 ميكرولتر من كل F1 وR1 (أو F3 وR3) من 10 ميكرومتر العمل التمهيدي لوحات لوحة PCR باستخدام ماصة الأقنية. ختم لوحة PCR التضخيم وأداء في C ° 94 لل1 دقيقة، و 30 ° C دورات 94 لل30 ثانية و 54 درجة مئوية لمدة 30 ثانية و 68 درجة مئوية لمدة 1.5 دقيقة.
- إعداد 1٪ agarose هلام يحتوي على إيثيديوم بروميد مع 48 بئرا المناسب الأقنية تحميل ماصة. خلط 4 المنتج PCR ميكرولتر مع 1 ميكرولتر من العازلة تحميل 5xDNA على 96-وحة جيدا وتحميل العينات في هلام الاغاروز باستخدام ماصة الأقنية 10-ميكرولتر. تشغيل الكهربائي في V 135 لل30 دقيقة. دراسة النطاق على جل الوثائق تحت نظام UVP والتحليل.
- تنقية المنتجات PCR بنسبة 96 PureLink عدة تنقية PCR باستخدام الطرد المركزي وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. ليبلغ حجمه DNA، اضافة 40 ميكرولتر معقمة [ده 2 O إلى البئر لبinding وحة.
- اختيار عشوائي عدة amplicons تنقيته على لوحة لفحص الحمض النووي باستخدام تركيزات الطيف NanoDrop. ضبط تركيز amplicons على لوحة ل~ 10 نانوغرام / ميكرولتر.
- يتم هضم البلازميد التي تحتوي على راديو كاسيت ص كلم باستخدام EcoR I كقالب PCR. يتم تنقيته من البلازميد يهضم من قبل عدة QIAquick تنقية PCR ويتم ضبط DNA البلازميد إلى خطي تركيز DNA النهائية 10 نانوغرام / ميكرولتر. تجميع 25 ميكرولتر مزيج لAMPLICON كم كاسيت R بما في ذلك 16.4 ميكرولتر O 2 DDH، 2.5 ميكرولتر العازلة PCR 10xHigh الإخلاص، 2 ميكرولتر من 10 ملي dNTP خليط، 1 ميكرولتر من المغنيسيوم 50 مم SO 4، 1 ميكرولتر من 10 ميكرومتر F2، 1 ميكرولتر من 10 ميكرومتر R2، 1 ميكرولتر الحمض النووي البلازميد و 0.1 ميكرولتر الخطية DNA بوليميراز طق البلاتين الإخلاص عالية. PCR التضخيم في أداء ° C 94 لل1 دقيقة، و 30 ° C دورات 94 لل30 ثانية و 55 درجة مئوية لمدة 30 ثانية و 68 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة. دراسة المنتج من قبل PCR الكهربائي للهلام الاغاروز على 1٪. برازلا الجزء الأكبر من الكاسيت كم AMPLICON R من 10 فرد PCR المنقى من عدة QIAquick تنقية PCR. ضبط تركيز AMPLICON إلى 10 نانوغرام / ميكرولتر.
- للحصول على الخطية النهائية AMPLICON PCR المؤتلف، يتم الجمع بين 3 amplicons PCR مع كل ميكرولتر 1 (بكميات متساوية تقريبا، الرحى) في لوحة PCR بئر واحد كقالب PCR. يضاف المكونات الأخرى بما في ذلك 14.4 ميكرولتر PCR O 2 DDH، 2.5 ميكرولتر العازلة PCR 10xHigh الإخلاص، 2 ميكرولتر من 10 ملي dNTP خليط، 1 ميكرولتر من المغنيسيوم 50 مم SO 4، 1 ميكرولتر من F1 ميكرومتر 10، 1 ميكرولتر من 10 ميكرومتر R3، 0.1 ميكروليتر DNA بوليميراز طق البلاتين عالية الدقة. PCR التضخيم يتم تنفيذ في C ° 94 لل2 دقيقة و 30 دورات من 94 درجة مئوية لمدة 30 ثانية C ° 55 لمدة 30 ثانية و 68 ° C لحوالي 3.5 دقيقة، و 68 درجة مئوية لمدة أخيرا 4 دقائق.
- دراسة amplicons PCR على هلام الاغاروز. تنقية وتحديد amplicons PCR على النحو المبين أعلاه. تجميد معاد amplicons PCR في -20 ° C.
3. كومأكفاء خلايا إعداد
- ويتم إعداد مرق تود هيويت، ودرجة الحموضة المعدل إلى 7.6 باستخدام هيدروكسيد الصوديوم 10 N، يسخن حتى يغلي ثم يبرد إلى درجة حرارة الغرفة وتعقيمها باستخدام 0،22 ميكرون تصفية البوليسترين 4. إضافة 300 ميكرولتر للحرارة المعطل مصل الحصان (تركيز النهائي إلى 2.5٪) إلى 11.7 مل مرق هيويت تود في أنبوب مل 15-المخروطية لتعويض TH + HS المتوسط. TH + HS قسامة المتوسطة في 2 مل و 10 مل في أنابيب.
- تطعيم 5 ميكرولتر من الأسهم S. SK36 الدم المجمدة في C ° -80 إلى 2 مل المتوسطة TH + HS واحتضان الثقافة بين عشية وضحاها مع السد بإحكام عند 37 درجة مئوية، مصحوبة قبل احتضان 10 مل أنبوب HS-TH +.
- بعد ليلة وضحاها، تحويل 50 ميكرولتر الثقافة في 10 مل + HS TH واحتضان الأنبوب في C ° 37 ساعة لمدة 3 (الموافق OD 660 من 0،07-0،08)، وذلك باستخدام فورا للتحول.
4. تحول الخلايا واختيار المضادات الحيوية
- إضافة 2 ميكرولتر من 70 نانوغرام S. SK36 تعوض الدمالببتيد تينس تحفيز (CSP) و 2 ميكرولتر الخطية المؤتلف PCR AMPLICON (~ 50 نانوغرام) لأنابيب إيبندورف على ما يرام-96 كتلة وقبل الدافئ لهم في 37 ° C. نقل 330 ميكرولتر من 3 SK36 الثقافة HR-المحتضنة في كل أنبوب. احتضان في C ° 37 لمدة 1 ساعة. استبدال DNA مع العقيمة O 2 DDH والسيطرة.
- وضع كتلة على الجليد وتنتشر 100 ميكرولتر من كل القلب ضخ التحول على الدماغ (BHI) لوحة أجار مع 500 ميكروغرام / مل الكاناميسين. احتضان لوحات في C ° 37 لمدة 2 د في ظل ظروف microaerobic.
5. متحولة تأكيد والتخزين
- لكل متحولة استبدال، واختيار عشوائي بنسبة 2 المستعمرات الفردية، تطعيم مستعمرة في 5 مل تحتوي على 500 ميكروغرام BHI / مل الكاناميسين واحتضان بين عشية وضحاها microaerobically اللقاح في 37 ° C. Cryopreserve كل ثقافة في الجلسرين 30٪ في -80 ° C
- لدراسة ما إذا كانت تحتوي على متحولة استبدال الجينات المتوقع، نفذ PCR مستعمرة لكل F1 متحولة باستخدام وR3الاشعال في 96-PCR لوحة جيدا. ويستخدم حوالي 1-ميكرولتر الثقافة بين عشية وضحاها من مستعمرة الفردية DNA كقالب في رد فعل التضخيم PCR-25-ميكرولتر. يتم تنفيذ PCR في C ° 94 لل5 دقائق و 35 دورات من 94 درجة مئوية لمدة 30 ثانية و 55 درجة مئوية لمدة 30 ثانية و 68 ° C لحوالي 3.5 دقيقة، و 68 درجة مئوية لمدة أخيرا 4 دقائق.
- لتحديد بالضبط المزدوج الفرقة المسوخ أو الملوثات AMPLICON PCR، ودراسة AMPLICON PCR بواسطة الرحلان الكهربائي لمدة 4 ساعة على> 12 سم طويلة الجل الاغاروز 2٪ مع تلطيخ بروميد إيثيديوم. تحت هذا الشرط الكهربائي الاغاروز هلام، وحددت بوضوح أي amplicons مع الفرق ≥ BP 100. عندما يتوقع العصابات الناتجة عن التضخيم من الكاسيت R كم والجين من النوع البري لتختلف باختلاف <100 شركة بريتيش بتروليوم، يتم استخدام التمهيدي T1 الداخلية لتحديد ما إذا كان يمكن الكشف عن الجين من النوع البري بواسطة PCR.
- لمزيد من تأكيد الحذف، وتنقيته من amplicons بنسبة 96 PureLink عدة تنقية PCR وباستخدام تسلسل التمهيدي الذي P1بربط كاسيت ص كيلومتر. إبقاء المسوخ الصحيح الوحيد أكده التسلسل.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
بعد التضخيم PCR باستخدام بادئات F1 وR1، وF3 وR3، حوالي 1-KB المنبع والمصب لكل S. تم الحصول على الدم في شكل الجينات 96-حسنا، على التوالي (الشكل 2A). لدينا في ظل ظروف PCR وباستخدام البادئات المصممة، تم تضخيم منتج معين من S. الدم في كل الحمض النووي الجيني تفاعل PCR. وأشارت هذه النتيجة الاشعال كانت محددة للغاية لأهداف S. الدم. من خلال PCR عالية الإنتاجية إعادة إنشاء التضخيم باستخدام الاشعال F1 وR3 وثلاثة amplicons كقوالب DNA، وخطي المؤتلف يبني PCR (~ 3 كيلوبايت) على لوحة 96-حسنا، تتألف من منطقة المنبع من الجينات المستهدفة لكل منها، والكاناميسين كاسيت، والمنطقة المصب كل الجينات المستهدفة في هذا النظام (الشكل 2B). تحولت بعد ذلك إلى المؤتلف يبني PCR S. SK36 الدم والذي اختاره الكاناميسين على لوحة أجار BHI. بالنسبة لغالبية transformations، أكثر من 1000 مستعمرة تم الحصول على كل لوحة (أ) 2 microaerobic بعد مد الحضانة. عندما كانت هذه المستعمرات باستخدام PCR-F1 وتضخيم R3، فرقة DNA واحدة الموافق حجم متحولة المتوقع (~ 3 كيلوبايت) لوحظ من قبل الكهربائي للهلام (الشكل 2C). عند محاولة حذف الجينات الأساسية المحتملة، يمكن أن يتم الحصول على مستعمرات في معظم التحولات. لحذف بعض الجينات الأساسية، ومع ذلك، تم الحصول على مستعمرات لا تزال تحول التالية. بعد التضخيم PCR من هذه المستعمرات باستخدام F1/R3، ظهرت عصابات DNA الموافق 2 حجم متحولة المتوقعة وحجم النوع البري كما يتضح من هلام الكهربائي (الشكل 2C). بالنسبة لبعض المسوخ، والحجم المتوقع متحولة وحجم النوع البري من AMPLICON PCR قريبة جدا من أن تكون مفصولة هلام الاغاروز طويلة. في هذه الحالة، وقد صمم لT1 التمهيدي الداخلية بناء على تسلسل الجين من النوع البري. تم إجراء PCR باستخدام التمهيدي T1 الداخلية علىالثانية F1 التمهيدي (الشكل 2D). تم استخدام SK36 البرية من نوع سلالة ومراقبة إيجابية لهذا PCR. إذا كان تضخيم الفرقة مع الحجم المتوقع من متحولة باستخدام التمهيدي الداخلية، تم تحديد الجين الجينات الأساسية و(مزدوج النطاق متحولة) منذ وجود كاسيت في الكاناميسين متحولة وأكد من قبل تسلسل الحمض النووي باستخدام التمهيدي P1. بناء على هذا البروتوكول، في نهاية المطاف جمعنا 2048 غير الضرورية S. المسوخ الجينات الدم باستثناء ORFs الأربعة الواردة بالكامل داخل ORFs أخرى (الجدول 1). حددنا 218 الجينات التي تعتبر ضرورية لS. الدم بقاء تحت الظروف التجريبية.
| فئة | القراءة المفتوح الإطارات (ORF) |
| مجموع الجينات * | 2270 |
| الجينات المستهدفة | 2266 |
| غير الأساسية (promoterless APHA-3) | 1973 |
| غير الأساسية (مروج APHA-3) | 75 |
| الأساسية (أي transformant) | 60 |
| الأساسية (مزدوج النطاق) | 158 |
* أربعة ORFs الواردة بالكامل داخل ORFs أخرى.
الجدول 1. S. ملخص الجينات الطافرة الدم.
الشكل 1. تم تصميم المؤتلف. PCR ثلاث مجموعات من الاشعال (F1/R1، وF2/R2 F3/R3) لتضخيم التسلسل المنبع، جين المقاومة للأدوية (كم ص) وتسلسل المصب، على التوالي. ينتهي كل 5 'من R1 والاشعال F3 تحتوى على سلاسل المشتركmplementary مع كاسيت من الجينات المقاومة للمضادات الحيوية و. يحيط A النهائي PCR المنتج الذي يحتوي على الحمض النووي المؤتلف علامة اختيار المضادات الحيوية مع S. ويتم إنتاج الدم باستخدام الحمض النووي الجيني F1/R3. وسيتم دمج الحمض النووي المؤتلف في S. الدم عن طريق إعادة التركيب الجينوم عبر أكثر من مزدوجة.
الشكل 2. الممثل الكهربائي للهلام من amplicons PCR على الاغاروز. A، 1-KB amplicons PCR من S. رئيسية أو فرعية للهدف الدم الجينات. B، والسلطات الوطنية المعينة PCR المؤتلف تتألف من المنبع والمصب من الجينات المستهدفة وpromoterless APHA-3. C، مستعمرة-PCR amplicons من تحول S. الدم مع السلطات الوطنية المعينة PCR المؤتلف؛ نطاقات مزدوجة في حارة 4 و 10 و 14 و 15 و 20 و 24. D، PCR التضخيم من المستعمرات من النوع البري ومتحولة باستخدام الاشعال F1/T1؛ M،متحولة؛ W، من النوع البري.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
للتقليل من الآثار المحتملة القطبية من استبدال جين واحد مع جين المضادات الحيوية المستهدفة الخارجية على الجينات المجاورة، وتتخذ خطوتين بينما التمهيدي الأولي تصميم. بالنسبة لمعظم الجينات حذف، فقد تم تصميم R1 الاشعال وF3 لحذف المنطقة الترميز من 6 BP بعد كودون بدء الغليان إلى 30 قبل كودون التوقف. يتم الاحتفاظ مشاركة أزواج قاعدة 30 الى حماية المحتملة موقع الريباسي ملزمة المستخدمة من قبل الجين المصب المجاورة. يتم توسيع المنطقة احتفظت بين اثنين من الجينات المجاورة إلى 100 BP عندما تقع فيها في التوجهات والعكس N-تيرميني كل من البروتينات على مقربة من بعضها البعض لمنع حذف منطقة المروج المحتملة. يتم استبعاد المروج من الجينات-3 APHA في بناء المؤتلف للحذف الجينات 5. هو عرض موقع الريباسي ملزمة في الجينات-3 APHA للترجمة. لاختبار استراتيجيتنا، ونحن شيدت بشكل عشوائي 10 و 96 ثم المسوخ تبادل أليلية. نحن سbtained 10 و المسوخ 93، على التوالي، على لوحات مختارة الكاناميسين، مما يشير إلى أن المروج أقل APHA-3 وأعرب عن الجين بشكل جيد في معظم الحالات. ثم قمنا بتصميم وتوليفها التمهيدي لالمروج أقل الجينات-3 APHA لجميع الجينات في الحذف S. الدم الجينوم. ومع ذلك، وجدنا بعض الجينات في S. وأعرب عن انخفاض الدم أو لا وأعرب الأمر الذي سيؤثر على الأرجح التعبير عن الجينات APHA-3 promoterless وبالتالي اختيار الكاناميسين. لحل هذه المشكلة، المروج من الجينات-3 APHA من البلازميد والتي أدخلت على كاسيت ص كيلومتر. تم الحصول على الجزء الأكبر من AMPLICON كم المروج كاسيت R من 10 PCR باستخدام بادئات F2p/R2 الفردية. إلا أن صممت الجديدة R1 المروج الاشعال R1p لتكملة مع AMPLICON كم المروج كاسيت ص، كانت جميع الخطوات البناء الأخرى لنفس المروج أقل البناء.
لتحسين الكفاءهذ من إعادة التركيب مثلي، نختار طويلة (1 KB) تسلسل المرافقة المنبع والمصب من S. الدم الجينات المستهدفة في صنع الجينات حذف بنيات. واقتصر حجم تسلسل المرافقة إلى 1 كيلو بايت على أساس نقطتين: (1) طول جزء DNA (~ 3 كيلوبايت) يسمح استعداد PCR التضخيم من الجينات APHA-3 (~ 1 KB) بالإضافة إلى 2 كيلو بايت من متواليات المرافقة باستخدام عالية الدقة البلمرة DNA؛ و (2) إمكانية التسلسل المناطق المحيطة باستخدام طريقة التسلسل ABI من كلا الطرفين (~ 1 KB). ارتفاع أعداد transformants في معظم S. وأشار الحذف الجينات الدم تسلسل 1 كيلوبايت المنبع والمصب، على التوالي، كانت كافية لخروج المغلوب الجينات المستهدفة.
لنجاح الاتصال سوف تتم إضافة المنبع والمصب من الجين الهدف مع طرفي APHA-3 التضخيم PCR الجينات في المؤتلف والشعائل R1، F2، F3 R2 وحتى 5 من "ينتهي تسلسل الإضافية التي تكمل مع كونecting نهاية الجانب الآخر في كثير من الحالات البكتيرية حذف الجينات 6،7. وأظهرت الدراسات الأولية أنه يمكن تخفيض تسلسل إضافية إلى 25 بي بي لهذا البروتوكول PCR المؤتلف. في هذا البروتوكول، ونحن القضاء تسلسل إضافية من F2 الاشعال وR2-3 في APHA الجينات، وأضاف 25-BP تسلسل إضافية إلى نهاية 5'-R1 من وF3 في المنبع والمصب من S. الهدف الدم الجينات. وهذا التصميم يقلل من طول وكمية الاشعال وبالتالي تقليل التكاليف والأوقات PCR لتحسين كفاءة وحيدة الجين الحذف. في المختبر لدينا، كما تم تصميم هذا الحذف بنجاح لأثبت الجينات في الميكروبات الأخرى مثل العقدية mutans والعقدية الرئوية، واللثوية Porphyromonas.
في هذا البروتوكول، وخصوصية الاشعال PCR أمر بالغ الأهمية. كان حجم التمهيدي التمهيدي درجة حرارة انصهار مرتفعة (> 58 ° C)، الطويل (> 21 بي بي)، والذي يصدر مرتين التمهيديوكان موقع nding فريدة من نوعها في جينوم S. الدم. أنتج هذا تصميم واحد الجينات المحددة المنتجات في كل من التكبير تقريبا لدينا PCR. A احد الجينات الخاصة PCR التضخيم من المنتج هو أمر حاسم لتضخيم PCR في الماضي. خلاف ذلك، فإن التضخيم PCR النهائي التي تؤدي إلى تشكيل يتكون المؤتلف النهائي لأقاليم كل جين في المنبع والمصب والمضادات الحيوية كاسيت الجينات، على التوالي، سيكون صعبا.
وقد تجلى الخلية الكثافة الاعتماد التحول في العقديات كثيرة مثل S. الدم 8، S. الطافرة 9 و S. الرئوية 10. عندما كثافة خلية من S. وصلت إلى 660 OD الدم من 0،07-0،08 (الموافق 6 5x10 ~ CFU / مل) + HS في TH المتوسطة، وكفاءة أعلى من التحول S. تم الحصول على الدم PCR مع AMPLICON المؤتلف الخطية وتصل إلى 20٪ من S. خلايا الدميمكن أن تتحول. بعد الانتهاء من الحذف الجينات في الجينوم على نطاق S. الدم، وجدنا أن عدد من transformants لحذف بعض الجينات غير الضرورية كانت منخفضة (~ 10). ليس هناك شك في أن ارتفاع كفاءة التحويل من البكتيريا المهم لتلبية جميع الجينات الحذف غير الأساسية في بالضربة القاضية جين الجينوم على نطاق.
باستثناء المؤتلف إنشاء بناء من قبل PCR، وهناك أيضا أساليب أخرى لتعطيل جين واحد. على سبيل المثال، إنشاء انتحاري البلازميد كان ينطبق على نطاق واسع لتعطيل الجينات البكتيرية على نطاق صغير. ومع ذلك، لم يتم استخدامها لهذه التقنية على نطاق الجينوم تعطيل جين واحد على نطاق واسع بسبب إنشاء البلازميد بكثير تستغرق وقتا طويلا وشاقة، وبعض أنواع البكتيريا تحتاج إلى إنشاء انتحاري البلازميد محددة. على الرغم من أن علامة أقل حذف الجينات قد تجنب التأثير المحتمل القطبية من الجينات المقاومة للمضادات الحيوية، الجينات التقليدية حذف علامة أقل الأسلوب هو المزيد من الوقت يخدعبافتراض ويصعب تعطيل الجين من طريقة الانتحار البلازميد. في الإشريكية القولونية، وقد تم الحصول على الحذف الجينات الجينوم على نطاق علامة أقل من خلال استبدال الجينات المقاومة للمضادات الحيوية مع وثم القضاء على المقاومة كاسيت 6. ومع ذلك، هذا E. سلالة الإشريكية يتطلب recombinase بالعاثية الأحمر λ. قبل حذف الجينات التحول، ينبغي عرض pKD46 المساعد الأحمر البلازميد إلى E. القولونية 11. في أسلوبنا، ونحن القضاء المروج من الجينات المقاومة APHA-3 في الغالبية العظمى من الجينات طفرات حذف وتصميم ثنائي نهايات APHA ORF-3 لمتابعة هيكل تعبير عن الجينات حذف المنطقة، لتجنب القطبية قضية تأثير كاسيت المقاومة. حتى الآن، لم نجد قضية تأثير القطبية بعد دراسة وظيفة من المسوخ التي أنشأتها العديد من هذه التكنولوجيا. مجموعة الجينوم على نطاق واضحة من الجينات الأساسية المكتسبة في S. الدم باستخدام الويعني أيضا تقنية 12 إمكانية انخفاض تأثير القطبية من المضادات الحيوية الكاسيت في النظام. لقد أثبتنا غيرها من الجينات المروج أقل مقاومة للمضادات الحيوية، مثل الاريثروميسين والجينات المقاومة الكلورامفينيكول، ويمكن تطبيق هذه التقنية في (البيانات لا تظهر). وبالإضافة إلى ذلك، هذه التقنية لا يحتاج المضيف انتحاري البلازميد وأعيد بناؤها. وعموما، هذا الأسلوب هو إنتاجية عالية لإنشاء الجينوم على نطاق حذف الجينات يبني ويمكن أن يكون من السهل القيام بها في الجينوم على نطاق طفرة جينية واحدة من نوع من البكتيريا.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
وأيد هذا العمل من المنح المقدمة R01DE018138 من المعاهد الوطنية للصحة (PX) وجزئيا من جامعة فرجينيا كومنولث الرئاسية بحوث برنامج الحوافز (PRIP) 144602-3 (PX). نشكر الدكاترة. ليو تشن، Yuetan ضو وانغ شياو جينغ لمساعدة في بناء المسوخ الجينوم واسعة. ونشكر أيضا مرفق الأساسية DNA في جامعة فرجينيا كومنولث لتسلسل الحمض النووي.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Primer F2 | Integrated DNA Technologies | TGACTAACTAGGAGGAATAAATG GCTAAAATGAGAATAT |
|
| Primer R2 | ibid | CATTATTCCCTCCAGGTACTAAAA CAATTCATCCAGT |
|
| Primer F2p | ibid | GATAAACCCAGCGAACCATTTGA | |
| Primer P1 | ibid | GCTTATATACCTTAGCAGGAGACA | |
| Primer P2 | ibid | GTATGACATTGCCTTCTGCGTCC | |
| Primer 5' end_R1_seq | ibid | GCCATTTATTCCTCCTAGTTAGTCA | |
| Primer 5' end_F3_seq | ibid | GTTTTAGTACCTGGAGGGAATAATG | |
| Primer 5' end_R1p_seq | ibid | CCTCAAATGGTTCGCTGGGTTTATC | |
| CSP | Synprep | Sequence:NH2-DLRGVPNPWGWIFGR-COOH | |
| DNA Polymerase | Invitrogen | 11304-102 | Platinum Taq DNA Polymerase High Fidelity |
| EcoRI | New England Biolabs Inc | R0101S | Restriction enzyme |
| Agar | American Bioanalytical | AB01185 | |
| Agarose | Promega | V3125 | |
| BHI | BD Biosciences | 237500 | Brain Heart Infusion |
| Horse serum | Fisher Scientific | SH3007403 | Horse serum |
| Km | Fisher Scientific | BP906-5 | Kanamycin |
| TH broth | BD Biosciences | 249240 | Todd Hewitt broth |
| PureLink 96 | Invitrogen | K310096 | PureLink 96 PCR purification kit |
| QIAquick | Qiagen | 28106 | QIAquick PCR purification kit |
| Filter | Corning | 431117 | 0.22 μm polystyrene filter |
| Anoxomat System | Mart Microbiology b.v. | Anoxomat Mark II | |
| Benchtop centrifuge | Thermo Scientific | 75004377 | Sorvall Legend RT Plus microplate rotor |
| Gel Documentation | UVP LLC | BioDoc-It 210 | |
| Incubator | Fisher Scientific | 11-690-625D | Isotemp |
| Labnet's Gel XL | Labnet | E0160 | Labnet's Gel XL |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 22621408 | Microcentrifuge 5415 R |
| Multichannel pipettes | Thermo Scientfic | 4661040, 4661020 | Finnpipette F1 |
| Thermal Cycler | Applied Biosystems Inc. | N805-0200 | GeneAmp PCR system 9700 |
References
- Sassetti, C. M., Boyd, D. H., Rubin, E. J. Genes required for mycobacterial growth defined by high density mutagenesis. Mol. Microbiol. 48, 77-84 (2003).
- Kobayashi, K., et al. Essential Bacillus subtilis genes. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 4678-4683 (2003).
- Trieu-Cuot, P., Courvalin, P. Nucleotide sequence of the Streptococcus faecalis plasmid gene encoding the 3'5"-aminoglycoside phosphotransferase type III. Gene. 23, 331-341 (1983).
- Paik, S., et al. Identification of virulence determinants for endocarditis in Streptococcus sanguinis by signature-tagged mutagenesis. Infect. Immun. 73, 6064-6074 (2005).
- Lukomski, S., et al. Nonpolar inactivation of the hypervariable streptococcal inhibitor of complement gene (sic) in serotype M1 Streptococcus pyogenes significantly decreases mouse mucosal colonization. Infect. Immun. 68, 535-542 (2000).
- Baba, T., et al. Construction of Escherichia coli K-12 in-frame, single-gene knockout mutants: the Keio collection. Mol. Syst. Biol. 2, (2006).
- de Berardinis, V. A complete collection of single-gene deletion mutants of Acinetobacter baylyi ADP1. Mol. Syst. Biol. 4, 174 (2008).
- Rodriguez, A. M., et al. Physiological and molecular characterization of genetic competence in Streptococcus sanguinis. Mol. Oral. Microbiol. 26, 99-116 (2011).
- Perry, D., Kuramitsu, H. K. Genetic transformation of Streptococcus mutans Infect. Immun. 32, 1295-1297 (1981).
- Pakula, R., Walczak, W. On the nature of competence of transformable streptococci. J. Gen. Microbiol. 31, 125-133 (1963).
- Datsenko, K. A., Wanner, B. L. One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 6640-6645 (2000).
- Xu, P., et al. Genome-wide essential gene identification in Streptococcus sanguinis. Sci. Rep. 1, (2011).
