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Biology

게놈 전체 유전자 삭제할에 Published: November 23, 2012 doi: 10.3791/4356

Summary

효율적인 게놈 전체의 단일 유전자 돌연변이 방법은 사용하는 설립되었습니다

Abstract

Transposon mutagenesis 및 단일 유전자 삭제 박테리아 1,2의 게놈 전체 유전자 녹아웃에 적용된 두 가지 방법이 있습니다. transposon의 mutagenesis이 적은 시간이 소요 적은 비용이 많이 드는, 그리고 완성 된 게놈 정보를 요구하지 않습니다하지만,이 방법은 두 약점이 있습니다 : 감소 경쟁과 뮤턴트 카운터 선택하는 혼합 돌연변이 라이브러리의 서로 다른 돌연변이 (1) 가능성, (2) 일부 유전자 불 활성화의 가능성은 상기 유전자가 완전히 transposon의 삽입에 따라 자신의 기능을 잃게하지 않습니다. 단일 유전자 삭제 분석 transposon의 mutagenesis와 관련된 단점을 보완 할 수 있습니다. 게놈 전체의 단일 유전자 삭제의 효율성을 개선하기 위해, 우리는 모델 생물로 연쇄상 구균의 sanguinis를 사용하여 게놈 전체의 단일 유전자 삭제에 대한 높은 처리량 기술을 확립하려고합니다. 각 유전자 삭제 S.에 구축 sanguinis 게놈는 1을 구성하도록 설계되었습니다타겟 유전자 aphA-3 유전자 인코딩 kanamycin 저항 단백질, 그리고 타겟 유전자의 1 이하 하류-KB 상류. 프리 머 F1/R1, F2/R2, 그리고 F3/R3 세 세트를 각각 설계, 각 삭제 그 세 가지 구성 요소 구성의 PCR-amplifications을위한 96 - 웰 플레이트 형식으로 합성됩니다. 프리 머 R1과 F3는 5 '끝 부분에있는 aphA-3 유전자의 지역에 보완 25 BP 시퀀스가 포함되어 있습니다. aphA-3 유전자의 대규모 PCR 증폭은 모든 단일 유전자 삭제 구조를 만드는 한 번 수행됩니다. aphA-3 유전자의 프로모터는 처음 kanamycin 카세트의 잠재력 극성 효과를 최소화하기 위해 제외됩니다. 유전자 삭제 구조를 만들려면, 높은 처리량 PCR의 증폭 및 정화는 96 - 웰 플레이트 형식으로 수행됩니다. 각 유전자 삭제에 대한 선형 재조합 PCR의 amplicon는 고 충실도의 DNA 중합 효소를 사용하여 네 PCR 반응을 통해 구성됩니다. 초기 exponS.의 ential 성장 단계 2.5 % inactivated 말 혈청이 PCR-재조합 구조의 변화에 대한 능력을 향상하는 데 사용됩니다와 토드 휴이트 국물에 배양 sanguinis이 보충. S.의 조건, 최대 20 % sanguinis 세포는 DNA의 ~ 50 NG를 통해 변환 할 수 있습니다. 이 방법에 따라, 단일 유전자 삭제로 2048 뮤턴트은 궁극적으로 S.에있는 2,270 유전자에서 얻은되었습니다 네 유전자 ORFs 제외 sanguinis은 S.의 다른 ORFs 내에 완전히 포함 sanguinis SK36 218 가능성이 필수적인 유전자. 유전자 삭제 구조를 만드는 방법에 대한 기술은 높은 처리량이며, 모든 transformable 박테리아 게놈 전체의 단일 유전자 삭제에 사용하기 쉬운 될 수 있습니다.

Protocol

1. 프라이머 디자인

  1. 프리 머은 S.에 따라 집 스크립트에서 사용 설계되어 있습니다 sanguinis SK36 게놈 시퀀스. 프리 머, F1/R1, F2/R2, 그리고 F3/R3 세 세트 대상 유전자 aphA-3 유전자 인코딩 kanamycin 저항 (km R) 단백질 (3) 및 (1)의 1 킬로바이트 상류 시퀀스의 증폭을 위해 설계되었습니다 각각 대상 유전자의-KB 하류 순서 (그림 1). 이러한 프리 머 가운데 F1 및 R3는 프로그램의 양각 스위트 룸 (에 ePrimer3를 사용하여 설계되었습니다 http://emboss.sourceforge.net/apps/cvs/emboss/apps/index.html 대상의 상류 또는 하류 측면을 노릴 지역을 확대하려면) 유전자. 유전자 특정 프리 머, R1 및 F3는 5 '와 3'대상 유전자의 시퀀스에 따라 설계되었습니다. R1과 F3 프리 머의 aphA-3에 보완의 5 '끝에서 25-BP 어댑터 시퀀스를 포함유전자. 각 프라이머의 녹는 온도는 가장 가까운 가능한 60 ° C 96 - 웰 형식의 모든 PCR 반응에 대한 온도를 어닐링 유니폼의 사용을 활성화 할 수 있습니다. 할 수 있도록 설계되었습니다
  2. F1, R1, F3 및 R3 프리 머은 유전자 순서에 따라 96 - 웰 플레이트에 합성됩니다. 각 판은 동일한 유전자 순서 프리 머의 한 종류가 포함되어 있습니다. 채널 피펫을 사용하여 PCR 증폭을위한 10 μm의 최종 농도로 96 - 웰 작동 프라이머 판에서 프리 머를 희석.

2. 높은 처리량 PCR 증폭 및 정화

  1. 높은 처리량 증폭하려면 1 킬로바이트 상류 또는 대상 S.의 하류 sanguinis의 유전자는 1640 μl ddH 2 O, 250 μl 10xHigh 성심 PCR 버퍼, 10 MM dNTP 혼합물의 200 μl, 50 MM 100 μl MgSO 4, 100 μl를 포함하는 15 ML 원뿔 튜브에 얼음에 PCR 칵테일 혼합을 조립 10 μl / NG S. sanguinis SK36 게놈의 DNA와 10 μl 플래티넘 DNA 형성 촉매 DNA polyme새기다 고 충실도 및 전송 채널 피펫을 사용하여 96 - 웰 PCR 플레이트의 각도에 혼합물의 23 μl. 채널 피펫을 사용하여 PCR 플레이트에 프라이머 플레이트 작업 10 μM에서 각각 F1과 R1 (또는 F3와 R3) 1 μl를 전송합니다. PCR 플레이트를 밀봉하고 1.5 분 30 초 및 68 ° C에 30 초 1 분, 그리고 94 ° C의 30주기, 54 ° C에 94 ° C에서 증폭을 수행합니다.
  2. 1퍼센트 아가로 오스 겔 48 우물 피팅 멀티 채널 피펫 로딩과 ethidium 브로마이드를 포함하는 준비. 96 - 웰 플레이트에 5xDNA 로딩 버퍼 1 μl를 갖춘 4 μl PCR 제품을 섞어서 10 μl 다 채널 피펫을 사용하여 아가로 오스 겔에서 샘플을로드합니다. 30 분에 135 V의 전기를 실행합니다. UVP 문서 및 분석 체제에서 젤에 밴드를 검사합니다.
  3. 제조업체의 지시에 따라 원심 분리를 사용하여 PureLink 96 PCR 정화 키트하여 PCR 제품을 정화. DNA를 용출를 들어, B의 잘 40 μl 멸균 ddH 2 O를 추가 할판을 inding.
  4. 무작위로 NanoDrop 분광 광도계를 사용하여 DNA 농도를 검사하기 위해 접시에 몇 정화 amplicons을 선택합니다. 접시에 amplicons의 농도를 조정하려면 ~ μl / 10 NG.
  5. 플라스미드 포함 킬로미터 연구 카세트는 PCR 템플릿으로 EcoR I을 사용하여 소화하고 있습니다. 소화 플라스미드는 QIAquick PCR 정화 키트에 의해 정화되고 선형 플라스미드 DNA는 최종 DNA 농도로 10 NG / μl를 조정됩니다. SO 16.4 μl ddH 2 O, 2.5 μl 10xHigh 성심 PCR 버퍼, 10 MM dNTP 혼합물의 2 μl, 50 밀리미터 MG 1 μl를 포함 킬로미터 연구 카세트 amplicon 25 μl 혼합물을 조립 4, 10 μM F2, 1 μl 1 μl 10 μM의 R2, 1 μl 선형 플라스미드 DNA와 0.1 μl 플래티넘 DNA 형성 촉매의 DNA 중합 효소의 고 충실도. ° C 1 분 30 초 68 30 초 1 분, 그리고 94 ° C의 30주기, 55 ° C에 94 ° C에서 PCR 증폭을 수행합니다. 1퍼센트 아가로 오스의 겔 전기 영동하여 PCR 제품을 검사합니다. 푸QIAquick PCR 정화 키트로 10 개인 PCR 정화의 km R 카세트 amplicon의 라 일괄. 10 NG / μl로 amplicon 농도를 조정합니다.
  6. 최종 선형 재조합 PCR의 amplicon을 구하려면 세 PCR의 amplicons은 잘 PCR 템플릿과 같은 하나 PCR 플레이트의 각 1 μl (거의 동등한-몰 양에서)과 결합되어 있습니다. 다른 PCR 구성 요소는 SO 14.4 μl ddH 2 O, 2.5 μl 10xHigh 성심 PCR 버퍼, 10 MM dNTP 혼합물의 2 μl, 50 밀리미터 MG 1 μl를 포함한 추가됩니다 4, 10 μM의 F1 1 μl, 10 μM R3의 1 μl, 0.1 μl 플래티넘 DNA 형성 촉매의 DNA 중합 효소의 높은 충실도를. PCR 증폭은 4 분에 3.5 분, 그리고 마지막으로 68 ° C 30 초 및 68 ° C 30 초 55 ° C에서 2 분, 94의 30주기 ° C에 94 ° C에서 수행된다.
  7. 아가로 오스 겔에서 PCR amplicons를 검사합니다. 정화하고 위에 설명 된대로 PCR의 amplicons을 수량화. -20 ° C.에서 재결합 PCR의 amplicons를 고정

3. COMpetent 셀 준비

  1. 토드 휴이트 국물이 준비되어 상온으로 냉각 및 0.22 μm의 폴리스티렌 필터 4를 사용 소독 한 후 끓여야하고 가열 10 N NaOH를 사용하여 7.6로 조정 산도. TH + HS 매체를 만회하기 위해 15 ML 원뿔 튜브에 11.7 ML 토드 휴이트 국물에 300 μl 열 inactivated 말 커를 (2.5 %까지 최종 농도)를 추가합니다. 나누어지는의 TH + HS 중간이 ML 튜브 10 ML에.
  2. 주식 S. 5 μl의 예방 sanguinis SK36 2 ML의 TH + HS 매체에 -80 ° C에서 냉동 37에 단단히 상한과 밤 문화를 길러 10 ML-TH + HS 관을 미리 잠복기와 함께 ° C,.에게
  3. 박 한 후, 10 ML TH + HS에 50 μl 문화를 전송하고 3 시간 (0.07-0.08의 OD 660에 해당)를 37 ° C에서 관을 길러 즉시 변환을 위해 사용합니다.

4. 셀 변환과 항생제 선택

  1. 70 NG S. 2 μl를 추가합니다 sanguinis SK36 competence 자극 펩타이드 (CSP)과 37 번 블록 96 - 웰하고 사전에 따뜻한에서 Eppendorf 튜브 2 μl 선형 재조합 PCR amplicon (~ 50 NG) ° C. 각 튜브에 3 시간 - incubated SK36 문화의 330 μl를 전송합니다. 1 시간에 37 ° C에서 알을 품다. 제어 등의 살균 ddH 2 O와 DNA를 교체하십시오.
  2. 얼음 블록을 놓고, 500 μg / ML의 kanamycin과 뇌 심장 주입 (BHI) 한천 플레이트의 각 변형 100 μl을 알리십시오. microaerobic 조건 하에서 2 D에 37 ° C에서 접시를 품다.

5. 돌연변이 확인 및 저장

  1. 각 교체 돌연변이를 들어, 무작위, 2 개인 식민지을 데리러 오 ML BHI가 500 μg / ML의 kanamycin을 포함하는으로 식민지의 예방 및 37에서 microaerobically 밤 inoculum을 품어 ° C. -80에서 30 % 글리세롤에있는 각 문화를 Cryopreserve ° C
  2. 예상 유전자 교체를 포함하는 돌연변이가 식민지 각 돌연변이 사용하는 F1에 대한 PCR 및 R3을 수행 여부를 검사하려면96 - 웰 PCR 판에서 프리 머. 개별 식민지에서 약 1 μl 밤 문화는 25 μl PCR-증폭 반응에서 DNA 템플릿으로 사용됩니다. PCR는 ° C 3.5 분, 그리고 마지막으로 68 ° C 4 분에 30 초 및 68에 30 초, 55 ° C에 5 분, 94의 35주기 ° C에 94 ° C에서 수행된다.
  3. 정확하게 이중 대역 돌연변이 나 오염 물질 PCR의 amplicon을 확인하려면 ethidium의 브로마이드 착색과> 12cm 길이 2% 아가로 오스 겔에서 4 시간에 전기 영동하여 PCR amplicon을 확인합니다. 이 아가로 오스 겔 전기 영동 조건에서 ≥ 100 BP의 차이가있는 모든 amplicons은 분명하게 식별되었습니다. km의 R 카세트의 증폭 및 야생 형 유전자에서 발생하는 밴드는 내부 T1의 프라이머는 야생 형 유전자는 PCR에 의해 검출 될 수 있는지 여부를 결정하는 데 사용됩니다 <100 BP에 의해 차이가 예상하는 경우.
  4. 추가로 삭제를 확인하려면 amplicons는 PureLink 96 PCR 정화 키트에 의해 정화되고있는 P1의 프라이머를 사용하여 순서가 아르km의 R 카세트에 바인딩합니다. 시퀀싱에 의해 확인 만 정확한 돌연변이세요.

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Representative Results

후 PCR의 프리 머 F1과 R1을 사용하여 증폭하고, F3 및 R3, 각 S. 약 1 킬로바이트 업스트림 및 다운 스트림 sanguinis 유전자는 96도 형식은 각각 (그림 2A)에서 얻은되었습니다. 우리의 PCR 조건 및 사용하여 설계 프리 머에서 특정 제품 S.에서 증폭 된 각 PCR 반응에 sanguinis 게놈 DNA. 이 결과는 프리 머은 S.의 목표에 매우 구체적인이었다 표시 sanguinis. PCR을 통해 F1과 R3 프리 머와 DNA 템플릿, 선형 재조합 PCR 구조 (~ 3 KB) 3 개 amplicons을 사용하여 재 증폭은 높은 처리량 각 대상 유전자, kanamycin의 상류 지역으로 구성 96 - 웰 플레이트에 만들어졌습니다 카세트, 그 순서 (그림 2B)의 각 대상 유전자의 지역 하류. 재조합 PCR 구조는 다음 S.로 변환 된 sanguinis SK36 및 BHI 한천 플레이트에 kanamycin에 의해 선택되었습니다. transfo의 대부분을rmations는, 1000 식민지 microaerobic이 D-부화에 따라 각 접시에 취득했다. 이러한 식민지 당시 F1과 R3, 예상 돌연변이 크기 (~ 3 KB) 겔 전기 영동 (그림 2C)에 의해 관찰 된에 해당하는 하나의 DNA 밴드를 사용하여 PCR-증폭. 잠재적 필수 유전자를 삭제하려고하면 아무 식민지는 변환의 대다수 취득하지 못했습니다. 일부 필수 유전자의 삭제하지만, 식민지는 여전히 다음과 같은 변화를 취득했다. F1/R3를 사용하여 이러한 식민지의 PCR 증폭 후, 예상 돌연변이 크기에 해당하고 야생 형 크기의이 DNA 밴드는 겔 전기 영동 (그림 2C)에 의해 밝혀 나타났다. 일부 돌연변이를 들어, 예상 돌연변이 크기와 PCR amplicon의 야생 타입의 크기가 너무 깁니다 아가로 오스 젤로 구분 주변되었습니다. 이 경우 내부 프라이머 T1은 야생 형 유전자 순서에 따라 설계되었습니다. PCR은 내부 T1의 프라이머를 사용하여 수행되었다차 F1의 프라이머 (그림 2D). 야생 형 SK36이 PCR에 대한 긍정적 인 제어 변형으로 사용되었습니다. 예상 크기의 밴드가 내부 프라이머를 사용하여 돌연변이에서 증폭 된 경우 유전자는 P1의 프라이머를 사용하여 DNA 배열에 의해 이전에 확인 된 돌연변이의 kanamycin 카세트의 존재 때문에 필수적인 유전자 (더블 밴드 돌연변이)로 확인되었다. 이 프로토콜을 바탕으로, 우리는 결국 2048 중요하지 않은 S. 수집 다른 ORFs (표 1) 내에 완전히 포함 된이 네 ORFs을 제외 sanguinis 유전자 돌연변이. 우리는 S.를 위해 필수적입니다 218 유전자를 식별 실험 조건 하에서 sanguinis의 생존.

클래스 오픈 읽기 프레임 (ORF)
총 유전자 * 2270
타겟 유전자 2266
중요하지 않은 (aphA-3 promoterless) 1973
중요하지 않은 (발기인 aphA-3) 75
필수 (NO transformant) 60
필수 (더블 밴드) 158

다른 ORFs 내에 완전히 포함 * 네 ORFs.

표 1. S. sanguinis 유전자 돌연변이 요약입니다.

그림 1
1 그림. 프리 머의 재조합 PCR. 세 세트 (F1/R1, F2/R2 및 F3/R3) 각각 상류 순서, 약물 저항 유전자 (km R) 및 하류 순서를 증폭하기 위해 설계되었습니다. R1과 F3의 프리 머의 5 '모두 끝 시퀀스 공동을 포함항생제 내성 유전자의 카세트와 mplementary. 항생제 선택 마커를 포함하는 최종 PCR 재조합 DNA 제품은 S로 둘러싸인 sanguinis의 게놈의 DNA는 F1/R3를 사용하여 생산하고 있습니다. 재조합 DNA는 S.에 통합 될 것입니다 더블 크로스 오버 재조합을 통해 sanguinis의 게놈.

그림 2
그림 2. 아가로 오스의 PCR amplicons 대표 젤 전기 영동. 상류 또는 대상의 하류 S.의 A, 1 킬로바이트 PCR의 amplicons sanguinis 유전자. B, 업스트림 및 대상 유전자의 하류 및 promoterless aphA-3로 구성된 PCR 재조합 DNAs. S.의 변화에서 C, 식민지-PCR의 amplicons PCR 재조합 DNAs과 sanguinis, 레인 4, 10, 14, 15, 20, 24의 더블 밴드. D, 프리 머 F1/T1를 사용하여 야생 유형과 돌연변이 식민지의 PCR 증폭, M,돌연변이, W, 야생 유형입니다.

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Discussion

초기 뇌관이 설계하면서 이웃 유전자에 대한 외인성 항생제 유전자과 하나가 타겟 유전자의 교체 가능한 극성 효과를 최소화하기 위해 두 단계 이동합니다. 삭제 된 유전자의 대부분은 프리 머 R1과 F3는 사전 정지 코돈 30 BP로 시작 코돈에 따라 6 BP에서 코딩 영역을 삭제할 수 있도록 설계되었습니다. 지난 30 기본 쌍은 인접 하류 유전자에 의해 사용 가능성 ribosomal 구속력이 사이트를 보호하기 위해 유지됩니다. 두 이웃 유전자 사이의 보존 지역은 그들이 반대 방향에있는 때 100 BP로 확장하고 두 단백질의 N-말단은 잠재적 인 프로모터 영역을 삭제 방지하기 위해 서로 가깝습니다. aphA-3 유전자의 프로모터는 유전자 삭제 5 재조합 구조에서 제외됩니다. ribosomal 바인딩 사이트 번역 aphA-3 유전자 도입된다. 우리의 전략을 테스트하기 위해, 우리는 무작위로 다음 96 allelic 교환 뮤턴트 10 구축합니다. 우리는 O발기인 - 이하 aphA-3 유전자는 대부분의 경우에 잘 표현되었다는 제안, kanamycin 선택 접시에 각각 10, 93 뮤턴트, btained. 우리는 설계 및 S.의 모든 유전자 삭제를위한 발기인없는 aphA-3 유전자에 대한 프라이머를 합성 sanguinis 게놈. 그러나, 우리는 S. 일부 유전자를 발견 sanguinis은 낮은 명시 적 또는 가능성이 promoterless aphA-3 유전자와 따라서 kanamycin 선택의 표현에 영향을 미칩니다하는 표현되지 않았습니다. 이 문제를 플라스미드에서 aphA-3 유전자의 프로모터를 해결하기 위해하는 것은 km의 R 카세트에 소개되었습니다. 프로모터 km R 카세트 amplicon의 일괄 프리 머 F2p/R2를 사용하여 10 각 PCR로부터 얻은 것입니다. 새로 R1 발기인 프리 머 R1p이 프로모터 km R 카세트 amplicon과 보완을 위해 설계되었습니다 경우를 제외하고, 다른 모든 건설 단계는 발기인없는 건설 같은습니다.

efficienc을 개선하는 방법상동 재조합의 y는, 우리는 S.의 업스트림 및 다운 스트림 긴 (1 KB) 측면을 노릴 시퀀스를 선택합니다 유전자 삭제 구조를 만드는 sanguinis 대상 유전자. 측면을 노릴 시퀀스 크기는 두 지점을 기준으로 1킬로바이트으로 제한되었다 : (1) DNA 조각의 길이는 (~ 3 KB) 준비 PCR의 aphA-3 유전자 (~ 1 KB)의 증폭 플러스 사용 측면을 노릴 시퀀스의 2킬로바이트 허용 고 충실도의 DNA 중합 효소 및 (2)의 양쪽 끝 (~ 1 KB)에서 ABI 시퀀싱 방법으로 측면을 노릴 영역을 시퀀싱의 가능성. S.의 가장에 transformants 높은 숫자 sanguinis 유전자 삭제가 넉 아웃 대상 유전자에 충분 각각 1킬로바이트 업스트림 및 다운 스트림 시퀀스를 지적했다.

성공적인 업스트림 및 PCR 재조합 증폭 프리 머 R1, F2, R2와 F3의 aphA-3 유전자의 두 끝으로 대상 유전자의 하류는 자신의 5 '에 추가 될 것입니다 연결하려면 conn과 보완이 추가 시퀀스를 종료많은 박테리아 유전자 삭제 케이스 6,7에 다른 쪽 끝을 ecting. 예비 연구는 추가 순서이 재조합 PCR 프로토콜 25 혈압을 감소 할 수 있다는 사실을 보여 주었다. 이 프로토콜에서는, 우리는 aphA-3 유전자에 프리 머 F2와 R2의 추가 시퀀스를 제거하고에 R1과 F3의 5'-끝으로 25 BP 추가 시퀀스를 추가 업스트림 및 다운 스트림 S.의 sanguinis 대상 유전자. 이 디자인은 프리 머의 길이와 양을 감소시키고 그럼으로써 단일 유전자 삭제의 효율성을 향상시키기 위해 비용과 PCR 시간을 줄일 수 있습니다. 저희 연구실에서는이 디자인도 성공적으로 이러한 연쇄상 구균의 mutans연쇄상 구균의 pneumoniae, 그리고 Porphyromonas gingivalis의 같은 다른 미생물에 유전자 삭제에 대한 증명되었습니다.

이 프로토콜에서는 PCR 프리 머의 특이성이 중요합니다. 프라이머의 녹는 온도가 (> 58 ° C) 고했습니다 프라이머 크기 (> 21 BP) 긴이었고, 프라이머 양방향nding 사이트는 S.의 게놈에서 유일했습니다 sanguinis. 이 디자인은 우리의 PCR amplifications의 거의 각 단일 유전자 특정 제품을 생산. PCR 증폭의 단일 유전자 특정 제품은 지난 PCR 증폭을위한 중요합니다. 그렇지 않으면, 최종 PCR 증폭 각 유전자의 업스트림 및 다운 스트림 지역 및 항생제 유전자 카세트의 마지막 재조합 구성의 형성의 결과는 각각 어려울 것이라고.

변화의 세포 밀도 의존성은 같은 S. 많은 streptococci에 입증되었습니다 sanguinis 8, S. mutans 9 S. pneumoniae 10. S.의 경우 세포 밀도 sanguinis는 TH에서 (~ 5x10 6 CFU / ML에 해당) 0.07-0.08의 OD 660에 도달 + HS 매체, S.의 가장 높은 변환 효율을 선형 재조합 PCR의 amplicon이있는 sanguinis가 얻어와 S. 최대 20 %되었습니다 sanguinis 세포변형 될 수 있습니다. S.의 게놈 전체 유전자의 삭제 완료 후 sanguinis, 우리는 몇 가지 중요하지 않은 유전자의 삭제에 대한 transformants의 수는 (~ 10) 낮은 것으로 나타났습니다. 박테리아의 높은 변환 효율 게놈 전체 유전자 knockouts에 불필요한 유전자 삭제를 모두 수행하는 것이 중요하다는 것은 의심의 여지가 없습니다.

PCR에 의한 재조합 구조 생성을 제외하고, 단일 유전자 불 활성화를위한 다른 방법도 있습니다. 예를 들어, 자살 플라스미드 창조 된이 광범위하게 작은 규모의 박테리아 유전자를 비활성화 적용됩니다. 대규모 플라스미드 생성이 훨씬 시간이 오래 걸릴 힘드는이며, 일부 박테리아가 특정 자살 플라스미드 생성 할 필요가 있기 때문에,이 기술은 게놈 전체의 단일 유전자 불 활성화에 사용되지 않았습니다. 마커없는 유전자 삭제가 항생제 저항 유전자의 가능한 극성 효과를 방지 할 수 있지만, 기존의 마커없는 유전자 삭제 방법은 시간이 오래 사기꾼 더자살 플라스미드 방법보다 유전자를 비활성화 할 수 suming 및 어렵다. 대장균에서 게놈 전체의 마크 적은 유전자 삭제는 항생제 저항 유전자 후 저항 카세트 6 제거와 교체를 통해 얻을되었습니다. 그러나,이 E. 대장균의 변종은 파지 λ 레드 recombinase이 필요합니다. 유전자 삭제 변환하기 전에, 레드 헬퍼 플라스미드 pKD46는 E.에 소개가되어야 할 것입니다 대장균 11. 우리의 기술, 우리는 ORF, 유전자 삭제 지역의 표현 구조를 따라 극성을 피하기 위해 유전자 삭제 돌연변이의 대부분에 aphA-3 저항 유전자의 프로모터를 제거하고 aphA-3의 두 끝을 설계 저항 카세트의 효과에 문제가있을 수 있습니다. 최대 지금까지, 우리는이 기술을 이용하여 만든 여러 돌연변이의 기능을 검토 한 후 북극 효과 문제를 발견하지 않았습니다. S. 취득 필수 유전자의 게놈 전체와 맑은 세트 일을 사용하여 sanguinis기술 12 또한 시스템의 항생제 카세트의 극성 효과의 낮은 가능성을 암시하고 있습니다. 우리는 에리스로 마이신과 chloramphenicol 내성 유전자와 같은 다른 발기인없는 항생제 저항 유전자,이 기법 (데이터가 표시되지 않음)에 적용 할 수를 증명하고있다. 또한이 기술은 자살 플라스미드 및 복원 호스트가 필요하지 않습니다. 전반적으로,이 기술은 게놈 전체 유전자 삭제 구조를 생성하고 세균의 게놈 전체의 단일 유전자 돌연변이에 수행 할 수 쉬울 수 높은 처리량입니다.

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Disclosures

관심 없음 충돌이 선언 없습니다.

Acknowledgments

이 작품은 버지니아 커먼 웰스 대학의 대통령 연구 인센티브 프로그램 (PRIP) 144602-3 (PX)에 의해, 건강 (PX)의 국립 연구소에서 보조금 R01DE018138 의해 부분적으로 지원되었다. 우리는 Drs 감사드립니다. 레이 첸, 게놈 전체 돌연변이의 건설을 지원에 Yuetan쪽으로 앉아야하고 왕을 Xiaojing. 우리는 또한 DNA 배열을 위해 버지니아 커먼 웰스 대학에서 DNA 핵심 시설 감사드립니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Primer F2 Integrated DNA Technologies TGACTAACTAGGAGGAATAAATG
GCTAAAATGAGAATAT
Primer R2 ibid CATTATTCCCTCCAGGTACTAAAA
CAATTCATCCAGT
Primer F2p ibid GATAAACCCAGCGAACCATTTGA
Primer P1 ibid GCTTATATACCTTAGCAGGAGACA
Primer P2 ibid GTATGACATTGCCTTCTGCGTCC
Primer 5' end_R1_seq ibid GCCATTTATTCCTCCTAGTTAGTCA
Primer 5' end_F3_seq ibid GTTTTAGTACCTGGAGGGAATAATG
Primer 5' end_R1p_seq ibid CCTCAAATGGTTCGCTGGGTTTATC
CSP Synprep Sequence:NH2-DLRGVPNPWGWIFGR-COOH
DNA Polymerase Invitrogen 11304-102 Platinum Taq DNA Polymerase High Fidelity
EcoRI New England Biolabs Inc R0101S Restriction enzyme
Agar American Bioanalytical AB01185
Agarose Promega V3125
BHI BD Biosciences 237500 Brain Heart Infusion
Horse serum Fisher Scientific SH3007403 Horse serum
Km Fisher Scientific BP906-5 Kanamycin
TH broth BD Biosciences 249240 Todd Hewitt broth
PureLink 96 Invitrogen K310096 PureLink 96 PCR purification kit
QIAquick Qiagen 28106 QIAquick PCR purification kit
Filter Corning 431117 0.22 μm polystyrene filter
Anoxomat System Mart Microbiology b.v. Anoxomat Mark II
Benchtop centrifuge Thermo Scientific 75004377 Sorvall Legend RT Plus microplate rotor
Gel Documentation UVP LLC BioDoc-It 210
Incubator Fisher Scientific 11-690-625D Isotemp
Labnet's Gel XL Labnet E0160 Labnet's Gel XL
Microcentrifuge Eppendorf 22621408 Microcentrifuge 5415 R
Multichannel pipettes Thermo Scientfic 4661040, 4661020 Finnpipette F1
Thermal Cycler Applied Biosystems Inc. N805-0200 GeneAmp PCR system 9700

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sassetti, C. M., Boyd, D. H., Rubin, E. J. Genes required for mycobacterial growth defined by high density mutagenesis. Mol. Microbiol. 48, 77-84 (2003).
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유전학 문제 69 미생물학 분자 생물학 생명 공학 유전체학, 게놈 전체 유전자 삭제 유전자 고 처리량 PCR
게놈 전체 유전자 삭제할에<em&gt; 연쇄상 구균 sanguinis</em&gt; 높은 처리량 PCR에 의한
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Ge, X., Xu, P. Genome-wide GeneMore

Ge, X., Xu, P. Genome-wide Gene Deletions in Streptococcus sanguinis by High Throughput PCR. J. Vis. Exp. (69), e4356, doi:10.3791/4356 (2012).

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