Summary
Эффективное генома одного метода генной мутации была создана использования
Abstract
Транспозонов мутагенеза и одного гена удаления двух методов, применяемых в генома генов нокаутом в 1,2 бактерии. Хотя транспозона мутагенеза является менее трудоемким и менее дорогостоящими, и не требует завершить геноме информации, есть два слабых места в этом методе: (1) возможность разных мутантов в смешанном мутант библиотека, которая по борьбе с мутантами выбирает со снижением конкуренции; и (2) возможность частичной инактивации гена которой гены не полностью теряют свои функции после введения транспозона. Одного гена удаления анализа могут компенсировать недостатки, связанные с мутагенеза транспозонов. Для повышения эффективности генома одного делеции гена, мы пытаемся установить высокую пропускную техника для генома одного удаления гена с использованием Streptococcus sanguinis в качестве модельного организма. Каждый ген удаления построить в S. sanguinis генома предназначен для составляющих 1КБ вверх по течению от целевого гена, APHA-3 гена, кодирующего белок канамицину и 1-кб ниже целевого гена. Три комплекта F1/R1 грунтовки, F2/R2, и F3/R3, соответственно, разработан и синтезирован в 96-луночный планшет формата для ПЦР-амплификации из этих трех компонентов каждого удаления построить. Грунтовки R1 и F3 содержат 25-BP последовательности, которые являются дополнением к регионам APHA-3 гена в конце их 5. Крупномасштабных ПЦР-амплификации APHA-3 гена выполняется один раз для создания всех одно-генных конструкций удаления. Промоутер APHA-3 гена изначально исключены чтобы свести к минимуму потенциальные полярный эффект кассетного канамицин. Для создания конструкции гена удаления, высокой пропускной ПЦР-амплификации и очистки осуществляется в 96-луночный планшет формата. Линейные рекомбинантного ампликона ПЦР для каждого гена удаление будет составлен через четыре реакции ПЦР с использованием высококачественных ДНК-полимеразы. Первоначальный EXPONдифференциальной фазы роста S. sanguinis культивировали в Todd Hewitt бульоне с добавлением 2,5% инактивированной лошадиной сыворотки используется для повышения компетенции для преобразования ПЦР-рекомбинантной конструкции. При этом условии до 20% С. sanguinis клетки могут быть трансформированы ~ 50 нг ДНК. Основываясь на этом подходе, 2048 мутанты с одного гена удаления в конечном итоге были получены из 2270 генов S. sanguinis учета ORFs четыре гена, целиком в рамках других ORFs в S. sanguinis SK36 и 218 потенциальных существенных генов. Техника на создание конструкции ген удаления высокой пропускной способностью и может быть легко использовать в генома одного удаления гена для любого трансформируемые бактерий.
Protocol
1. Primer Design
- Грунтовки предназначены использования в доме сценарии основаны на S. sanguinis SK36 последовательность генома. Три набора праймеров, F1/R1, F2/R2, и F3/R3 предназначены для усиления 1-кб перед последовательностью гена-мишени, APHA-3 ген, кодирующий устойчивость к канамицину (Km г) белка 3 и 1 КБ вниз по течению последовательности гена-мишени, соответственно (рис. 1). Среди этих праймеров, F1 и R3 разработана с использованием ePrimer3 в EMBOSS набор программ ( http://emboss.sourceforge.net/apps/cvs/emboss/apps/index.html ) для усиления фланкирующие области выше или ниже целевого ген. Гена специфических праймеров, R1 и F3, разработаны основанные на 5 'и 3' последовательности гена-мишени. R1 и F3 праймеры содержат 25-BP адаптер последовательностей в конце их 5 ', которые являются дополнением к APHA-3ген. Температура плавления каждого праймера были разработаны, чтобы быть как можно ближе к 60 ° C, чтобы разрешить использование единой температуры отжига для всех ПЦР-реакции в 96-луночный.
- F1, R1, R3 F3 и праймеры синтезированы в 96-луночные планшеты на основе генного порядка. Каждая пластина содержит один вид грунтовки в том же порядке ген. Развести праймеров в 96-и рабочих грунтовки пластины до конечной концентрации 10 мкМ для ПЦР-амплификации помощью многоканальной пипетки.
2. Высокая пропускная способность ПЦР-амплификации и очистки
- Для высокой пропускной способностью усиливать 1-кб выше или ниже целевого С. sanguinis генов, собрать смесь ПЦР коктейлей на льду в 15-мл коническую трубку с 1640 мкл DDH 2 O, 250 мкл 10xHigh Fidelity PCR буфера, 200 мкл 10 мМ смеси дНТФ, 100 мкл 50 мМ MgSO 4, 100 мкл 10 нг / мкл С. sanguinis SK36 геномной ДНК и 10 мкл Taq ДНК Платиновый polymeрасе высокой точностью и передачи 23 мкл смеси в каждую лунку в 96-луночный ПЦР планшет помощью многоканальной пипетки. Передача 1 мкл каждого F1 и R1 (или F3 и R3) от 10 мкМ праймера рабочей пластины к пластине ПЦР с использованием многоканальной пипетки. Печать ПЦР планшет и выполнять усиления при 94 ° С в течение 1 мин, 30 циклов 94 ° C в течение 30 сек, 54 ° C в течение 30 сек и 68 ° C в течение 1,5 мин.
- Подготовьте 1% агарозном геле, содержащем бромистый этидий с 48 скважин установки загрузки многоканальной пипетки. Смешайте 4 мкл продукта ПЦР с 1 мкл буфера загрузки 5xDNA на 96-луночный планшет и загрузить образцы на агарозном геле с использованием 10-мкл многоканальной пипетки. Выполнить электрофорез при 135 В в течение 30 мин. Изучите полосы на геле в UVP документации и анализа системы.
- Очищают продуктов ПЦР по PureLink 96 ПЦР-комплект очистки с использованием центрифугирования в соответствии с инструкцией завода-изготовителя. Для элюирования ДНК, добавить 40 мкл стерильной DDH 2 O в яме бinding пластины.
- Случайно выбрать несколько очищенных ампликонов на пластине для изучения ДНК концентраций с использованием NanoDrop спектрофотометр. Отрегулируйте концентрацию ампликонов на тарелке ~ 10 нг / мкл.
- Плазмиды, содержащей Km г кассеты переваривается использованием EcoR я как шаблон ПЦР. Переваривается плазмиды очищают QIAquick набора для очистки ПЦР и линейной плазмидной ДНК доводят до конечной концентрации ДНК 10 нг / мкл. Соберите 25 мкл смеси для Km г кассеты ампликона, в том числе 16,4 мкл DDH 2 O, 2,5 мкл 10xHigh Fidelity PCR буфера, 2 мкл 10 мМ дНТФ смеси, 1 мкл 50 мМ Mg SO 4, 1 мкл 10 мкМ F2, 1 мкл 10 мкМ R2, 1 мкл линейной плазмидной ДНК и 0,1 мкл Taq Платиновый ДНК-полимераза с высокой точностью. Выполните ПЦР-амплификации при 94 ° С в течение 1 мин, 30 циклов 94 ° C в течение 30 сек, 55 ° C в течение 30 сек и 68 ° С в течение 1 мин. Изучить продукт ПЦР помощью гель-электрофореза в 1% агарозном. Pooла большую часть кассеты Km г ампликона из 10 отдельных ПЦР очищали с помощью набора для очистки QIAquick ПЦР. Отрегулируйте ампликона концентрации до 10 нг / мкл.
- Для получения окончательного линейного рекомбинантного ампликонов PCR, три ПЦР ампликонов сочетаются друг с 1 мкл (почти в равных молярных количествах) в одной ПЦР планшет также ПЦР шаблона. Другие компоненты ПЦР добавлены в том числе 14,4 мкл DDH 2 O, 2,5 мкл 10xHigh Fidelity PCR буфера, 2 мкл 10 мМ дНТФ смеси, 1 мкл 50 мМ Mg SO 4, 1 мкл 10 мкМ F1, 1 мкл 10 мкМ R3, 0,1 мкл Taq Платиновый ДНК-полимераза с высокой точностью. ПЦР-амплификации проводят при 94 ° С в течение 2 мин, 30 циклов при 94 ° C в течение 30 сек 55 ° C в течение 30 сек и 68 ° C в течение 3,5 мин, и, наконец, 68 ° C в течение 4 мин.
- Изучите ПЦР ампликонов на агарозном геле. Очищают и количественной ПЦР ампликонов как описано выше. Замораживание рекомбинированные ампликонов PCR при -20 ° C.
3. ComПодготовка компетентных клетках
- Тодд Хьюитт бульон готов, скорректированная рН до 7,6 с помощью 10 N NaOH, нагревают до кипения, а затем охлаждают до комнатной температуры и стерилизовать с использованием 0,22 мкм полистирола фильтр 4. Добавить 300 мкл инактивированной сыворотки лошади (конечная концентрация 2,5%) до 11,7 мл бульона Todd Hewitt в 15-мл коническую трубку составить TH + HS среды. Алиготе TH + HS среду в 2 мл и 10 мл в пробирки.
- Инокулировать 5 мкл на складе С. sanguinis SK36 замораживали при -80 ° C в 2 мл TH средний + HS и инкубировать в течение ночи с культурой укупорки плотно при 37 ° С, сопровождается предварительной инкубации 10 мл-TH + HS трубку.
- После ночи, трансфер 50 мкл культуры в 10 мл TH + HS и инкубировать в трубке при 37 ° C в течение 3 часов (соответствует OD 660 из 0,07-0,08), сразу же использовать для преобразования.
4. Трансформации клеток и Антибиотик выбора
- Добавить 2 мкл 70 нг С. sanguinis SK36 компетенцийществования стимулирующий пептид (CSP) и 2 мкл линейного рекомбинантного ПЦР ампликона (~ 50 нг), чтобы Эппендорфа на 96-луночный блок и предварительно нагреть их при температуре 37 ° C. Передача 330 мкл 3 час-инкубационных SK36 культуры в каждую пробирку. Инкубировать при 37 ° С в течение 1 часа. Заменить ДНК стерильной DDH 2 O в качестве контроля.
- Установите блок на льду и распространился 100 мкл каждого преобразования на мозг сердце инфузии (BHI) агар пластины с 500 мкг / мл канамицина. Инкубируйте пластины при температуре 37 ° C в течение 2 сут при микроаэробных условиях.
5. Мутант подтверждения и хранения
- Для каждой замены мутант, случайно подхватывать 2 отдельных колоний, привить колонии в 5 мл BHI, содержащий 500 мкг / мл канамицина и инкубировать посевной microaerobically течение ночи при 37 ° C. Криоконсервируют каждой культуре в 30% глицерине при -80 ° C
- Чтобы изучить вопрос о мутанта содержащий ген ожидается замена, выполнить ПЦР колоний для каждого мутанта с помощью F1 и R3праймеров в 96-луночный планшет ПЦР. О 1-мкл ночной культуры из отдельных колоний используют в качестве ДНК-матрицы в 25-мкл ПЦР-реакции амплификации. ПЦР проводят при 94 ° C в течение 5 мин, 35 циклов 94 ° C в течение 30 сек, 55 ° C в течение 30 сек и 68 ° C в течение 3,5 мин, и, наконец, 68 ° C в течение 4 мин.
- Чтобы точно определить двойной группой мутантов или загрязнения ампликона ПЦР, ПЦР изучить ампликона с помощью электрофореза в течение 4 часов на> 12 см длиной 2% агарозном геле с окрашиванием этидийбромидом. В соответствии с этим условием электрофореза в агарозном геле, любой ампликонов с разницей ≥ 100 б.п. были четко определены. Когда полосы в результате усиления кассеты г Km и дикий тип гена, как ожидается, отличаются <100 б.п., внутреннего праймера T1 используется для определения, является ли ген дикого типа могут быть обнаружены с помощью ПЦР.
- Для дальнейшего подтверждения удаления ампликонов очищают PureLink 96 набора для очистки ПЦР и секвенировали с использованием P1 праймер,связывается с кассетой г Км. Хранить только правильные мутантов подтвердить путем секвенирования.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
После ПЦР-амплификации с использованием праймеров F1 и R1, и F3 и R3, около 1-кб до и после каждого S. sanguinis генов были получены в 96-луночный, соответственно (рис. 2A). В наших условиях ПЦР и использовании предназначен грунтовки, конкретный продукт был амплифицирован из S. sanguinis геномной ДНК в каждой реакции ПЦР. Этот результат указывает на праймеров были весьма специфическими для целей S. sanguinis. С помощью ПЦР-амплификации повторно с использованием праймеров F1 и R3 и три ампликонов как ДНК-матриц, линейные рекомбинантной конструкции ПЦР (~ 3 кб) была высокой пропускной создан на 96-луночный планшет, состоящий из области вверх по течению от каждого гена-мишени, канамицин кассеты, и область ниже по течению каждого гена-мишени в таком порядке (рис. 2В). Рекомбинантные конструкции ПЦР затем превращается в S. sanguinis SK36 и выбрать канамицина на табличке агар BHI. Для большинства Трансформаторrmations, более 1000 колоний были получены на каждой пластине после микроаэробных 2 D-инкубации. Когда эти колонии были ПЦР-амплификации с использованием F1 и R3, одна полоса ДНК соответствует ожидаемому мутант размера (~ 3 кб) наблюдается помощью гель-электрофореза (рис. 2С). При попытке удаления потенциальных существенных генов, никаких колоний могут быть получены в большинстве преобразований. Для удаления некоторых важных генов, однако, по-прежнему колонии получили следующие преобразования. После ПЦР-амплификации этих колоний использованием F1/R3, две полосы, соответствующие ДНК ожидаемого размера мутанта и дикого размера типа появились как показал помощью гель-электрофореза (рис. 2С). Для некоторых мутантов, ожидаемый размер мутанта и дикого размера типа ПЦР ампликона были слишком близки должны быть разделены долго агарозном геле. В этом случае внутренняя T1 праймер был разработан основанный на дикий тип гена. ПЦР проводили с использованием внутреннего праймера T1F1-й грунтовки (рис. 2D). Дикого типа SK36 был использован в качестве положительного контроля деформаций для этого ПЦР. Если группа с ожидаемым размером амплифицировали из мутантов с использованием внутреннего праймера, ген был идентифицирован как важный ген (двойной мутант группы), так присутствии канамицина кассету в мутанта была подтверждена ранее секвенирования ДНК помощью P1 грунт. На основании этого протокола, мы в конечном счете собрано 2048 несущественные С. sanguinis геном мутантов учета этих четырех ORF, целиком содержится в другом ORF (табл. 1). Мы выявили 218 генов, которые имеют важное значение для С. sanguinis выживания в условиях эксперимента.
| Класс | Открытый рамки считывания (ORF) |
| Всего * генах | 2270 |
| Целевые гены | 2266 |
| Программа дополнительного (промотора APHA-3) | 1973 |
| Программа дополнительного (промоутер APHA-3) | 75 |
| Essential (не Трансформант) | 60 |
| Essential (двойной диапазон) | 158 |
* Четыре ORF, полностью содержится в других ОРС.
Таблица 1. С. sanguinis гена мутанта резюме.
Рисунок 1. Рекомбинантный ПЦР. Три набора праймеров (F1/R1, F2/R2 и F3/R3) предназначены для усиления перед последовательность генов лекарственной устойчивостью (Km г) и ниже по течению последовательности, соответственно. И 5 'концы R1 и F3 праймеры содержат последовательности сотрудничествеmplementary с кассеты устойчивых к антибиотикам генов. Окончательный рекомбинантный продукт ПЦР ДНК, содержащей антибиотик маркером выбора бокам с С. sanguinis геномной ДНК, полученные с использованием F1/R3. Рекомбинантной ДНК будут интегрированы в S. sanguinis генома через двойной перекрестный рекомбинации.
Рисунок 2. Представитель гель-электрофореза ПЦР ампликонов на агарозном. , 1-кб ПЦР ампликонов из выше или ниже целевого С. sanguinis генов. B, ПЦР рекомбинантных ДНК состоит из верхнего и нижнего течения целевого гена и промотора APHA-3. C, колония-ПЦР ампликонов из преобразования С. sanguinis с ПЦР рекомбинантной ДНК, двойной полосы на 4 пер, 10, 14, 15, 20 и 24. D, ПЦР-амплификации дикого типа и мутантных колоний с использованием праймеров F1/T1, M,мутант, W, дикого типа.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Чтобы свести к минимуму возможные полярные эффекты замены одного целевого гена с экзогенного гена антибиотиков на соседние гены, две шаги при начальном проектировании грунтовки. Для большинства удалены гены, праймеры R1 и F3 предназначены для удаления кодирующей области от 6 б.п. после стартового кодона на 30 б.п. до стоп-кодона. За последние 30 пар оснований сохранить для защиты потенциальных сайта связывания рибосом используется соседними по потоку генов. Сохранила области между двумя соседними генами распространяется на 100 б.п., когда они были расположены в противоположных направлениях и N-концах обоих белков близко друг к другу, чтобы предотвратить удаление потенциальных промотора. Промоутер APHA-3 гена исключен в рекомбинантной конструкции для удаления гена 5. Сайт связывания рибосом вводится в APHA-3 гена для перевода. Для проверки нашей стратегии, мы случайно построено 10, а затем 96 аллельных мутантов обмена. Мы Obtained 10 и 93 мутантов, соответственно, на пластинах канамицин выбора, предполагая, что промоутер менее APHA-3 гена была выражена также в большинстве случаев. Затем мы разработали и синтезировали грунт для промоутера менее APHA-3 гена для всех генов делеции в S. sanguinis генома. Тем не менее, мы нашли некоторые гены в S. sanguinis были низкими, выраженных или не выражены который, вероятно, влияют на экспрессию промотора APHA-3 гена и, следовательно, канамицин выбор. Чтобы решить эту проблему, промоутер APHA-3 гена из плазмиды вводили в кассете т км. Большая часть промоутер Km ампликона кассеты г был получен из 10 отдельных ПЦР с использованием праймеров F2p/R2. Кроме того, что новая R1 промоутер праймеры R1P были разработаны для дополнения с промоутером Km ампликона кассеты г, все остальные этапы строительства были такими же, как для промоутера менее строительства.
Для улучшения efficiencУ гомологичной рекомбинации, мы выбираем длинный (1 кб) фланкирующие последовательности вверх по течению и вниз по течению от S. sanguinis гена-мишени в принятии ген удаления конструкций. Фланкирующей последовательности размер был ограничен 1 кб на основе двух точек: (1) длина фрагмента ДНК (~ 3 кб) позволило готовые ПЦР-амплификации APHA-3 гена (~ 1 кб) плюс 2 кб фланкирующие последовательности использования высокой точности ДНК-полимеразы, и (2) возможность секвенирования фланговые регионов по методу секвенирования ABI с обоих концов (~ 1 кб). Большое количество трансформантов в большинстве S. делеции гена sanguinis указано 1 кб вверх и вниз последовательности, соответственно, было достаточно, чтобы нокаута генов-мишеней.
Для успешных подключение на входе и выходе гена-мишени с двух концов APHA-3 гена в ПЦР-амплификации рекомбинантной, грунтовки R1, F2, F3 и R2 будет добавлена в их 5 'концы дополнительные последовательности, которая является дополнением подключенийecting концу другой стороны во многих бактериальных генов удаления случаях 6,7. Предварительные исследования показали, что дополнительная последовательность может быть снижен до 25 б.п. для этого рекомбинантного протокол ПЦР. В этом протоколе, мы устранили дополнительных последовательностей праймеров F2 и R2 в APHA-3 гена и добавили 25-BP дополнительные последовательности 5'-конце R1 и F3 вверх по течению и вниз по течению С. sanguinis гена-мишени. Такая конструкция уменьшает длину и количество грунтовки и, следовательно, снизить стоимость и ПЦР раз повысить эффективность одного гена удаления. В нашей лаборатории этот проект также успешно продемонстрировано для удаления гена в других микробов, таких как стрептококками и пневмококк, и Porphyromonas gingivalis.
В этом протоколе, специфика ПЦР-праймеров является критической. Температура плавления праймеров была высокой (> 58 ° C), грунтовки размер был длинный (> 21 б.п.), и праймер бинахождении сайт был уникальным в геноме S. sanguinis. Эта конструкция производится один ген-специфических продуктов почти в каждом из наших ПЦР-амплификации. Один ген-специфического продукта ПЦР-амплификации имеет решающее значение для последнего ПЦР-амплификации. В противном случае, окончательное ПЦР-амплификации, что приводит к образованию конечного рекомбинантного состоит из верхнего и нижнего течения регионы каждого гена и кассеты антибиотикам генов, соответственно, будет трудно.
Cell-зависимость плотности преобразований была продемонстрирована во многих стрептококков, таких как S. sanguinis 8, С. мутанс 9 и С. пневмонии 10. Когда плотность клеток S. sanguinis достигли OD 660 от 0,07-0,08 (соответствует ~ 5x10 6 КОЕ / мл) в TH + HS среды, высокая эффективность преобразования С. sanguinis с линейным рекомбинантного ампликона ПЦР был получен и до 20% S. sanguinis клетокможет быть преобразован. После завершения генома ген делеции в S. sanguinis, мы обнаружили, что число трансформантов для удаления некоторых несущественных генов была низкой (~ 10). Существует никаких сомнений, что высокая эффективность трансформации бактерий важно выполнить все несущественные делеции гена генома нокаутом гена.
Кроме рекомбинантную конструкцию создании с помощью ПЦР, есть и другие методы для одного инактивации генов. Например, самоубийство плазмиды создания был широко применяется для инактивации бактериальных генов в небольших масштабах. Однако этот метод не использовался для генома одного инактивация гена, потому что крупномасштабные плазмиды создание гораздо трудоемкий и кропотливый, и некоторые бактерии должны быть созданы конкретные самоубийства плазмиды. Хотя маркер-менее гена удаление может избежать возможных полярных влияние ген устойчивости к антибиотику, традиционный маркер-менее гена метод удаления требует больше времени конСчитая и трудным для инактивации генов, чем самоубийство плазмиды метод. В кишечной палочки, генома знак менее делеции гена были получены в результате замены ген устойчивости к антибиотику, а затем ликвидация сопротивления кассеты 6. Однако, это E. Штамм требует фага λ Красной рекомбиназой. Перед удалением гена трансформации, Красный помощник плазмиды pKD46 должна быть введена в E. палочки 11. В нашей техники, мы устранили промоутер APHA-3 гена устойчивости в подавляющем большинстве генов-мутантов и удалил предназначен двух концах APHA-3 ORF следить за выражением структуры гена удаленные области, чтобы избежать полярных Эффект вопрос сопротивление кассеты. До сих пор мы не нашли полярный вопрос в силу после рассмотрения функции многих мутантов, созданных по этой технологии. Генома и ясный набор основных генов, приобретенных в S. sanguinis использованием йв технике 12 также подразумевает низкую вероятность полярного эффекта антибиотик кассету в системе. Мы продемонстрировали другим промоутером менее гены устойчивости к антибиотикам, таким как эритромицин и хлорамфеникол гены сопротивления, могут быть применены в этой технике (данные не показаны). Кроме того, этот метод не требует самоубийства плазмиды и реконструированных хозяина. В целом, эта техника является высокая пропускная способность для создания генома конструкции гена удаления и может быть легко выполнить в генома одной мутации гена бактерии.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана грантами R01DE018138 из Национального института здоровья (ПВ) и, частично, Virginia Commonwealth University президентской программы стимулирования исследований (Прип) 144602-3 (PX). Мы благодарим доктора. Лей Чен, Yuetan Доу и Xiaojing Ван для оказания помощи в строительстве генома широкий мутантов. Мы также благодарим фонд ДНК ядра в Virginia Commonwealth University для секвенирования ДНК.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Primer F2 | Integrated DNA Technologies | TGACTAACTAGGAGGAATAAATG GCTAAAATGAGAATAT |
|
| Primer R2 | ibid | CATTATTCCCTCCAGGTACTAAAA CAATTCATCCAGT |
|
| Primer F2p | ibid | GATAAACCCAGCGAACCATTTGA | |
| Primer P1 | ibid | GCTTATATACCTTAGCAGGAGACA | |
| Primer P2 | ibid | GTATGACATTGCCTTCTGCGTCC | |
| Primer 5' end_R1_seq | ibid | GCCATTTATTCCTCCTAGTTAGTCA | |
| Primer 5' end_F3_seq | ibid | GTTTTAGTACCTGGAGGGAATAATG | |
| Primer 5' end_R1p_seq | ibid | CCTCAAATGGTTCGCTGGGTTTATC | |
| CSP | Synprep | Sequence:NH2-DLRGVPNPWGWIFGR-COOH | |
| DNA Polymerase | Invitrogen | 11304-102 | Platinum Taq DNA Polymerase High Fidelity |
| EcoRI | New England Biolabs Inc | R0101S | Restriction enzyme |
| Agar | American Bioanalytical | AB01185 | |
| Agarose | Promega | V3125 | |
| BHI | BD Biosciences | 237500 | Brain Heart Infusion |
| Horse serum | Fisher Scientific | SH3007403 | Horse serum |
| Km | Fisher Scientific | BP906-5 | Kanamycin |
| TH broth | BD Biosciences | 249240 | Todd Hewitt broth |
| PureLink 96 | Invitrogen | K310096 | PureLink 96 PCR purification kit |
| QIAquick | Qiagen | 28106 | QIAquick PCR purification kit |
| Filter | Corning | 431117 | 0.22 μm polystyrene filter |
| Anoxomat System | Mart Microbiology b.v. | Anoxomat Mark II | |
| Benchtop centrifuge | Thermo Scientific | 75004377 | Sorvall Legend RT Plus microplate rotor |
| Gel Documentation | UVP LLC | BioDoc-It 210 | |
| Incubator | Fisher Scientific | 11-690-625D | Isotemp |
| Labnet's Gel XL | Labnet | E0160 | Labnet's Gel XL |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 22621408 | Microcentrifuge 5415 R |
| Multichannel pipettes | Thermo Scientfic | 4661040, 4661020 | Finnpipette F1 |
| Thermal Cycler | Applied Biosystems Inc. | N805-0200 | GeneAmp PCR system 9700 |
References
- Sassetti, C. M., Boyd, D. H., Rubin, E. J. Genes required for mycobacterial growth defined by high density mutagenesis. Mol. Microbiol. 48, 77-84 (2003).
- Kobayashi, K., et al. Essential Bacillus subtilis genes. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 4678-4683 (2003).
- Trieu-Cuot, P., Courvalin, P. Nucleotide sequence of the Streptococcus faecalis plasmid gene encoding the 3'5"-aminoglycoside phosphotransferase type III. Gene. 23, 331-341 (1983).
- Paik, S., et al. Identification of virulence determinants for endocarditis in Streptococcus sanguinis by signature-tagged mutagenesis. Infect. Immun. 73, 6064-6074 (2005).
- Lukomski, S., et al. Nonpolar inactivation of the hypervariable streptococcal inhibitor of complement gene (sic) in serotype M1 Streptococcus pyogenes significantly decreases mouse mucosal colonization. Infect. Immun. 68, 535-542 (2000).
- Baba, T., et al. Construction of Escherichia coli K-12 in-frame, single-gene knockout mutants: the Keio collection. Mol. Syst. Biol. 2, (2006).
- de Berardinis, V. A complete collection of single-gene deletion mutants of Acinetobacter baylyi ADP1. Mol. Syst. Biol. 4, 174 (2008).
- Rodriguez, A. M., et al. Physiological and molecular characterization of genetic competence in Streptococcus sanguinis. Mol. Oral. Microbiol. 26, 99-116 (2011).
- Perry, D., Kuramitsu, H. K. Genetic transformation of Streptococcus mutans Infect. Immun. 32, 1295-1297 (1981).
- Pakula, R., Walczak, W. On the nature of competence of transformable streptococci. J. Gen. Microbiol. 31, 125-133 (1963).
- Datsenko, K. A., Wanner, B. L. One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 6640-6645 (2000).
- Xu, P., et al. Genome-wide essential gene identification in Streptococcus sanguinis. Sci. Rep. 1, (2011).
