Summary
Une échelle du génome unique efficace méthode de mutation du gène a été établie à l'aide
Abstract
Transposon mutagenèse et un seul gène suppression ya deux méthodes appliquées dans inactivation du gène du génome entier dans 1,2 bactéries. Bien mutagenèse par transposon prend moins de temps, moins coûteux, et ne nécessite pas l'information du génome terminée, il ya deux faiblesses de cette méthode: (1) la possibilité d'une mutants disparates dans la bibliothèque mixte mutant qui contre-sélectionne les mutants où la concurrence est diminué; et (2) la possibilité d'inactivation partielle de gène par lequel les gènes ne sont pas entièrement perdent leur fonction après l'insertion d'un transposon. Analyse par deletion seul gène peut compenser les inconvénients liés à la mutagenèse par transposon. Pour améliorer l'efficacité de l'ensemble du génome délétion du gène unique, nous essayons de mettre en place une technique à haut débit pour l'ensemble du génome délétion du gène unique à l'aide sanguinis Streptococcus comme organisme modèle. Chaque délétion du gène construire dans S. sanguinis génome est conçu pour comporter 1Kb en amont du gène ciblé, le gène aphA-3, codant pour la protéine de résistance à la kanamycine et le 1-ko aval du gène ciblé. Trois ensembles d'amorces F1/R1, F2/R2 et F3/R3, respectivement, sont conçues et synthétisées dans un format de plaque à 96 puits pour PCR des amplifications de ces trois composantes de chaque suppression construire. R1 et F3 amorces contiennent 25-pb des séquences qui sont complémentaires de régions de la aphA-3 du gène à leur extrémité 5 '. A grande échelle amplification par PCR du gène aphA-3 est effectuée une fois pour toutes les constructions de deletion création d'un seul gène. Le promoteur de gène aphA-3 est initialement exclu de réduire au minimum l'effet potentiel polaire de cassette kanamycine. Pour créer les constructions de deletion du gène à haut débit amplification par PCR et la purification sont effectuées dans un format de plaque à 96 puits. Un amplicon PCR recombinante linéaire pour chaque délétion du gène sera constitué par quatre réactions PCR en utilisant l'ADN polymérase haute fidélité. Le expon initialephase de croissance préférentiel de S. sanguinis cultivées en bouillon Todd Hewitt supplémenté avec 2,5% de sérum de cheval inactivé est utilisé pour augmenter la compétence pour la transformation de la PCR recombinante constructions. Sous cette condition, jusqu'à 20% de S. sanguinis cellules peuvent être transformées en utilisant ~ 50 ng d'ADN. Sur la base de cette approche, 2.048 mutants avec un seul gène de suppression ont finalement été obtenus à partir des gènes chez S. 2270 sanguinis l'exclusion des quatre ORF du gène entièrement contenue dans d'autres ORF de S. SK36 sanguinis et 218 gènes potentiels essentielles. La technique sur la création de constructions de deletion du gène est un débit élevé et pourrait être facile à utiliser dans l'ensemble du génome délétions de gènes uniques pour toutes les bactéries transformables.
Protocol
1. Conception Primer
- Les amorces sont conçues à l'aide de scripts maison basé sur le S. séquence du génome sanguinis SK36. Trois ensembles d'amorces, F1/R1, F2/R2, F3/R3 et sont conçus pour l'amplification de la séquence 1-kb en amont du gène cible, la résistance aphA-3 du gène codant pour la kanamycine (Km r), et la protéine 3 1 -kb de séquence en aval du gène cible, respectivement (figure 1). Parmi ces amorces, F1 et R3 sont conçus à l'aide de la suite ePrimer3 EMBOSS de programmes ( http://emboss.sourceforge.net/apps/cvs/emboss/apps/index.html ) pour amplifier des régions flanquantes en amont ou en aval de la cible gène. Amorces spécifiques de gènes, R1 et F3, sont conçus en fonction de la 5 'et 3' des séquences du gène cible. R1 et F3 amorces contiennent les séquences d'adaptateur 25-BP à leur extrémité 5 'qui sont complémentaires de la aphA-3gène. Les températures de fusion de chacune des amorces ont été conçues pour être aussi proche que possible de 60 ° C pour permettre l'utilisation d'une température de recuit uniforme pour toutes les réactions de PCR en format de 96-puits.
- F1, R1, R3 F3 et les amorces sont synthétisées dans des plaques 96 puits sur la base d'un ordre des gènes. Chaque plaque contient un type d'amorces dans l'ordre même gène. Diluer les amorces en plaque de 96 puits d'amorce de travail à une concentration finale de 10 pM pour l'amplification PCR à l'aide d'une pipette multicanaux.
2. À haut débit amplification par PCR et purification
- Pour amplifier à haut débit de 1 kb en amont ou en aval de la cible S. gènes sanguinis, assembler un mélange cocktail PCR sur de la glace dans un tube conique de 15 ml contenant 1640 pi ddH 2 O, 250 pi 10xHigh Fidelity PCR Buffer, 200 ul de 10 mM de dNTP mélange, 100 ul de 50 mM MgSO 4, 100 pi de 10 ng / ul S. l'ADN génomique SK36 sanguinis et 10 pl Platinum Taq ADN polymerase de haute fidélité et de transfert 23 ul du mélange dans chaque puits de plaque de 96 puits PCR à l'aide d'une pipette multicanaux. Transférer 1 ul de chaque F1 et R1 (ou F3 et R3) à partir de 10 uM de travail plaques d'amorces pour la plaque PCR en utilisant une pipette multicanaux. Sceller la plaque PCR et l'amplification à 94 ° C pendant 1 min et 30 cycles de 94 ° C pendant 30 secondes, 54 ° C pendant 30 secondes et 68 ° C pendant 1,5 min.
- Préparez 1% gel d'agarose contenant du bromure d'éthidium à 48 puits multicanal chargement pipette raccord. Mélanger 4 ul produit PCR avec 1 pi de tampon de chargement 5xDNA sur plaque de 96 puits et de charger les échantillons sur un gel d'agarose à l'aide d'une pipette multicanaux 10 pi. Exécuter électrophorèse à 135 V pendant 30 min. Examinez la bande sur un gel de la documentation en vertu UVP et d'analyse.
- Purifier produits de PCR par 96 PureLink kit de purification PCR en utilisant la centrifugation conformément aux instructions du fabricant. Pour l'élution de l'ADN, ajouter 40 ul stériles ddH 2 O pour le bien de la bROUVER plaque.
- Choisir au hasard plusieurs amplicons purifiés sur la plaque d'examiner les concentrations d'ADN en utilisant un spectrophotomètre NanoDrop. Ajuster la concentration d'amplicons sur la plaque à ~ 10 ng / ul.
- Un plasmide contenant la cassette kilomètres r est digéré par EcoRI comme matrice de PCR. Le plasmide digéré est purifié par le kit QIAquick PCR purification et l'ADN plasmidique linéaire est ajustée à la concentration finale d'ADN à 10 ng / ul. Monter 25 ul de mélange amplicon km cassettes r dont 16,4 ul O ddH 2, 2,5 pi 10xHigh Fidelity PCR Buffer, 2 ul de 10 mM de dNTP mélange, 1 ul de 50 mM de Mg SO 4, 1 pl de 10 uM F2, 1 pl de 10 R2 uM, 1 pi d'ADN plasmidique linéaire et 0,1 ul fidélité Platinum Taq ADN polymérase haute. Effectuer une amplification PCR à 94 ° C pendant 1 min, et 30 cycles de 94 ° C pendant 30 sec, 55 ° C pendant 30 s et 68 ° C pendant 1 min. Examiner le produit de PCR par électrophorèse sur gel d'agarose 1%. Poola majeure partie de l'amplicon km cassettes r de 10 individus PCR purifié par le kit QIAquick PCR purification. Ajuster la concentration amplicon à 10 ng / ul.
- Pour obtenir le dernier linéaire amplicon de PCR recombinant, trois amplicons PCR sont combinés les uns avec les pl 1 (en des quantités à peu près égales molaire) dans une plaque de PCR ainsi que la matrice de PCR. D'autres composants PCR est ajouté dont 14,4 ul O ddH 2, 2,5 pi 10xHigh Fidelity PCR Buffer, 2 ul de 10 mM de dNTP mélange, 1 ul de 50 mM de Mg SO 4, 1 ul de 10 uM F1, 1 pl de 10 uM R3, 0,1 pi d'ADN Platinum Taq polymérase haute fidélité. L'amplification par PCR est effectuée à 94 ° C pendant 2 min, 30 cycles de 94 ° C pendant 30 sec à 55 ° C pendant 30 s et 68 ° C pendant 3,5 min, et enfin 68 ° C pendant 4 min.
- Examinez le amplicons PCR sur gel d'agarose. Purifier et quantifier les amplicons de PCR comme décrit ci-dessus. Geler les amplicons PCR recombinés à -20 ° C.
3. Comcompétente Préparation des cellules
- Bouillon Todd Hewitt est préparé, pH ajusté à 7,6 avec du NaOH 10 N, on chauffe à ébullition, puis refroidi à température ambiante et on stérilise à l'aide de polystyrène 0,22 um filtre 4. Ajouter 300 ul cheval inactivé par la chaleur sérums (concentration finale de 2,5%) à 11,7 ml de bouillon Todd Hewitt dans 15 ml tube conique de rattraper TH + support HS. TH + HS aliquote milieu dans 2 ml et 10 ml dans des tubes.
- Inoculer 5 ul de stock S. sanguinis SK36 congelé à -80 ° C en 2 TH ml + support HS et incuber la culture d'une nuit avec le plafonnement bien à 37 ° C, accompagnée de pré-incubation de 10 ml-TH + HS tube.
- Après une nuit, transférer 50 ul culture dans 10 ml TH + HS et incuber le tube à 37 ° C pendant 3 heures (correspondant à DO 660 de 0,07 à 0,08), immédiatement à l'aide d'une transformation.
4. Transformation cellulaire et de sélection des antibiotiques
- Ajouter 2 ul de 70 ng S. sanguinis SK36 compétence peptide stimulant (CSP) et 2 pi linéaire recombinant amplicon de PCR (~ 50 ng) pour tubes Eppendorf de 96 puits à bloc et préchauffer les à 37 ° C. Transfert 330 ul de 3 h-incubé SK36 la culture dans chaque tube. Incuber à 37 ° C pendant 1 heure. Remplacer l'ADN avec O stérile ddH 2 comme contrôle.
- Placez le bloc sur la glace et se propager 100 ul de chaque transformation sur bouillon coeur-cervelle (BHI) plaque de gélose avec 500 ug / ml de kanamycine. Incuber les plaques à 37 ° C pendant 2 jours dans des conditions micro-aérobies.
5. Confirmation mutant et de stockage
- Pour chaque mutant remplacement, au hasard, relever 2 colonies individuelles, inoculer la colonie dans 5 ml de BHI contenant 500 ug / ml de kanamycine et incuber l'inoculum microaérobie une nuit à 37 ° C. Cryoconservation de chaque culture dans du glycérol 30% à -80 ° C
- Afin de déterminer si le mutant contenant le gène de remplacement prévu, effectuer une PCR sur colonie pour chaque mutant en utilisant F1 et R3amorces dans plaque de 96 puits PCR. Environ 1-pi culture d'une nuit de colonie individuelle est utilisée en tant que matrice d'ADN dans le 25-pl réaction d'amplification par PCR. La PCR est réalisée à 94 ° C pendant 5 min, 35 cycles de 94 ° C pendant 30 sec, 55 ° C pendant 30 s et 68 ° C pendant 3,5 min, et enfin 68 ° C pendant 4 min.
- Pour identifier avec précision double bande mutants ou contaminant amplicons PCR, d'examiner l'amplicon PCR par électrophorèse pendant 4 heures sur> 12 cm de long 2% gel d'agarose avec coloration au bromure d'éthidium. Sous cette condition électrophorèse sur gel d'agarose, les amplicons avec ≥ 100 pb différence ont été clairement identifiés. Lorsque des bandes résultant de l'amplification de la cassette de r km et le gène de type sauvage sont prévus pour différer par <100 pb, une amorce T1 interne est utilisée pour déterminer si un gène de type sauvage peut être détecté par PCR.
- Pour confirmer la suppression, les amplicons sont purifiés par PureLink 96 PCR purification kit et séquencé en utilisant l'amorce P1 quise lie à la cassette r km. Ne garder que les mutants correctes confirmés par séquençage.
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Representative Results
Après amplification par PCR en utilisant des amorces F1 et R1, R3 et F3 et, approximativement 1-kb en amont et en aval de chaque S. sanguinis gène ont été obtenus dans le format 96-puits, respectivement (figure 2A). Dans nos conditions de PCR utilisant des amorces conçues et, un produit spécifique a été amplifié à partir de S. sanguinis ADN génomique dans chaque réaction PCR. Ce résultat indique les amorces étaient très spécifiques à la cible de S. sanguinis. Par PCR ré-amplification en utilisant des amorces F1 et R3 et trois amplicons que matrices d'ADN linéaires, des constructions recombinantes PCR (~ 3 kb) ont été créés à haut débit sur la plaque 96-puits, composée d'une région en amont du gène de chaque cible, une kanamycine cassette, et une région en aval de chaque gène cible en ce que la commande (Figure 2B). Les constructions recombinantes PCR ont ensuite été transformé en S. SK36 sanguinis et sélectionnées par la kanamycine sur plaque de gélose BHI. Pour la majorité des transformations, plus de 1000 colonies ont été obtenues sur chaque plaque après un 2-microaérobie d 'incubation. Lorsque ces colonies ont été amplifiés par PCR en utilisant F1 et R3, une bande d'ADN unique correspondant à la taille attendue mutant (~ 3 kb) a été observée par électrophorèse sur gel (figure 2C). Lorsque vous tentez de supprimer potentiels gènes essentiels, pas de colonies ont pu être obtenus dans la plupart des transformations. Pour la suppression de certains gènes essentiels, cependant, les colonies étaient encore obtenu après transformation. Après amplification par PCR de ces colonies en utilisant F1/R3, deux bandes d'ADN correspondant à la taille attendue mutant et la taille de type sauvage est apparu comme l'a révélé par électrophorèse sur gel (figure 2C). Pour certains mutants, la taille attendue mutant et la taille de type sauvage amplicon de PCR ont été trop proches pour être séparés par gel d'agarose longtemps. Dans ce cas, un T1 amorce interne a été conçu sur la base de la séquence du gène de type sauvage. PCR a été réalisée en utilisant l'amorce T1 interne d'une F1 amorce (figure 2D). Le SK36 de type sauvage a été utilisé comme une souche témoin positive pour cette PCR. Si une bande à la taille attendue a été amplifié à partir du mutant en utilisant l'amorce interne, le gène a été identifié comme gène essentiel (double-bande mutant) car la présence de la cassette kanamycine dans le mutant a été confirmé précédemment par séquençage de l'ADN en utilisant l'amorce P1. Sur la base de ce protocole, nous avons finalement recueilli 2048 non essentiels S. mutants du gène sanguinis excluant ces quatre ORF entièrement contenues dans d'autres ORF (tableau 1). Nous avons identifié 218 gènes qui sont essentiels pour S. sanguinis survie dans les conditions expérimentales.
| Classe | Open-cadres de lecture (ORF) |
| * Le total des gènes | 2270 |
| Gènes ciblés | 2266 |
| Non essentiels (promoteur aphA-3) | 1973 |
| Non essentiels (promoteur aphA-3) | 75 |
| Essential (aucun transformant) | 60 |
| Essential (double bande) | 158 |
* Quatre ORF entièrement contenues dans d'autres ORF.
Tableau 1. S. sanguinis gène mutant résumé.
Figure 1. PCR recombinante. Trois séries d'amorces (F1/R1, F2/R2 et F3/R3) sont conçus pour amplifier la séquence en amont, un gène de résistance aux médicaments (Kmr) et la séquence en aval, respectivement. Les deux extrémités 5 'des amorces R1 et F3 contiennent des séquences complementary avec la cassette d'un gène de résistance aux antibiotiques. Un produit final de PCR d'ADN recombinant contenant le marqueur de sélection antibiotique flanquée de S. ADN génomique sanguinis est produit en utilisant F1/R3. L'ADN recombinant sera intégré dans S. génome sanguinis par double cross-over recombinaison.
Figure 2. Électrophorèse sur gel Représentant de la PCR amplicons d'agarose. A, 1-ko amplicons PCR en amont ou en aval de la cible de S. gènes sanguinis. B, les ADN recombinants composés de PCR en amont et en aval des gènes cibles et de promoteur aphA-3. Amplicons C, des colonies de PCR de la transformation de S. sanguinis avec des ADN recombinants PCR; bandes doubles à la piste 4, 10, 14, 15, 20 et 24. D, l'amplification par PCR de colonies de type sauvage et mutant en utilisant des amorces F1/T1; M,mutant, W, de type sauvage.
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Discussion
Pour minimiser les effets possibles polaires du remplacement d'un gène ciblé avec le gène exogène antibiotiques sur les gènes voisins, deux mesures sont prises en amorce initiale de conception. Pour la plupart des gènes délétés, la amorces R1 et F3 sont conçus pour supprimer de la région codante de 6 pb après le codon d'initiation de 30 pb avant le codon stop. Les 30 dernières paires de bases sont conservées pour protéger le potentiel du site de liaison ribosomique utilisé par le gène adjacent en aval. La région conservée entre deux gènes voisins est porté à 100 pb quand elles se trouvent dans des orientations opposées, et les extrémités N-terminales des deux protéines est proche de l'autre pour empêcher la suppression d'une région de promoteur potentiel. Le promoteur de gène aphA-3 est exclue dans la construction recombinante de délétion du gène 5. Un site de liaison ribosomique est introduite dans le gène aphA-3 pour la traduction. Pour tester notre stratégie, nous avons construit de façon aléatoire 10, puis 96 mutants alléliques de change. Nous obtained 10 et 93 mutants, respectivement, sur des plaques de sélection à la kanamycine, ce qui suggère que le promoteur-moins-3 aphA gène a été bien exprimé dans la plupart des cas. Nous avons ensuite conçu et synthétisé l'amorce pour le promoteur de moins aphA-3 gène pour tous les délétions de gènes dans le S. sanguinis génome. Cependant, nous avons trouvé certains gènes chez S. sanguinis ont été peu ou pas exprimé exprimé qui est susceptible d'affecter l'expression de la promoteur du gène aphA-3, et donc de la sélection à la kanamycine. Pour résoudre ce problème, le promoteur du gène aphA-3 à partir du plasmide a été introduit dans la cassette r km. Une grande partie de l'amplicon promoteur km cassettes r a été obtenue de 10 individus PCR utilisant des amorces F2p/R2. Sauf que la nouvelle R1 promoteur amorces R1P ont été conçus pour complément avec l'amplicon promoteur km cassettes r, toutes les étapes de la construction d'autres étaient les mêmes que pour le promoteur de moins de construction.
Pour améliorer la efficiency de la recombinaison homologue, nous sélectionnons longs (1 ko) séquences flanquantes en amont et en aval de la S. gène cible sanguinis dans la fabrication de gènes de suppression des constructions. La taille de la séquence flanquante est limitée à 1 kb, sur la base de deux points: (1) la longueur du fragment d'ADN (~ 3 kb) a permis prêt amplification par PCR du gène aphA-3 (~ 1 kb) plus 2 kb de séquences adjacentes à l'aide ADN polymérase haute fidélité, et (2) la faisabilité du séquençage des régions flanquantes par ABI méthode de séquençage des deux extrémités (~ 1 kb). Un nombre élevé de transformants dans plus de S. la délétion de gènes sanguinis indiqué séquences 1 kb en amont et en aval, respectivement, ont suffi à élimination directe des gènes cibles.
À connecter le succès en amont et en aval du gène cible avec les deux extrémités de aphA-3 du gène recombinant dans l'amplification par PCR, les amorces R1, F2, F3 et R2 seront ajoutés à leurs extrémités 5 'une séquence supplémentaire qui est complémentaire avec le connète extrémité de l'autre côté dans de nombreux cas, la délétion du gène bactérien 6,7. Des études préliminaires ont montré que la séquence supplémentaire pourrait être réduite à 25 pb pour ce protocole PCR recombinante. Dans ce protocole, on élimine les séquences d'amorces supplémentaires et R2 F2 dans aphA-3 du gène et ajouté 25-pb de séquence supplémentaire à l'extrémité 5 'de F3 et R1 en amont et en aval de la S. gène cible sanguinis. Cette conception va diminuer la longueur et la quantité d'amorces et donc de réduire les coûts et les temps de PCR pour améliorer l'efficacité du seul gène suppression. Dans notre laboratoire, cette conception a également été démontrée avec succès pour la délétion de gènes dans d'autres microbes tels que Streptococcus mutans et Streptococcus pneumoniae, et Porphyromonas gingivalis.
Dans ce protocole, la spécificité des amorces de PCR est critique. La température de fusion amorce était élevée (> 58 ° C), la taille amorce était longue (> 21 pb), et le bi primaireSite nding était unique dans le génome de S. sanguinis. Cette conception unique produit de gènes spécifiques produits dans presque chacune de nos amplifications par PCR. Un seul gène spécifique du produit d'amplification par PCR est essentiel pour l'amplification PCR dernier. Autrement, l'amplification PCR final qui conduit à la formation de la dernière recombinant composé de régions en amont et en aval de chaque gène et cassette de gène antibiotique, respectivement, serait difficile.
La dépendance de la densité cellulaire de la transformation a été démontrée dans de nombreux streptocoques tels que S. sanguinis 8, S. 9 et S. mutans pneumoniae 10. Lorsque la densité cellulaire de S. sanguinis atteint un diamètre extérieur de 660 de 0.07 à 0.08 (correspondant à ~ 5x10 6 UFC / ml) dans TH + support HS, la plus grande efficacité de transformation de S. sanguinis avec un amplicon de PCR linéaire recombinant a été obtenu et jusqu'à 20% de S. cellules sanguinispourrait être transformé. Après l'achèvement de la délétion de gènes du génome entier dans S. sanguinis, nous avons constaté que le nombre de transformants pour la suppression de certains gènes non essentiels était faible (~ 10). Il ne fait aucun doute que l'efficacité de transformation élevée de bactéries est important de remplir toutes délétions de gènes non essentiels dans les KO du gène du génome entier.
Sauf pour la création recombinant construit par PCR, il ya aussi d'autres techniques d'inactivation du gène unique. Par exemple, la création de plasmide suicide a été largement applicable pour inactiver des gènes bactériens sur une petite échelle. Cependant, cette technique n'a pas été utilisée pour l'ensemble du génome inactivation d'un gène unique parce création à grande échelle plasmide est beaucoup plus longue et laborieuse, et certaines bactéries doivent être créés suicide spécifique plasmide. Bien que marqueur moins délétion du gène peut éviter l'effet possible polaire du gène de résistance aux antibiotiques, traditionnel marqueur méthode moins délétion du gène est plus longue consuming et difficiles à inactiver un gène de la méthode plasmide suicide. Chez Escherichia coli, la délétion de gènes du génome entier de marge moins ont été obtenus grâce au remplacement de gène de résistance aux antibiotiques et l'élimination de la cassette 6 Résistance. Cependant, ce E. coli souche nécessite le phage λ Red recombinase. Avant de gènes de suppression de transformation, le plasmide Red pKD46 aide doit être introduite dans E. coli 11. Dans notre technique, nous avons éliminé le promoteur du gène de résistance aphA-3 dans la grande majorité des gènes mutants supprimés et conçu les deux extrémités de aphA-3 ORF de suivre la structure d'expression du gène délété la région, afin d'éviter la polaire question de l'effet de la cassette de résistance. Jusqu'à présent, nous n'avons pas trouvé la question effet polaire, après avoir examiné la fonction de nombreux mutants créés par cette technologie. Un ensemble l'échelle du génome et claire de gènes essentiels acquis en S. sanguinis utilisant ème12 est aussi technique implique la possibilité de faible effet polaire de cassette d'antibiotique dans le système. Nous avons démontré autres gènes promoteurs-moins de résistance aux antibiotiques, comme l'érythromycine et le chloramphénicol, les gènes de résistance pourraient être appliquées à cette technique (données non présentées). En outre, cette technique n'a pas besoin hôte plasmide suicide et reconstruit. Dans l'ensemble, cette technique est à haut débit pour créer l'échelle du génome constructions de deletion de gènes et pourrait être facile à réaliser dans l'ensemble du génome mutation génétique unique d'une bactérie.
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Disclosures
Aucun conflit d'intérêt déclaré.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par des subventions R01DE018138 de la National Institutes of Health (PX) et en partie par la Virginia Commonwealth University Research Programme d'encouragement présidentielle (PRIP) 144602-3 (PX). Nous remercions les Drs. Lei Chen, Yuetan Dou et Xiaojing Wang pour aider à la construction de mutants du génome entier. Nous remercions également le Core Facility l'ADN à l'Université Virginia Commonwealth pour le séquençage de l'ADN.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Primer F2 | Integrated DNA Technologies | TGACTAACTAGGAGGAATAAATG GCTAAAATGAGAATAT |
|
| Primer R2 | ibid | CATTATTCCCTCCAGGTACTAAAA CAATTCATCCAGT |
|
| Primer F2p | ibid | GATAAACCCAGCGAACCATTTGA | |
| Primer P1 | ibid | GCTTATATACCTTAGCAGGAGACA | |
| Primer P2 | ibid | GTATGACATTGCCTTCTGCGTCC | |
| Primer 5' end_R1_seq | ibid | GCCATTTATTCCTCCTAGTTAGTCA | |
| Primer 5' end_F3_seq | ibid | GTTTTAGTACCTGGAGGGAATAATG | |
| Primer 5' end_R1p_seq | ibid | CCTCAAATGGTTCGCTGGGTTTATC | |
| CSP | Synprep | Sequence:NH2-DLRGVPNPWGWIFGR-COOH | |
| DNA Polymerase | Invitrogen | 11304-102 | Platinum Taq DNA Polymerase High Fidelity |
| EcoRI | New England Biolabs Inc | R0101S | Restriction enzyme |
| Agar | American Bioanalytical | AB01185 | |
| Agarose | Promega | V3125 | |
| BHI | BD Biosciences | 237500 | Brain Heart Infusion |
| Horse serum | Fisher Scientific | SH3007403 | Horse serum |
| Km | Fisher Scientific | BP906-5 | Kanamycin |
| TH broth | BD Biosciences | 249240 | Todd Hewitt broth |
| PureLink 96 | Invitrogen | K310096 | PureLink 96 PCR purification kit |
| QIAquick | Qiagen | 28106 | QIAquick PCR purification kit |
| Filter | Corning | 431117 | 0.22 μm polystyrene filter |
| Anoxomat System | Mart Microbiology b.v. | Anoxomat Mark II | |
| Benchtop centrifuge | Thermo Scientific | 75004377 | Sorvall Legend RT Plus microplate rotor |
| Gel Documentation | UVP LLC | BioDoc-It 210 | |
| Incubator | Fisher Scientific | 11-690-625D | Isotemp |
| Labnet's Gel XL | Labnet | E0160 | Labnet's Gel XL |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 22621408 | Microcentrifuge 5415 R |
| Multichannel pipettes | Thermo Scientfic | 4661040, 4661020 | Finnpipette F1 |
| Thermal Cycler | Applied Biosystems Inc. | N805-0200 | GeneAmp PCR system 9700 |
References
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