Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

Genomweiten Gen-Deletionen in Published: November 23, 2012 doi: 10.3791/4356

Summary

Eine effiziente genomweiten Gen-Mutation Methode ermittelt worden

Abstract

Transposon-Mutagenese-und Single-Gen-Deletion gibt zwei Methoden in genomweiten Gen-Knockout in Bakterien 1,2 angewendet. Obwohl Transposon-Mutagenese ist weniger zeitaufwendig, weniger kostspielig und erfordert keine abgeschlossene Genom Informationen gibt es zwei Schwachstellen in diesem Verfahren: (1) die Möglichkeit einer unterschiedlichen Mutanten in der gemischten Mutantenbibliothek daß der Zähler-wählt Mutanten mit verminderter Wettbewerb; und (2) die Möglichkeit eines teilweisen Geninaktivierung wobei Gene nicht vollständig verlieren ihre Funktion nach dem Einsetzen eines Transposons. Single-Gen-Deletion Analyse kann für die Nachteile, die mit der Transposon-Mutagenese zu kompensieren. Um die Effizienz der genomweiten einzigen Gen-Deletion zu verbessern, versuchen wir, einen hohen Durchsatz Technik für genomweite einzigen Gen-Deletion mit Streptococcus sanguinis als Modellorganismus zu etablieren. Jedes Gendeletion in S. konstruieren sanguinis Genom soll 1 umfassen-Kb stromaufwärts des Zielgens, das aphA-3-Gen, kodierend Kanamycinresistenz Protein und 1-kb stromabwärts des Zielgens. Drei Sätze von Primern F1/R1, F2/R2 und F3/R3 sind jeweils entworfen und synthetisiert in einer 96-Well-Platte Format für PCR-Amplifikationen von diesen drei Komponenten jedes Deletion konstruieren. Primer R1 und F3 enthalten 25-bp-Sequenzen, die komplementär zu Regionen der aphA-3-Gen an ihrem 5'-Ende sind. Eine große Skala PCR-Amplifikation des aphA-3-Gen wird einmal für die Erstellung aller Single-Gendeletion Konstrukte durchgeführt. Der Promotor aphA-3-Gen wird zunächst ausgeschlossen, um das Potenzial polaren Effekt Kanamycinkassette minimieren. Um die Gendeletion Konstrukte zu erzeugen, werden Hochdurchsatz-PCR-Amplifikation und Reinigung in einem 96-Well-Platten-Format durchgeführt wird. Eine lineare rekombinante PCR Amplikon für jedes Gen Löschung wird nach oben durch vier PCR-Reaktionen mit High-Fidelity DNA-Polymerase erfolgen. Die anfängliche exponential Wachstumsphase S. sanguinis in Todd-Hewitt-Brühe kultiviert, ergänzt mit 2,5% inaktiviertem Pferdeserum wird verwendet, um die Zuständigkeit für die Transformation von PCR-rekombinante Konstrukte zu erhöhen. Unter dieser Bedingung bis zu 20% von S. sanguinis transformierten Zellen können unter Verwendung ~ 50 ng der DNA werden. Basierend auf diesem Ansatz wurden 2.048 Mutanten mit Single-Gen-Deletion letztendlich von den 2.270 Gene in S. erhalten sanguinis außer vier Gen-ORFs, die vollständig innerhalb anderen ORFs in S. sanguinis SK36 und 218 potentielle essentiellen Gene. Die Technik zur Erstellung von Gen-Deletion Konstrukte ist mit hohem Durchsatz und könnte leicht in genomweiten Gen Löschungen für alle transformable Bakterien verwenden.

Protocol

Ein. Primer Design

  1. Grundierungen werden unter Verwendung im Haus der Script basiert auf der S. sanguinis SK36 Genomsequenz. Drei Sätze von Primern, F1/R1, F2/R2 und F3/R3 sind zur Amplifikation des 1-kb stromaufwärts Sequenz des Ziel-Gens, das aphA-3 kodierenden Gens Kanamycinresistenz (Km r) Protein 3 und der 1 ausgelegt -kb stromabwärts Sequenz des Zielgens, bzw. (Abbildung 1). Unter dieser Primer sind F1 und R3 entwickelt mit ePrimer3 im EMBOSS Suite von Programmen ( http://emboss.sourceforge.net/apps/cvs/emboss/apps/index.html ) an flankierenden Regionen stromaufwärts oder stromabwärts zu verstärken des Ziels Gen. Genspezifischen Primern, R1 und F3, werden basierend auf der 5 'und 3'-Sequenzen des Zielgens gestalten. R1 und F3 Primer enthalten 25-bp-Adapter-Sequenzen an ihrem 5'-Ende, die komplementär zu dem aphA-3 sindGen. Die Schmelztemperaturen von jedem Primer wurden entwickelt, um so nah wie möglich auf 60 ° C um die Verwendung eines einheitlichen Glühtemperatur für alle PCR-Reaktionen in 96-Well-Format zu ermöglichen.
  2. F1, R1, R3 und F3 Primer werden in 96-Well-Platten auf ein Gen Reihenfolge basierend synthetisiert. Jede Platte enthält eine Art von Primer im gleichen Gen sortiert. Verdünnt den Primer in 96-Well-Platte arbeitet Primer zu einer Endkonzentration von 10 uM zur PCR-Amplifikation unter Verwendung einer Mehrkanalpipette.

2. High-throughput PCR-Amplifikation und Reinigung

  1. Mit hohem Durchsatz amplifizieren 1-kb stromaufwärts oder stromabwärts des Ziels S. sanguinis Gene, montieren ein PCR-Cocktail Mischung auf Eis in einem 15-ml konischen Röhrchen mit 1640 ul ddH 2 O, 250 ul 10xHigh Fidelity PCR Buffer, 200 ul 10 mM dNTP-Gemisch, 100 ul 50 mM MgSO 4, 100 ul 10 ng / ul S. sanguinis SK36 genomische DNA und 10 ul Platinum Taq DNA polymerase High Fidelity und Transfer 23 ul des Gemisches in jedes Well auf 96-well PCR-Platte mit einer Mehrkanalpipette. Übertragen 1 ul jeder F1 und R1 (oder F3 und R3) aus den 10 uM arbeiten Primer Platten der PCR-Platte mit Mehrkanalpipette. Abzudichten und die PCR-Platte durchzuführen Amplifikation bei 94 ° C für 1 min und 30 Zyklen von 94 ° C für 30 sec, 54 ° C für 30 sec und 68 ° C für 1,5 min.
  2. Bereiten 1% Agarosegel mit Ethidiumbromid mit 48 Kavitäten Montage Mehrkanalpipette loading. Mix 4 ul PCR-Produkt mit 1 ul 5xDNA Ladepuffer auf 96-Well-Platte und laden Sie die Proben auf Agarosegel unter Verwendung eines 10-ul Mehrkanalpipette. Führen Elektrophorese bei 135 V für 30 min. Untersuchen Sie das Band auf Gel unter UVP Dokumentation und Analyse-System.
  3. Reinigen die PCR-Produkte durch PureLink 96 PCR Purification Kit unter Verwendung von Zentrifugation nach der Anleitung des Herstellers. Zum Eluieren DNA, fügen Sie 40 ul sterilem ddH 2 O zum Wohl des binding Platte.
  4. Zufallsprinzip auswählen mehreren gereinigten Amplifikate auf der Platte, um die DNA-Konzentrationen mit NanoDrop Spektralphotometer prüfen. Die Konzentration der Amplikons auf Platte zu ~ 10 ng / ul.
  5. Ein Plasmid enthaltenden Km r Kassette mit EcoR I verdaut als PCR-Template. Die verdaute Plasmid wird durch QIAquick PCR Purification Kit gereinigt und das lineare Plasmid-DNA wird auf DNA-Endkonzentration 10 ng / ul eingestellt. Montieren Sie 25 ul Mischung Kilometer r Kassette Amplikon einschließlich 16,4 ul ddH 2 O, 2,5 ul 10xHigh Fidelity PCR Buffer, 2 ul 10 mM dNTP-Gemisch, 1 ul 50 mM Mg SO 4, 1 ul 10 uM F2, 1 ul 10 uM R2, 1 ul lineare Plasmid-DNA und 0,1 ul Platinum Taq DNA Polymerase High Fidelity. Eine PCR-Amplifikation bei 94 ° C für 1 min und 30 Zyklen von 94 ° C für 30 sec, 55 ° C für 30 sec und 68 ° C für 1 min. Untersuchen des PCR-Produkts durch Gelelektrophorese an 1% Agarose. Poola Großteil des Km r Kassette Amplikon aus 10 einzelnen PCR gereinigte von QIAquick-PCR. Passen Sie die Amplikon-Konzentration auf 10 ng / ul.
  6. Um die endgültige lineare rekombinante PCR Amplikon erhalten, werden drei PCR Amplikons mit je 1 ul (in fast gleich-molaren Mengen) in ein PCR-Platte sowie die PCR-Vorlage kombiniert. Andere PCR-Komponenten, einschließlich 14,4 ul ddH 2 O, 2,5 ul 10xHigh Fidelity PCR Buffer, 2 ul 10 mM dNTP-Gemisch, 1 ul 50 mM Mg SO 4, 1 ul 10 uM F1, 1 ul 10 uM R3, 0,1 ul Platinum Taq DNA Polymerase High Fidelity. PCR-Amplifikation bei 94 ° C für 2 min, 30 Zyklen von 94 ° C für 30 sec 55 ° C durchgeführt für 30 sec und 68 ° C für 3,5 min und schließlich 68 ° C für 4 min.
  7. Untersuchen Sie die PCR Amplifikate im Agarosegel. Läutern und Quantifizierung der PCR-Amplikons wie oben beschrieben. Einfrieren der rekombinierten PCR Amplikons bei -20 ° C.

3. Comzuständigen Cells Vorbereitung

  1. Todd-Hewitt-Bouillon hergestellt wird, auf 7,6 eingestellten pH-Wert mit 10 N NaOH, erhitzt zum Sieden und kühlt dann auf Raumtemperatur und sterilisiert unter Verwendung 0,22 um Polystyrol-Filter 4. Fügen Sie 300 ul hitzeinaktiviertem Pferdeseren (Endkonzentration 2,5%) auf 11,7 ml Todd Hewitt Broth in 15-ml konischen Röhrchen, um Make-up TH + HS Medium. Aliquot TH + HS Medium in 2 ml und 10 ml in Tuben.
  2. Beimpfen 5 ul Lager S. sanguinis SK36 bei -80 ° C in 2 ml TH + HS Medium eingefroren und inkubiere die Kultur über Nacht mit Capping fest bei 37 ° C, durch Vorinkubieren der 10 ml-TH + HS Rohr begleitet.
  3. Nachdem über Nacht übertragen 50 ul Kultur in 10 ml TH + HS und inkubieren des Rohres bei 37 ° C für 3 Stunden (entspricht OD 660 von 0,07 bis 0,08), sofort mit der Transformation.

4. Zelltransformation und Antibiotika-Selektion

  1. Add 2 ul 70 ng S. sanguinis SK36 Kompetenztenz stimulierende Peptid (CSP) und 2 ul linearen rekombinanten PCR Amplikon (~ 50 ng) in Eppendorf-Röhrchen auf 96-Well-Block und Pre-warm sie bei 37 ° C. Übertragen 330 ul 3 hr-inkubierten SK36 Kultur in jedes Röhrchen. Bei 37 ° C für 1 Stunde. Ersetzen DNA mit sterilem ddH 2 O als Kontrolle.
  2. Legen Sie den Block auf Eis und verteilt 100 ul jeder Transformation auf Hirn-Herz-Infusion (BHI)-Agar-Platte mit 500 ug / ml Kanamycin. Die Inkubation erfolgt bei 37 ° C für 2 d unter mikroaeroben Bedingungen.

5. Mutant Bestätigung und Lagerung

  1. Für jeden Ersatz Mutante, zufällig abholen 2 einzelnen Kolonien, impfen die Kolonie in 5 ml BHI mit 500 ug / ml Kanamycin und inkubieren das Inokulum mikroaerob über Nacht bei 37 ° C. Kryokonservierung jede Kultur in 30% Glycerin bei -80 ° C
  2. Um zu untersuchen, ob die Mutante, die die erwartete Gen-Ersatz, führen Kolonie-PCR für jede Mutante mit F1 und R3Primer in 96-well PCR-Platte. Etwa 1 ul-Übernachtkultur von einzelnen Kolonie wird als DNA-Matrize in 25 ul-PCR-Amplifikationsreaktion verwendet. PCR wird bei 94 ° C für 5 min, 35 Zyklen von 94 ° C für 30 sec, 55 ° C für 30 Sekunden durchgeführt und 68 ° C für 3,5 min und schließlich 68 ° C für 4 min.
  3. Zur genauen Bestimmung Doppelbandpresse Mutanten oder Verunreinigung PCR Amplikon, prüft die PCR-Amplicon durch Elektrophorese für 4 h auf> 12 cm lang 2% Agarosegel mit Ethidiumbromid. Unter diesem Agarosegelelektrophorese Zustand, wurden alle Amplikons mit ≥ 100 bp Unterschied eindeutig identifiziert. Wenn Bands aus Amplifikation der Km r Kassette und dem Wildtyp-Gen werden voraussichtlich durch <100 bp, ein interner T1 Primer verwendet, um festzustellen, ob eine Wildtyp-Gens durch PCR nachgewiesen werden kann unterschiedlich sein.
  4. Zur weiteren bestätigen Sie den Löschvorgang werden die Fragmente durch PureLink 96 PCR Purification Kit gereinigt und sequenziert mit dem P1-Primer,bindet an das Km r Kassette. Halten einzig richtige Mutanten durch Sequenzierung bestätigt.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Nach der PCR-Amplifikation unter Verwendung der Primer und R1 F1 und F3 und R3, etwa 1-kb stromaufwärts und stromabwärts jeder S. sanguinis Gen wurden in 96-Well-Format bzw. (2A) erhalten. Unter unserer PCR-Bedingungen und mit entworfenen Primern wurde ein bestimmtes Produkt aus S. verstärkt sanguinis genomischen DNA in jeder PCR-Reaktion. Dieses Ergebnis zeigt die Primer waren sehr spezifisch für die Ziele der S. sanguinis. Durch PCR-Amplifikation mit erneute Primer F1 und R3 und drei Amplikons als DNA-Template, linearen rekombinanten PCR-Konstrukte (~ 3 kb) wurden mit hohem Durchsatz auf 96-Well-Platte, aus einem Bereich vor dem jedem Zielgen, ein Kanamycin zusammengesetzt geschaffen Kassette, und einen Bereich stromabwärts von jedem Zielgen, in dieser Reihenfolge (2B). Die rekombinanten PCR-Konstrukte wurden dann in S. verwandelt sanguinis SK36 und ausgewählt von Kanamycin auf BHI-Agar-Platte. Für die Mehrheit der Traformations, wurden 1000 Kolonien auf jeder Platte nach einem mikroaeroben 2 d-Inkubation erhalten. Wenn diese Kolonien waren PCR-amplifiziert, wobei F1 und R3, eine einzige DNA-Bande, entsprechend der erwarteten Größe Mutante (~ 3 kb) wurde durch Gelelektrophorese (2C) beobachtet. Beim Versuch, den potentiellen essentielle Gene zu löschen, konnte keine Kolonien in der Mehrzahl der Transformationen erhalten werden. Zum Löschen einiger essentiellen Gene wurden jedoch Kolonien noch folgende Transformation erhalten. Nach PCR-Amplifikation dieser Kolonien mit F1/R3 erschienen zwei DNA-Banden entsprechend der erwarteten mutierten Größe und der Wildtyp Größe wie durch Gelelektrophorese (2C) ergab. Für einige Mutanten wurden die erwarteten mutierten Größe und der Wildtyp Größe PCR Amplikon zu nahe an durch lange Agarosegel getrennt werden. In diesem Fall wurde ein interner Primer T1 basierend auf dem Wildtyp-Gensequenz gestalten. PCR wurde unter Verwendung des internen T1 Primer einend F1 Primer (Abb. 2D). Das Wildtyp-SK36 wurde als positive Kontrolle für dieses PCR verwendet. Wenn eine Bande mit der erwarteten Größe von der Mutante mit der internen Primer amplifiziert wurde, wurde das Gen als essentielles Gen (Doppelbandpresse Mutante), da die Gegenwart von Kanamycin-Kassette in der Mutante identifiziert wurde zuvor durch DNA-Sequenzierung unter Verwendung des Primers P1 bestätigt. Basierend auf diesem Protokoll haben wir schließlich gesammelt 2048 nicht wesentlicher S. sanguinis-Gen-Mutanten ohne diese vier ORFs vollständig innerhalb anderen ORFs (Tabelle 1) enthalten. Wir identifizierten 218 Gene, die wesentlich sind für S. sanguinis Überleben unter den experimentellen Bedingungen.

Klasse Open-Leserahmen (ORF)
Insgesamt Gene * 2270
Gezielte Genen 2266
Nichtessentiellen (promotorloses aphA-3) 1973
Nichtessentielle (Promotor aphA-3) 75
Essential (nicht Transformante) 60
Essential (Doppel-band) 158

* Vier ORFs vollständig innerhalb anderen ORFs enthalten.

Tabelle 1. S. sanguinis Gen Mutante Zusammenfassung.

Abbildung 1
Abbildung 1. Rekombinante PCR. Drei Sätze von Primern (F1/R1, F2/R2 und F3/R3) ausgelegt sind, um die stromaufwärts gelegene Sequenz ein Arzneimittel-Resistenz-Gen (Km r) und die stromabwärtige Sequenz, die jeweils zu amplifizieren. Sowohl 5'-Enden von R1 und F3 Primer enthalten Sequenzen complementary mit der Kassette aus einem Antibiotikum resistentes Gen. Eine endgültige PCR rekombinanten DNA-Produkt, die das Antibiotikum Selektionsmarker flankiert mit S. sanguinis genomische DNA wird unter Verwendung F1/R3. Die rekombinante DNA wird in S. integrieren sanguinis Genom über Doppel-Cross-over-Rekombination.

Abbildung 2
Abbildung 2. Vertreter Gelelektrophorese von PCR-Amplikons auf Agarose. A, 1-kb-PCR-Amplikons von stromaufwärts oder stromabwärts des Ziels S. sanguinis Gene. B, die PCR rekombinanten DNAs von stromauf und stromab der Zielgene und promotorloses aphA-3 zusammengesetzt. C, Kolonie-PCR-Amplikons aus der Transformation von S. sanguinis mit PCR rekombinanten DNAs, Doppel-Banden bei Spur 4, 10, 14, 15, 20 und 24 Jahren. D, PCR-Amplifikation von Wildtyp und Mutante Kolonien unter Verwendung von Primern F1/T1; M,Mutante; W, Wildtyp.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Um die möglichen polaren Effekte der Ersatz eines Zielgens mit exogenen Antibiotika-Gen auf benachbarten Genen zu minimieren, sind zwei Schritte gemacht, während erste Primer entwerfen. Für die meisten der Gene gelöscht werden der Primer R1 und F3 entworfen, um die codierende Region von 6 bp nach dem Startcodon und 30 bp vor dem Stopcodon löschen. Die letzten 30 Basenpaare zurückgehalten werden, um potenzielle ribosomale Bindungsstelle durch das benachbarte, nachgeschaltete Gen verwendet schützen. Das verbliebene Bereich zwischen zwei benachbarten Genen ist auf 100 bp verlängert, wenn sie in entgegengesetzten Orientierungen angeordnet sind, und die N-Termini der beiden Proteine ​​ist nahe zueinander zu verhindern Löschen eines potentiellen Promotor-Region. Der Promotor des aphA-3-Gen in dem rekombinanten Konstrukt für Gendeletion 5 ausgeschlossen. Ein Ribosomenbindungsstelle in den aphA-3-Gen für die Translation eingeführt. Um unsere Strategie testen, haben wir zufällig 10 gebaut und dann 96 allelischen Austausch Mutanten. Wir obtained 10 und 93 Mutanten, die jeweils auf Kanamycin Selektionsplatten, was darauf hindeutet, dass die Promotor-losen aphA-3-Gen auch in den meisten Fällen wurde ausgedrückt. Wir haben dann entwickelt und synthetisiert die Primer für Promotor-losen aphA-3-Gen für alle Gendeletionen im S. sanguinis Genoms. Allerdings fanden wir einige Gene in S. sanguinis wurden geringe oder überhaupt nicht exprimiert, welche wahrscheinlich auf die Expression des promotorlosen aphA-3-Gen und damit die Kanamycin-Selektion. Um dieses Problem der Promotor des aphA-3-Gen aus dem Plasmid wurde in die Lösung Km r Kassette eingeführt. Ein Großteil des Promotors Kilometer r Kassette Amplikon wurde von 10 einzelnen PCR unter Verwendung Primer F2p/R2. Außer daß R1 neue Promotor-Primer R1p für Komplement mit dem Promotor Km r Kassette Amplikon entworfen wurden, waren alle anderen Bauteile Schritte die gleichen wie für Promotor-Bauweise.

Um die efficienc verbesserny der homologen Rekombination, wählen wir lang (1 kb) flankierenden Sequenzen stromaufwärts und stromabwärts des S. sanguinis Zielgen zu machen Gen-Deletion Konstrukte. Die flankierende Sequenz Größe wurde auf 1 kb auf der Basis von zwei Punkten beschränkt: (1) die DNA-Fragment-Längen (~ 3 kb) erlaubt bereit PCR-Amplifikation des aphA-3-Gen (~ 1 kb) plus 2 kb der flankierenden Sequenzen mit High-Fidelity-DNA-Polymerase, und (2) die Durchführbarkeit des Sequenzierens flankierenden Regionen von ABI Sequenzierungsverfahren von beiden Enden (~ 1 kb). Hohe Zahlen der Transformanten, in den meisten S. sanguinis Gendeletionen angegeben 1 kb stromaufwärts und stromabwärts gelegenen Sequenzen bzw. waren genug, um knockout die Zielgene.

Um erfolgreiche verbinden stromaufwärts und stromabwärts des Zielgens mit den beiden Enden des aphA-3-Gens in rekombinante PCR-Amplifikation Primer R1, F2, F3 R2 und wird an ihren 5'-Enden hinzugefügt werden eine zusätzliche Sequenz, die komplementär ist mit der CONNRNSEHGERÄ Ende der anderen Seite in viele bakterielle Gendeletion Fällen 6,7. Vorläufige Studien zeigten, dass die zusätzliche Sequenz 25 bp für dieses rekombinante PCR-Protokoll reduziert werden konnte. In diesem Protokoll eliminiert man die zusätzlichen Sequenzen der Primer F2 und R2 in aphA-3 Gen und 25-bp zugegeben zusätzlichen Sequenz an das 5'-Ende R1 und F3 in stromaufwärts und stromabwärts des S. sanguinis Zielgens. Diese Konstruktion verringert die Länge und Höhe der Primer und damit die Kosten und die PCR-mal um die Effizienz der Ein-Gendeletion verbessern. In unserem Labor hat dieses Design auch erfolgreich für die Gen-Deletionen in andere Mikroben wie Streptococcus mutans und Streptococcus pneumoniae und Porphyromonas gingivalis demonstriert.

In diesem Protokoll ist die Spezifität von PCR-Primern kritisch. Der Primer Schmelztemperatur war hoch (> 58 ° C) war die Primer Größe lange (> 21 bp), und der Primer binden Ort war einzigartig im Genom von S. sanguinis. Dieses Design produziert einzelnes Gen-spezifische Produkte in nahezu jedem unserer PCR-Amplifikationen. Ein einzelnes Gen-spezifische PCR-Amplifikation von Produkt ist kritisch für den letzten PCR-Amplifikation. Andernfalls wird das endgültige PCR-Amplifikation, dass zur Bildung des endgültigen rekombinanten zusammengesetzt aus einzelnen Gens stromaufwärts und stromabwärts Regionen und Antibiotikum Genkassette bzw. schwierig wäre.

Zelldichte Abhängigkeit der Transformation in vielen Streptokokken wie S. nachgewiesen sanguinis 8, S. mutans und S. 9 pneumoniae 10. Wenn Zelldichte von S. sanguinis eine OD 660 von 0,07 bis 0,08 (entsprechend ~ 5x10 6 CFU / ml) in TH + HS Medium, dem höchsten Transformationseffizienz von S. sanguinis mit einem linearen rekombinanten PCR Amplikon wurde gewonnen und bis zu 20% von S. sanguinis Zellenübernommen werden könnten. Nach Abschluss der genomweiten Gen-Deletionen in S. sanguinis, fanden wir, dass die Anzahl der Transformanten zum Löschen einiger Gene essentielle niedrig war (~ 10). Es besteht kein Zweifel, dass eine hohe Transformationseffizienz von Bakterien wichtig, alle essentiellen Gen-Deletionen in den genomweiten Gen-Knockouts zu erfüllen.

Außer für rekombinantes Konstrukt Erstellung durch PCR, gibt es auch andere Verfahren zur Gen-Inaktivierung. Beispielsweise Selbstmord Plasmid Erstellung wurde ausgiebig gilt für bakterielle Gene in kleinem Maßstab zu inaktivieren. Allerdings hat diese Technik nicht für genomweite einzelnes Gen-Inaktivierung verwendet wurden, weil großflächige Plasmid Erstellung wesentlich zeitaufwendig und umständlich, und einige Bakterien müssen geschaffen spezifischen Selbstmord Plasmid werden. Obwohl marker-weniger Gendeletion die mögliche polare Wirkung der Antibiotika-Resistenz-Gen zu vermeiden kann, ist traditionell marker-weniger Gendeletion Verfahren mehr Zeit-conSuming und schwierig, ein Gen als der Selbstmord Plasmid-Methode zu inaktivieren. In Escherichia coli haben genomweite Aufschlags weniger Gendeletionen durch Ersatz mit Antibiotikaresistenzgen und dann Eliminierung der Resistenzkassette 6 erhalten worden ist. Doch diese E. coli Stamm erfordert den Phagen λ Red Rekombinase. Vor-Gen-Deletion Transformation, sollte die Red Helferplasmids pKD46 in E. eingeführt werden coli 11. In unserer Technik eliminiert man den Promotor des aphA-3-Resistenzgen in der überwiegenden Mehrheit der Gen-deletierten Mutanten und gestalten die zwei Enden des aphA-3 ORF, um die Expression des Gens-deletierten Region folgen, um die polare vermeiden Wirkung Ausgabe des Resistenz-Kassette. Bis jetzt haben wir noch nicht die polaren Effekt Problem nach Prüfung der Funktion von vielen Mutanten mit dieser Technologie erstellt worden ist. Ein Genom-weite und klare essentielle Gene in S. erworbenen sanguinis mit thTechnik 12 wird, bringen auch geringe Möglichkeit des polaren Wirkung von Antibiotika Kassette in dem System. Wir haben andere Promotor-losen Antibiotikaresistenzgenen, wie Erythromycin und Chloramphenicol Resistenzgene, könnte in dieser Technik (Daten nicht gezeigt) aufgebracht werden nachgewiesen. Darüber hinaus hat diese Technik nicht nötig Selbstmord Plasmid und rekonstruierten Host. Insgesamt ist dieses Verfahren mit hohem Durchsatz zur genomweiten Gendeletion Konstrukten zu schaffen und könnte leicht in genomweiten einzigen Genmutation eines Bakteriums durchzuführen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Acknowledgments

Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse R01DE018138 von den National Institutes of Health (PX) und zum Teil unterstützt durch Virginia Commonwealth University Presidential Forschung Incentive Program (PRIP) 144602-3 (PX). Wir danken Drs. Lei Chen, Yuetan Dou und Xiaojing Wang für die Unterstützung mit dem Bau der genomweiten Mutanten. Wir danken auch dem DNA Core Facility an der Virginia Commonwealth University für die DNA-Sequenzierung.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Primer F2 Integrated DNA Technologies TGACTAACTAGGAGGAATAAATG
GCTAAAATGAGAATAT
Primer R2 ibid CATTATTCCCTCCAGGTACTAAAA
CAATTCATCCAGT
Primer F2p ibid GATAAACCCAGCGAACCATTTGA
Primer P1 ibid GCTTATATACCTTAGCAGGAGACA
Primer P2 ibid GTATGACATTGCCTTCTGCGTCC
Primer 5' end_R1_seq ibid GCCATTTATTCCTCCTAGTTAGTCA
Primer 5' end_F3_seq ibid GTTTTAGTACCTGGAGGGAATAATG
Primer 5' end_R1p_seq ibid CCTCAAATGGTTCGCTGGGTTTATC
CSP Synprep Sequence:NH2-DLRGVPNPWGWIFGR-COOH
DNA Polymerase Invitrogen 11304-102 Platinum Taq DNA Polymerase High Fidelity
EcoRI New England Biolabs Inc R0101S Restriction enzyme
Agar American Bioanalytical AB01185
Agarose Promega V3125
BHI BD Biosciences 237500 Brain Heart Infusion
Horse serum Fisher Scientific SH3007403 Horse serum
Km Fisher Scientific BP906-5 Kanamycin
TH broth BD Biosciences 249240 Todd Hewitt broth
PureLink 96 Invitrogen K310096 PureLink 96 PCR purification kit
QIAquick Qiagen 28106 QIAquick PCR purification kit
Filter Corning 431117 0.22 μm polystyrene filter
Anoxomat System Mart Microbiology b.v. Anoxomat Mark II
Benchtop centrifuge Thermo Scientific 75004377 Sorvall Legend RT Plus microplate rotor
Gel Documentation UVP LLC BioDoc-It 210
Incubator Fisher Scientific 11-690-625D Isotemp
Labnet's Gel XL Labnet E0160 Labnet's Gel XL
Microcentrifuge Eppendorf 22621408 Microcentrifuge 5415 R
Multichannel pipettes Thermo Scientfic 4661040, 4661020 Finnpipette F1
Thermal Cycler Applied Biosystems Inc. N805-0200 GeneAmp PCR system 9700

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sassetti, C. M., Boyd, D. H., Rubin, E. J. Genes required for mycobacterial growth defined by high density mutagenesis. Mol. Microbiol. 48, 77-84 (2003).
  2. Kobayashi, K., et al. Essential Bacillus subtilis genes. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 4678-4683 (2003).
  3. Trieu-Cuot, P., Courvalin, P. Nucleotide sequence of the Streptococcus faecalis plasmid gene encoding the 3'5"-aminoglycoside phosphotransferase type III. Gene. 23, 331-341 (1983).
  4. Paik, S., et al. Identification of virulence determinants for endocarditis in Streptococcus sanguinis by signature-tagged mutagenesis. Infect. Immun. 73, 6064-6074 (2005).
  5. Lukomski, S., et al. Nonpolar inactivation of the hypervariable streptococcal inhibitor of complement gene (sic) in serotype M1 Streptococcus pyogenes significantly decreases mouse mucosal colonization. Infect. Immun. 68, 535-542 (2000).
  6. Baba, T., et al. Construction of Escherichia coli K-12 in-frame, single-gene knockout mutants: the Keio collection. Mol. Syst. Biol. 2, (2006).
  7. de Berardinis, V. A complete collection of single-gene deletion mutants of Acinetobacter baylyi ADP1. Mol. Syst. Biol. 4, 174 (2008).
  8. Rodriguez, A. M., et al. Physiological and molecular characterization of genetic competence in Streptococcus sanguinis. Mol. Oral. Microbiol. 26, 99-116 (2011).
  9. Perry, D., Kuramitsu, H. K. Genetic transformation of Streptococcus mutans Infect. Immun. 32, 1295-1297 (1981).
  10. Pakula, R., Walczak, W. On the nature of competence of transformable streptococci. J. Gen. Microbiol. 31, 125-133 (1963).
  11. Datsenko, K. A., Wanner, B. L. One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 6640-6645 (2000).
  12. Xu, P., et al. Genome-wide essential gene identification in Streptococcus sanguinis. Sci. Rep. 1, (2011).

Tags

Genetik Mikrobiologie Molekularbiologie Biomedical Engineering Genomics, Genomweite Gendeletionen Gene High-Throughput- PCR
Genomweiten Gen-Deletionen in<em&gt; Streptococcus sanguinis</em&gt; Von High Throughput PCR
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ge, X., Xu, P. Genome-wide GeneMore

Ge, X., Xu, P. Genome-wide Gene Deletions in Streptococcus sanguinis by High Throughput PCR. J. Vis. Exp. (69), e4356, doi:10.3791/4356 (2012).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter