Summary
שיטה יעילה הגנום בודדה גן מוטציה כבר נקבעה באמצעות
Abstract
Transposon mutagenesis ומחיקה של גן היחיד הם שתי שיטות שיושמו בנוקאאוט גן גנום רחב ב1,2 חיידקים. למרות mutagenesis transposon הוא פחות זמן רב, יקר פחות, ואינו דורש מידע הגנום הושלם, יש שתי חולשות בשיטה זו: (1) האפשרות של מוטציות שונות בספריית המוטציה המעורבת שנגד בוחרת מוטנטים עם תחרות ירד; ו (2) האפשרות של איון גן החלקי לפיו גנים לא לגמרי מאבדת את תפקודם לאחר החדרת transposon. ניתוח מחיקה של הגן יחיד עשוי לפצות על חסרונות הקשורים mutagenesis transposon. כדי לשפר את היעילות של מחיקה הגנום בודדה גן, אנו מנסים להקים טכניקת תפוקה גבוהה למחיקת גן יחידה הגנום באמצעות sanguinis Streptococcus כאורגניזם מודל. כל מחיקת גן לבנות בס sanguinis הגנום נועד מהווה 1-KB זרם של הגן הממוקד, גן APHA-3, חלבון התנגדות kanamycin קידוד, או במורד 1-KB של הגן הממוקד. שלושה זוגות של פריימרים F1/R1, F2/R2, וF3/R3, בהתאמה, מתוכננים ומסונתזים בפורמט צלחת 96-גם ל- amplifications PCR של שלושה המרכיבים האלה של כל מחיקה להקים. Primers R1 ו F3 מכילים רצפי 25-BP שמשלימים לאזורים של-3 APHA הגן בקצה 5 'שלהם. הגברת PCR קנה מידה גדולה של-3 APHA הגן מתבצעת פעם אחת ליצירה כל מבני המחיקה בגן בודד. האמרגן של גן APHA-3 בתחילה הוצא כדי למזער את ההשפעה הפוטנציאלית של קוטב קלטת kanamycin. כדי ליצור מבני מחיקת הגן, הגברת תפוקה גבוהה PCR וטיהור מבוצעות בפורמט צלחת 96-כן. Amplicon PCR רקומביננטי יניארית לכל מחיקת גן יהיה מורכב באמצעות ארבע תגובות PCR באמצעות DNA פולימראז באיכות גבוהה. Expon הראשונישלב הצמיחה ential של ס ' sanguinis תרבית בטוד יואיט מרק בתוספת 2.5% סרום סוס מומת משמש כדי להגדיל את היכולת של שינוי מבני PCR-רקומביננטי. תחת תנאי זה, עד 20% של ס ' תאי sanguinis ניתן להפוך באמצעות ~ 50 ng של DNA. בהתבסס על גישה זו, 2048 מוטנטים עם מחיקת גן יחיד סופו של דבר התקבלו מ2270 הגנים בס sanguinis למעט 4 ORFs גנים כלולים כולו בתוך ORFs האחר בס sanguinis SK36 ו218 גנים חיוניים פוטנציאליים. הטכניקה ביצירת מבני מחיקת גן היא תפוקה גבוהה ויכולה להיות קל לשימוש במחיקות גן יחידות הגנום לכל חיידקי transformable.
Protocol
1. עיצוב פריימר
- Primers תוכנן באמצעות תסריטים בבית המבוסס על ס רצף הגנום sanguinis SK36. שלושה זוגות של פריימרים, F1/R1, F2/R2, וF3/R3 מיועדים להגברה של רצף 1-kb במעלה הזרם של גן המטרה, התנגדות APHA-3 גן קידוד kanamycin (הק"מ R) החלבון 3 ו 1 -KB רצף במורד זרם של גן המטרה, בהתאמה (איור 1). בין פריימרים אלה, F1 ו R3 תוכננו באמצעות ePrimer3 בסוויטת הבלטה של תוכניות (http://emboss.sourceforge.net/apps/cvs/emboss/apps/index.html) כדי להגביר אזורי איגוף מעלה זרם או במורד זרם של היעד גן. פריימרים הגן ספציפיים, R1 וF3, נועדו מבוססים על רצפים של גן היעד 5 '3 ו'. פריימרים R1 וF3 מכילים רצפי מתאם 25-BP בסוף 5 'שלהם שמשלימים לAPHA-3גן. את טמפרטורת ההיתוך של כל צבע יסוד נועדה להיות קרוב ככל האפשר עד 60 ° C כדי לאפשר שימוש במדי חישול טמפרטורה לכל תגובות PCR בפורמט 96-כן.
- F1, R1, F3 ופריימרים R3 מסונתזים בצלחות 96-כן בהתבסס על מנת גנים. כל צלחת מכילה סוג אחד של פריימרים באותו סדר הגן. לדלל את האלפונים ב96-גם צלחת פריימר פועל לריכוז סופי של 10 מיקרומטר להגברת PCR באמצעות פיפטה רבה ערוצים.
2. הגברת תפוקה גבוהה PCR וטיהור
- כדי להגביר את התפוקה גבוהה 1-kb מעלה זרם או במורד זרם של היעד ס גני sanguinis, להרכיב תערובת קוקטייל PCR על קרח בצינור חרוטים 15-מ"ל מכיל 1640 DDH 2 O μl, פידליטי 10xHigh μl PCR מאגר 250, 200 μl של תערובת 10 mM dNTP, 100 μl של 50 מ"מ MgSO 4, 100 μl של 10 ng / μl ס הדנ"א הגנומי sanguinis SK36 וμl פלטינום תקי DNA polyme 10rase איכות גבוהה והעברה 23 μl של התערובת לתוך כל באר על 96-גם צלחת PCR באמצעות פיפטה רבה ערוצים. העברת μl 1 מתוך כל F1 וR1 (או F3 ו R3) מתוך 10 מיקרומטר עבודת צלחות פריימר לצלחת PCR באמצעות פיפטה רבה ערוצים. לאטום את צלחת PCR ולבצע הגברה ב 94 מעלות צלזיוס במשך 1 דקות, ו 30 מחזורים של 94 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות, 54 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות ו 68 מעלות צלזיוס במשך 1.5 דקות.
- הכן 1% agarose ג'ל המכיל רומיד ethidium עם טעינת 48 בארות הולמת רב פיפטה. מערבבי 4 מוצר PCR μl μl עם 1 של חיץ טעינת 5xDNA בצלחת 96-היטב ולטעון את הדגימות על agarose ג'ל באמצעות פיפטה רב 10-μl. הפעל אלקטרופורזה ב135 V למשך 30 דקות. בדוק את הלהקה בג'ל תחת מערכת ניתוח ותיעוד UVP.
- לטהר את מוצרי ה-PCR על ידי ערכת PureLink 96 PCR טיהור באמצעות צנטריפוגה פי ההוראות של היצרן. למשחררי DNA, להוסיף 40 μl סטרילי DDH 2 O אל באר בinding צלחת.
- באופן אקראי לקחת כמה amplicons מטוהר על הצלחת לבחון את ריכוזי DNA באמצעות ספקטרופוטומטר NanoDrop. התאם את הריכוז של amplicons על צלחת ל~ 10 ng / μl.
- קלטת r פלסמיד המכיל ק"מ מתעכלת באמצעות EcoR כתבנית PCR. הפלסמיד מעוכל מטוהר על ידי ערכת טיהור PCR QIAquick וDNA פלסמיד לינארי מותאם לריכוז ה-DNA סופי 10 ng / μl. להרכיב תערובת μl 25 לamplicon קלטת r הק"מ כולל 16.4 DDH 2 O μl, פידליטי 10xHigh μl PCR מאגר 2.5, 2 μl של תערובת 10 mM dNTP, μl 1 מתוך Mg 50 מ"מימ SO 4, μl 1 מתוך 10 מיקרומטר F2, μl 1 מתוך 10 מיקרומטר R2, ה-DNA 1 μl יניארי פלסמיד ונאמנות 0.1 μl פלטינום תקי פולימראז ה-DNA גבוהה. בצע הגברת PCR ב 94 מעלות צלזיוס במשך 1 דקות, ו 30 מחזורים של 94 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות, 55 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות ו 68 מעלות צלזיוס במשך דקות 1. בדוק את מוצר PCR ידי אלקטרופורזה ג'ל על 1% agarose. פותפזורת של la amplicon הק"מ r הקלטת מ 10 פרט PCR מטוהר על ידי ערכת טיהור PCR QIAquick. התאם את ריכוז amplicon עד 10 ng / μl.
- כדי להשיג את amplicon PCR רקומביננטי הסופי ליניארי, שלוש amplicons PCR בשילוב עם כל μl 1 (בכמויות כמעט שווה-טוחן) בצלחת אחת PCR גם תבנית ה-PCR. רכיבי PCR אחרים מתווספים כולל 14.4 DDH 2 O μl, פידליטי 10xHigh μl PCR מאגר 2.5, 2 μl של תערובת 10 mM dNTP, μl 1 מתוך Mg 50 מ"מימ SO 4, μl 1 מתוך 10 מיקרומטר F1, μl 1 מתוך 10 מיקרומטר R3, האיכות גבוהה 0.1 μl פלטינום תקי DNA פולימרז. הגברת PCR מתבצעת ב 94 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות, 30 מחזורים של 94 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות 55 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות ו 68 מעלות צלזיוס במשך 3.5 דקות, ובסופו 68 המעלות צלזיוס במשך 4 דקות.
- בחן PCR amplicons על agarose ג'ל. לטהר ולכמת את amplicons PCR כפי שתואר לעיל. הקפא את amplicons PCR מורכב ב -20 ° C.
3. Comהכנת תאים petent
- טוד יואיט המרק מוכן, חומציות מותאמת לשימוש 10 7.6 N NaOH, מחומם לרתיחה ולאחר מכן מקוררת לטמפרטורת חדר ועיקור באמצעות קלקר 0.22 מיקרומטר סינון 4. הוסף 300 סוס סרום μl חום מומת (ריכוז סופי של 2.5%) עד 11.7 מ"ל טוד יואיט מרק בצינור חרוטים 15-מ"ל כדי לפצות TH + בינוני HS. TH aliquot + HS הבינונית ל2 מ"ל ו 10 מ"ל בצינורות.
- לחסן 5 μl של המנייה ס sanguinis SK36 קפוא ב -80 ° C לTH + בינוני 2 מ"ל HS ודגירת תרבות הלילה עם המכסה בחוזקה על 37 מעלות צלזיוס, בליווי דוגר מראש 10 מ"ל-TH + צינור HS.
- אחרי הלילה, להעביר תרבות μl 50 לתוך 10 המ"ל TH + HS ודגירת הצינור ב 37 מעלות צלזיוס במשך 3 שעות (מקביל לOD 660 של 0.07-0.08), תוך שימוש באופן מיידי לשינוי.
4. שינוי תא ובחירת אנטיביוטיקה
- הוסף 2 μl של 70 ng ס sanguinis SK36 compeפפטיד tence מגרה (CSP) וμl יניארי רקומביננטי PCR amplicon 2 (~ 50 ng) לאפנדורף צינורות על 96-גם בלוק ומראש החם ב 37 ° C. העברת 330 μl של 3 SK36 תרבות HR-מודגרות לכל צינור. לדגור על 37 מעלות צלזיוס במשך שעה 1. החלף DNA עם DDH 2 O סטרילית כשליטה.
- הנח את הבלוק על קרח והתפשט 100 μl של כל שינוי על צלחת אגרה עירוי לב מוח (BHI) עם 500 מיקרוגרם / המ"ל kanamycin. דגירת הצלחות על 37 מעלות צלזיוס למשך 2 ד בתנאי microaerobic.
5. אישור ואחסון מוטציה
- עבור כל מוטצית החלפה, באופן אקראי להרים 2 מושבות בודדות, לחסן את המושבה ל5 המ"ל מכיל 500 מיקרוגרם BHI / kanamycin מ"ל ודגירת בידוד microaerobically לילה בשעת 37 ° C. Cryopreserve כל תרבות בגליצרול 30% ב-80 ° C
- כדי לבחון האם מכיל את החלפת גן המוטנטי הצפוי, לבצע מושבה PCR לכל F1 באמצעות מוטציה וR3אלפונים ב96-PCR גם צלחת. על תרבות הלילה 1-μl ממושבה בודדה משמשת כתבנית ה-DNA בתגובת 25-μl PCR הגברה. PCR מתבצע ב 94 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות, 35 מחזורים של 94 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות, 55 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות ו 68 מעלות צלזיוס במשך 3.5 דקות, ובסופו 68 המעלות צלזיוס במשך 4 דקות.
- לזהות במדויק מוטנטים-band הכפול או amplicon PCR המזהם, לבחון amplicon PCR ידי אלקטרופורזה במשך 4 שעות ב> 12 סנטימטר ארוך 2% agarose ג'ל עם כתמי רומיד ethidium. תחת תנאי אלקטרופורזה ג'ל agarose זה, כל amplicons עם ≥ הבדל 100 נ"ב באופן מובהק. כאשר להקות תוצאה מההגברה של קלטת r הק"מ והגן פראי מהסוג צפויות לשינוי על פי <100 נ"ב, פריימר T1 הפנימי משמש כדי לקבוע האם גן פראי מסוג יכול להיות מזוהה על ידי PCR.
- על מנת להמשיך ולאשר את המחיקה, את amplicons מטוהר על ידי ערכת טיהור PureLink 96 PCR ורצף באמצעות פריימר P1 בינקשר לקלטת r הק"מ. שמור רק מוטנטים נכונים אושרו על ידי רצף.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
כדי למזער את ההשפעות האפשריות של קוטב החלפת הגן ממוקד אחד עם אנטיביוטיקת גן אקסוגני בגנים סמוכים, שני צעדים נלקחים תוך פריימר הראשוני בעיצוב. עבור רוב הגנים שנמחקו, פריימרים R1 ו F3 נועדו למחוק את אזור קידוד מ6 נ"ב לאחר קודון התחילה ועד 30 נ"ב לפני קודון העצירה. את 30 זוגות הבסיסים האחרונים נשמרים כדי להגן על אתר מחייב ריבוזומלי פוטנציאל בשימוש על ידי גן המורד הסמוך. האזור נשמר בין שני גנים השכנים הוארך עד 100 נ"ב, כאשר הם היו ממוקמים באורינטציות מנוגדות ואת N-Termini של שני החלבונים הוא קרוב זה לזה, כדי למנוע מחיקה של אזור מקדם פוטנציאלי. האמרגן של-3 APHA גן נכלל במבנה רקומביננטי למחיקת הגן 5. אתר מחייב ריבוזומלי מוחדר-3 APHA הגן לתרגום. כדי לבחון את האסטרטגיה שלנו, בנינו באופן אקראי 10 ולאחר מכן 96 מוטנטים exchange allelic. אנו obtained 10 ו 93 מוטנטים, בהתאמה, על צלחות בחירת kanamycin, טוען כי אמרגן פחות APHA-3 גן התבטא היטב ברוב המקרים. לאחר מכן, אנו תוכננו ומסונתזים פריימר ל- 3 APHA גן האמרגן פחות עבור כל מחיקות הגן בס sanguinis הגנום. עם זאת, מצאו כמה גנים בס sanguinis התבטאו נמוך או לא הביע אשר צפוי להשפיע על הביטוי של APHA-3 גן promoterless ומכאן בחירת kanamycin. כדי לפתור בעיה זו, האמרגן של-3 APHA גן מפלסמיד הוכנס קלטת r הק"מ. חלק ארי של amplicon קלטת r קילומטר האמרגן הושג מ10 PCR פרט באמצעות פריימרים F2p/R2. חוץ מזה שהאמרגן R1 פריימרים R1p החדש נועדו להשלמה עם amplicon קלטת r קילומטר האמרגן, כל צעדי הבנייה האחרים היו זהה לבניית אמרגן פחות.
כדי לשפר את efficiency של רקומבינציה הומולוגית, אנו בוחרים (1 ק"ג) רצפים ארוכי איגוף מעלה או במורדו של ס ' גן היעד sanguinis בהפיכת מבני גני מחיקה. גודל רצף האיגוף היה מוגבל ל 1 ק"ג על בסיס שתי נקודות: (1) אורך קטע DNA (~ 3 KB) אפשר הגברה מוכנה PCR של גן APHA-3 (~ 1 ק"ג) בתוספת 2 ק"ג של רצפי איגוף באמצעות פולימראז ה-DNA באיכות גבוהה, ו( 2) ההיתכנות של רצף אזורי איגוף על ידי שיטת סידור ABI משני קצותיו (~ 1 ק"ג). מספרים גבוהים של transformants ברוב ס מחיקות גני sanguinis הצביעו 1 רצפים במורד זרם בייט, בהתאמה, היו מספיק לנוקאאוט גני המטרה.
כדי להצליח להתחבר במורד הזרם של גן המטרה בשני קצוות של APHA-3 גן בהגברת PCR רקומביננטי, פריימרים R1, F2, F3 R2 ויתווסף בשעת 5 'מסתיים רצף נוסף כי הוא משלים עם connecting סוף בצד השני, במקרים רבים חיידקי גני מחיקת 6,7. מחקרים מוקדמים הראו כי רצף נוסף יכול להיות מופחת עד 25 נ"ב לפרוטוקול PCR רקומביננטי זה. בפרוטוקול זה, אנו חסלנו את הרצפים הנוספים של פריימרים F2 ו R2 בAPHA-3 גן והוספנו רצף תוספת 25-BP עד סוף 5'-של R1 ו F3 במעלה או במורד של ס ' גן היעד sanguinis. עיצוב זה יקטין את האורך וכמות פריימרים ולכן להפחית את העלות ואת זמני PCR כדי לשפר את היעילות של מחיקה בגן בודד. במעבדה שלנו, עיצוב זה יש גם הוכחה להצלחת מחיקות גנטיות בחיידקים אחרים כגון mutans Streptococcus pneumoniae וסטרפטוקוקוס, וgingivalis Porphyromonas.
בפרוטוקול זה, הספציפי של PCR primers הוא קריטי. טמפרטורת התכת פריימר הייתה גבוהה (> 58 ° C), גודל פריימר היה ארוך (> 21 נ"ב), ודו פריימראתר nding היה ייחודי בגנום של ס sanguinis. עיצוב זה מיוצר מוצרים בודדים גן ספציפיים בכל אחד כמעט של amplifications PCR שלנו. גן מוצר ספציפי אחת מהגברת PCR הוא קריטי להגברת PCR האחרונה. אחרת, הגברת PCR הסופית שתוצאות בהיווצרות המורכבת רקומביננטי הסופי של האזורים במורד זרם של כל גן וגן קלטת אנטיביוטיקה, בהתאמה, תהיינה קשות.
תלות תא בצפיפות של טרנספורמציה הודגמה בסטרפטוקוקוס רב כגון ס sanguinis 8, ש ' mutans 9 ו S. דלקת ריאות 10. כאשר צפיפות תאים של ס ' sanguinis הגיע OD 660 של 0.07-0.08 (המקביל ל ~ 5x10 6 CFU / מ"ל) בTH + בינוני HS, יעילות טרנספורמציה הגבוהה ביותר של ס sanguinis עם amplicon PCR רקומביננטי יניארי הושג ועד 20% של ס ' תאי sanguinisיכול להיות שונה. לאחר השלים מחיקות גני הגנום בס sanguinis, מצא כי המספר של transformants למחיקה של כמה גנים שאינם חיוניים היה נמוך (~ 10). אין ספק שיעילות טרנספורמציה גבוהה של חיידקים חשובה למלא את כל מחיקות גנים שאינם חיוניות בknockouts גני הגנום.
מלבד רקומביננטי יצירת מבנה באמצעות PCR, יש גם טכניקות אחרות לאיון גן יחיד. לדוגמה, יצירת פלסמיד התאבדות כבר בהרחבה חל על להשבית גני חיידקים בקנה מידה קטן. עם זאת, טכניקה זו לא נעשתה שימוש לאיון גן יחיד הגנום משום יצירת פלסמיד בקנה מידה גדולה בהרבה זמן רב ומייגע, וכמה חיידקים צריכים להיות שנוצרו התאבדות ספציפית פלסמיד. למרות מחיקת גן הסמן פחות עשויה למנוע את ההשפעה האפשרית של קוטב גן העמידות לאנטיביוטיקה, שיטת מחיקה מסורתית סמן פחות גן היא יותר זמן קוןsuming וקשה להשבית גן מאשר שיטת פלסמיד ההתאבדות. בחיידקי Escherichia, מחיקות גנים הגנום סימן פחות הושגו באמצעות החלפת גנים עם אנטיביוטיקת התנגדות ולאחר מכן חיסול קלטת ההתנגדות 6. עם זאת, א 'זה זן חיידק דורש recombinase phage λ האדום. לפני השינוי גנטי מחיקה, pKD46 פלסמיד העוזר האדום צריך להיות הציג לתוך E. coli 11. בטכניקה שלנו, אנו מבטלים את האמרגן של גן התנגדות APHA-3 ברוב המכריע של מוטציות גנטיות שנמחקו ועצבנו את שני קצוות של APHA-3 ORF לעקוב מבנה הביטוי של אזור הגנים נמחק, כדי למנוע את הקוטב סוגיית השפעה של קלטת ההתנגדות. עד עכשיו, לא מצאנו את נושא השפעת הקוטב לאחר שבחן את הפונקציה של מוטציות רבות שנוצרו על ידי טכנולוגיה זו. סט רחב הגנום וברור של גנים חיוניים רכש בס sanguinis באמצעות ההיא טכניקה 12 גם מרמזת אפשרות נמוכה של ההשפעה הקוטבית של קלטת אנטיביוטיקה במערכת. אנחנו הוכחנו גנים אחרים אמרגן פחות אנטיביוטי התנגדות, כגון גני התנגדות chloramphenicol אריתרומיצין, ויכול להיות מיושמים בטכניקה זו (מידע לא מוצג). בנוסף, טכניקה זו אינה זקוקה להתאבדות מארח פלסמיד ומשוחזר. בסך הכל, בטכניקה זו היא תפוקה גבוהה, כדי ליצור מבני מחיקת גנים ברחבי הגנום ויכול להיות קל לביצוע במוטציה של גן יחידה הגנום של חיידק.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
אין ניגודי האינטרסים הכריזו.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי מענקי R01DE018138 מהמכונים הלאומיים לבריאות (PX), ובחלקו, על ידי תכנית אוניברסיטת וירג'יניה הנשיאותית מחקר תמריץ (PRIP) 144602-3 (PX). אנו מודים לבני זוג. ליי חן, Yuetan Dou וXiaojing ואנג לסיוע בבנייה של מוטציות רחבות הגנום. אנו מודים גם למתקן ליבת ה-DNA באוניברסיטת וירג'יניה לרצפי DNA.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Primer F2 | Integrated DNA Technologies | TGACTAACTAGGAGGAATAAATG GCTAAAATGAGAATAT |
|
| Primer R2 | ibid | CATTATTCCCTCCAGGTACTAAAA CAATTCATCCAGT |
|
| Primer F2p | ibid | GATAAACCCAGCGAACCATTTGA | |
| Primer P1 | ibid | GCTTATATACCTTAGCAGGAGACA | |
| Primer P2 | ibid | GTATGACATTGCCTTCTGCGTCC | |
| Primer 5' end_R1_seq | ibid | GCCATTTATTCCTCCTAGTTAGTCA | |
| Primer 5' end_F3_seq | ibid | GTTTTAGTACCTGGAGGGAATAATG | |
| Primer 5' end_R1p_seq | ibid | CCTCAAATGGTTCGCTGGGTTTATC | |
| CSP | Synprep | Sequence:NH2-DLRGVPNPWGWIFGR-COOH | |
| DNA Polymerase | Invitrogen | 11304-102 | Platinum Taq DNA Polymerase High Fidelity |
| EcoRI | New England Biolabs Inc | R0101S | Restriction enzyme |
| Agar | American Bioanalytical | AB01185 | |
| Agarose | Promega | V3125 | |
| BHI | BD Biosciences | 237500 | Brain Heart Infusion |
| Horse serum | Fisher Scientific | SH3007403 | Horse serum |
| Km | Fisher Scientific | BP906-5 | Kanamycin |
| TH broth | BD Biosciences | 249240 | Todd Hewitt broth |
| PureLink 96 | Invitrogen | K310096 | PureLink 96 PCR purification kit |
| QIAquick | Qiagen | 28106 | QIAquick PCR purification kit |
| Filter | Corning | 431117 | 0.22 μm polystyrene filter |
| Anoxomat System | Mart Microbiology b.v. | Anoxomat Mark II | |
| Benchtop centrifuge | Thermo Scientific | 75004377 | Sorvall Legend RT Plus microplate rotor |
| Gel Documentation | UVP LLC | BioDoc-It 210 | |
| Incubator | Fisher Scientific | 11-690-625D | Isotemp |
| Labnet's Gel XL | Labnet | E0160 | Labnet's Gel XL |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 22621408 | Microcentrifuge 5415 R |
| Multichannel pipettes | Thermo Scientfic | 4661040, 4661020 | Finnpipette F1 |
| Thermal Cycler | Applied Biosystems Inc. | N805-0200 | GeneAmp PCR system 9700 |
References
- Sassetti, C. M., Boyd, D. H., Rubin, E. J. Genes required for mycobacterial growth defined by high density mutagenesis. Mol. Microbiol. 48, 77-84 (2003).
- Kobayashi, K., et al. Essential Bacillus subtilis genes. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 4678-4683 (2003).
- Trieu-Cuot, P., Courvalin, P. Nucleotide sequence of the Streptococcus faecalis plasmid gene encoding the 3'5"-aminoglycoside phosphotransferase type III. Gene. 23, 331-341 (1983).
- Paik, S., et al. Identification of virulence determinants for endocarditis in Streptococcus sanguinis by signature-tagged mutagenesis. Infect. Immun. 73, 6064-6074 (2005).
- Lukomski, S., et al. Nonpolar inactivation of the hypervariable streptococcal inhibitor of complement gene (sic) in serotype M1 Streptococcus pyogenes significantly decreases mouse mucosal colonization. Infect. Immun. 68, 535-542 (2000).
- Baba, T., et al. Construction of Escherichia coli K-12 in-frame, single-gene knockout mutants: the Keio collection. Mol. Syst. Biol. 2, (2006).
- de Berardinis, V. A complete collection of single-gene deletion mutants of Acinetobacter baylyi ADP1. Mol. Syst. Biol. 4, 174 (2008).
- Rodriguez, A. M., et al. Physiological and molecular characterization of genetic competence in Streptococcus sanguinis. Mol. Oral. Microbiol. 26, 99-116 (2011).
- Perry, D., Kuramitsu, H. K. Genetic transformation of Streptococcus mutans Infect. Immun. 32, 1295-1297 (1981).
- Pakula, R., Walczak, W. On the nature of competence of transformable streptococci. J. Gen. Microbiol. 31, 125-133 (1963).
- Datsenko, K. A., Wanner, B. L. One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 6640-6645 (2000).
- Xu, P., et al. Genome-wide essential gene identification in Streptococcus sanguinis. Sci. Rep. 1, (2011).
