Summary
Un efficiente genoma unico metodo di mutazione del gene è stata stabilita utilizzando
Abstract
Trasposone mutagenesi e singolo gene delezione sono due metodi applicati nel genoma knockout gene in 1,2 batteri. Sebbene mutagenesi trasposone è meno tempo, meno costosa, e non richiede informazioni genoma completata, vi sono due punti deboli in questo metodo: (1) la possibilità di un mutanti disparati nella libreria misto mutante che contro-seleziona mutanti con concorrenza diminuita; e (2) la possibilità di inattivazione genica parziale in cui i geni non interamente perdono la loro funzione dopo l'inserimento di un trasposone. Singolo gene delezione analisi può compensare gli svantaggi associati con mutagenesi trasposone. Per migliorare l'efficienza del genoma delezione singolo gene, si cerca di stabilire un high-throughput tecnica di genome-wide delezione del gene singolo utilizzando Streptococcus sanguinis come organismo modello. Ogni delezione del gene costruire in S. sanguinis genoma è progettata per comprendere 1-Kb a monte del gene target, l'APHA-3 gene, che codifica per proteine resistenza alla kanamicina, e 1-kb a valle del gene bersaglio. Tre serie di primer F1/R1, F2/R2 e F3/R3, rispettivamente, sono stati progettati e sintetizzati in un formato a 96 pozzetti per piastra PCR amplificazioni di questi tre componenti di ciascuna delezione costruire. Primer R1 e F3 contengono 25-bp sequenze che sono complementari alle regioni del gene-3 APHA a fine loro 5 '. Una grande scala di amplificazione PCR del gene-3 APHA viene eseguita una volta per tutte la creazione di un singolo gene costrutti di delezione. Il promotore del gene APHA-3 è inizialmente escluso per minimizzare il potenziale effetto polare di cassette kanamicina. Per creare i costrutti genici delezione, alta produttività amplificazione PCR e purificazione sono eseguite in un formato a 96 pozzetti piastra. Un lineare amplicone PCR ricombinante per ogni gene delezione sarà composta da quattro reazioni PCR utilizzando alta fedeltà DNA polimerasi. Il expon inizialefase di crescita preferenziale di S. sanguinis coltivati in brodo Todd Hewitt integrato con 2,5% siero di cavallo inattivato viene usato per aumentare la competenza per la trasformazione di PCR-costrutti ricombinanti. In questa condizione, fino al 20% di S. sanguinis cellule possono essere trasformate utilizzando ~ 50 ng di DNA. Sulla base di questo approccio, 2048 mutanti con singolo gene delezione sono stati infine ottenuti dai 2.270 geni in S. sanguinis esclusi quattro ORF del gene contenute interamente all'interno ORF altri S. sanguinis SK36 e 218 potenziali geni essenziali. La tecnica sulla creazione di costrutti di delezione del gene è un throughput elevato e potrebbe essere facile da usare in tutto il genoma gene delezioni singole per i batteri trasformabili.
Protocol
1. Primer design
- Primer sono progettati utilizzando script in casa in base alla S. sanguinis SK36 genoma sequenza. Tre serie di primer, F1/R1, F2/R2 e F3/R3 sono progettati per l'amplificazione del-1 kb di sequenza a monte del gene target, l'APHA-3 encoding gene per la resistenza alla kanamicina (Km r) e la proteina 3 1 -kb sequenza a valle del gene bersaglio, rispettivamente (Figura 1). Tra questi primer, F1 e R3 sono progettati utilizzando ePrimer3 nel EMBOSS insieme di programmi ( http://emboss.sourceforge.net/apps/cvs/emboss/apps/index.html ) per amplificare regioni fiancheggianti monte oa valle del target gene. Primer gene specifico, R1 e F3, sono progettati in base al 5 'e 3' sequenze del gene bersaglio. Primer R1 ed F3 contengono 25 coppie di basi sequenze adattatore alla fine il loro 5 'che sono complementari al APHA-3gene. Le temperature di fusione di ciascun primer sono stati progettati per essere il più vicino possibile a 60 ° C per consentire l'uso di una temperatura di ricottura uniforme per tutte le reazioni di PCR in formato a 96 pozzetti.
- F1, R1, R3 F3 e primer sono sintetizzati in piastre a 96 pozzetti basato su un ordine gene. Ciascuna piastra contiene un tipo di primer nell'ordine stesso gene. Diluire i primer in piastra a 96 pozzetti fondo lavorando ad una concentrazione finale di 10 pM per l'amplificazione PCR usando una pipetta multicanale.
2. High-throughput amplificazione PCR e purificazione
- Per amplificare elevato throughput 1-kb a monte oa valle del bersaglio S. geni sanguinis, assemblare una miscela cocktail PCR in ghiaccio in 15 ml tubo conico contenente 1640 microlitri DDH 2 O, 250 microlitri 10xHigh Fidelity PCR Buffer, 200 ml di miscela di mm 10 dNTP, 100 pl di 50 mM MgSO4, 100 pl di 10 ng / mL S. sanguinis SK36 DNA genomico e 10 microlitri Platinum Taq DNA polimerasirase alta fedeltà e trasferimento 23 microlitri della miscela in ciascun pozzetto di piastra a 96 pozzetti PCR usando una pipetta multicanale. Trasferire 1 ml di ciascuna F1 e R1 (o F3 e R3) da 10 pM di lavoro piastre di primer alla piastra PCR usando pipetta multicanale. Sigillare la piastra PCR ed eseguire amplificazione a 94 ° C per 1 min, e 30 cicli di 94 ° C per 30 sec, 54 ° C per 30 sec e 68 ° C per 1,5 min.
- Preparare 1% gel contenente bromuro di etidio con 48 carico multicanale raccordo pipetta pozzi. Miscelare 4 microlitri prodotto PCR con 1 ml di tampone di caricamento 5xDNA sulla piastra a 96 pozzetti e caricare i campioni su gel di agarosio utilizzando un 10-microlitri pipetta multicanale. Eseguire elettroforesi a 135 V per 30 minuti. Esaminare la banda su gel con documentazione UVP e sistema di analisi.
- Purificare il prodotto PCR da 96 PureLink kit di purificazione PCR utilizzando centrifugazione secondo le istruzioni del produttore. Per eluizione del DNA, aggiungere 40 microlitri sterile DDH 2 O al pozzo del binding piastra.
- Scegliere a caso diversi amplificati purificati sulla piastra di esaminare le concentrazioni di DNA mediante spettrofotometro NanoDrop. Regolare la concentrazione di ampliconi su piastra a ~ 10 ng / mL.
- Un plasmide contenente cassette chilometri r viene digerito con EcoR I come template PCR. Il plasmide digerito viene purificato per QIAquick kit di purificazione PCR e il DNA plasmide lineare viene regolata alla concentrazione finale di 10 ng di DNA / pl. Montare 25 miscela microlitri per amplicone km cassetta r compresi 16,4 microlitri DDH 2 O, 2,5 microlitri 10xHigh Fidelity PCR Buffer, 2 ml di miscela di mm 10 dNTP, 1 ml di 50 mM Mg SO 4, 1 ml di 10 pM F2, 1 ml di 10 pM R2, 1 ml DNA plasmidico lineare e 0,1 microlitri fedeltà Platinum Taq DNA polimerasi alta. Effettuare amplificazione PCR a 94 ° C per 1 min, e 30 cicli di 94 ° C per 30 sec, 55 ° C per 30 sec e 68 ° C per 1 min. Esaminare il prodotto di PCR mediante elettroforesi su gel di agarosio all'1%. Poola maggior parte della cassetta degli ampliconi km r da 10 individuali PCR purificato dal kit QIAquick purificazione PCR. Regolare la concentrazione amplicone a 10 ng / mL.
- Per ottenere il lineare finale amplicone PCR ricombinante, tre ampliconi PCR vengono combinati tra microlitri 1 (in quantità circa pari-molare) in una piastra PCR così come templato PCR. Altri componenti della PCR è aggiunto anche 14,4 microlitri DDH 2 O, 2,5 microlitri 10xHigh Fidelity PCR Buffer, 2 ml di miscela di mm 10 dNTP, 1 ml di 50 mM Mg SO 4, 1 ml di 10 mM F1, 1 ml di 10 microM R3, 0,1 microlitri Platinum Taq DNA polimerasi ad alta fedeltà. Amplificazione PCR viene eseguita a 94 ° C per 2 min, 30 cicli di 94 ° C per 30 sec a 55 ° C per 30 sec e 68 ° C per 3,5 min, ed infine 68 ° C per 4 min.
- Esaminare gli ampliconi della PCR su gel di agarosio. Purificare e quantificare gli ampliconi della PCR come descritto sopra. Congelare gli ampliconi della PCR ricombinati a -20 ° C.
3. Comcompetente Celle Preparazione
- Todd Hewitt Broth è preparato, pH regolato a 7,6 con NaOH 10 N, riscaldato a ebollizione e poi raffreddata a temperatura ambiente e sterilizzato usando polistirene 0,22 micron filtro 4. Aggiungere 300 microlitri inattivato al calore cavallo sieri (concentrazione finale di 2,5%) a 11,7 ml di brodo Todd Hewitt in 15 ml tubo conico per compensare TH + HS media. Aliquotare TH + HS medie in 2 ml e 10 ml in provette.
- Inoculare 5 l di brodo S. sanguinis SK36 congelati a -80 ° C in 2 ml di terreno TH + HS e incubare la coltura durante la notte con capping ermeticamente a 37 ° C, accompagnata da pre-incubando il 10 ml-TH + tubo HS.
- Dopo una notte, trasferire 50 microlitri cultura in 10 ml TH + HS e incubare la provetta a 37 ° C per 3 ore (corrispondente a OD 660 di 0,07-0,08), immediatamente utilizzando per la trasformazione.
4. Trasformazione cellulare e selezione antibiotica
- Aggiungere 2 ml di 70 ng S. sanguinis SK36 compeTence peptide stimolante (CSP) e 2 microlitri lineare amplicone PCR ricombinante (~ 50 ng) per provette Eppendorf a 96-well blocco e li pre-riscaldare a 37 ° C. Trasferire 330 ml di 3 ore-incubato SK36 cultura in ogni provetta. Incubare a 37 ° C per 1 ora. Sostituire il DNA con sterile DDH 2 O come controllo.
- Posizionare il blocco di ghiaccio e la diffusione 100 pl di ogni trasformazione in Brain Heart Infusion (BHI) piastra di agar con 500 mg / ml di kanamicina. Incubare le piastre a 37 ° C per 2 d in condizioni microaerobiche.
5. Conferma Mutant e stoccaggio
- Per ciascun mutante di sostituzione, casualmente prendere due singole colonie, inoculare la colonia in 5 ml BHI contenente 500 ug / ml di kanamicina e incubare l'inoculo microaerobically notte a 37 ° C. Crioconservare ciascuna cultura in 30% glicerolo a -80 ° C
- Per esaminare se il mutante contenente la sostituzione del gene previsto, eseguire colonia PCR per ciascun mutante con F1 e R3primer in piastra a 96 pozzetti PCR. Circa 1-microlitri dalla coltura durante la notte colonia individuale viene usato come stampo di DNA in 25 microlitri PCR-amplificazione reazione. PCR viene eseguita a 94 ° C per 5 min, 35 cicli di 94 ° C per 30 sec, 55 ° C per 30 sec e 68 ° C per 3,5 min, ed infine 68 ° C per 4 min.
- Per identificare con precisione a doppia banda mutanti o contaminante ampliconi PCR, esame della PCR mediante elettroforesi per 4 ore su> 12 cm al 2% su gel di agarosio con colorazione con etidio bromuro. In questa condizione elettroforesi su gel di agarosio, le ampliconi con ≥ 100 bp differenza sono stati chiaramente identificati. Quando le bande risultanti dalla amplificazione della cassetta r chilometri e di tipo selvatico gene sono anticipati per differire di <100 bp, viene utilizzato un primer T1 interna per determinare se un gene di tipo selvatico può essere rilevato mediante PCR.
- Ad ulteriore conferma l'eliminazione, gli ampliconi sono purificati da PureLink 96 kit di purificazione PCR e sequenziati utilizzando il primer P1 chesi lega alla cassetta r chilometri. Mantieni solo mutanti corrette confermate mediante sequenziamento.
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Representative Results
Dopo l'amplificazione PCR utilizzando primer F1 e R1, R3 e F3 e, di circa 1 kb a monte ea valle di ciascuna S. sanguinis gene sono stati ottenuti in formato a 96 pozzetti, rispettivamente (Figura 2A). Sotto le condizioni di PCR utilizzando primer disegnati e, un prodotto specifico è stato amplificato da S. sanguinis DNA genomico in ciascuna reazione PCR. Questo risultato indicato i primer erano altamente specifico per gli obiettivi di S. sanguinis. Tramite PCR re-amplificazione usando primers F1 e R3 e tre ampliconi come modelli di DNA, lineari costrutti ricombinanti PCR (~ 3 kb) sono stati high throughput creato sulla piastra a 96 pozzetti, composto da una regione a monte del gene bersaglio ciascuna, un kanamicina cassette, e una regione a valle di ciascun gene bersaglio in questo ordine (Figura 2B). I costrutti ricombinanti PCR sono stati quindi trasformati in S. sanguinis SK36 e selezionati da kanamicina sulla piastra di agar BHI. Per la maggior parte di trasfrmations, oltre 1000 colonie sono stati ottenuti su ciascuna piastra dopo un microaerobica 2 d-incubazione. Quando queste colonie erano PCR-amplificato usando F1 e R3, una singola banda di DNA corrispondente alla dimensione prevista mutante (~ 3 kb) è stato osservato mediante elettroforesi su gel (Figura 2C). Quando si tenta di eliminare potenziali geni essenziali, nessuna colonia potrebbe essere ottenuto nella maggioranza delle trasformazioni. Per l'eliminazione di alcuni geni essenziali, tuttavia, le colonie sono state ancora ottenute seguente trasformazione. Dopo l'amplificazione PCR di queste colonie utilizzando F1/R3, due bande di DNA corrispondente alla dimensione prevista mutante e il formato di tipo selvatico apparso come rivelato mediante elettroforesi su gel (Figura 2C). Per alcuni mutanti, la dimensione prevista mutante e la dimensione di tipo selvatico di ampliconi PCR erano troppo vicini per essere separati da lungo gel di agarosio. In questo caso, un T1 innesco interno è stato progettato sulla base della sequenza wild-type del gene. La PCR è stata eseguita utilizzando il primer interno T1 and F1 primer (Figura 2D). Wild-type SK36 è stato utilizzato come ceppo di controllo positivo per la PCR. Se una banda con la dimensione prevista è stato amplificato dal mutante utilizzando il primer interno, il gene è stato identificato come gene essenziale (doppia banda mutante) in quanto la presenza di cassette kanamicina nel mutante è stata confermata mediante sequenziamento del DNA precedentemente utilizzando il primer P1. Sulla base di questo protocollo, abbiamo finalmente raccolto 2048 non essenziali S. mutanti del gene sanguinis esclusi quei quattro ORF contenuti all'interno di altri ORF (Tabella 1). Sono stati identificati 218 geni che sono essenziali per S. sopravvivenza sanguinis nelle condizioni sperimentali.
| Classe | Open-frame di lettura (ORF) |
| Totale geni * | 2270 |
| Geni mirati | 2266 |
| Non essenziale (promoterless APHA-3) | 1973 |
| Non essenziale (promotore APHA-3) | 75 |
| Essenziale (no trasformante) | 60 |
| Essential (doppia banda) | 158 |
* Quattro ORF contenuti all'interno di altri ORF.
Tabella 1. S. sanguinis sintesi gene mutante.
Figura 1. Ricombinanti. PCR Tre set di primer (F1/R1, F2/R2 e F3/R3) sono progettati per amplificare la sequenza a monte, un gene di resistenza ai farmaci (Km r) e la sequenza a valle, rispettivamente. Entrambe le estremità 5 'di R1 e primer F3 contengono sequenze di complementary con la cassetta di un gene resistente agli antibiotici. Un prodotto finale di DNA PCR ricombinante contenente il marcatore antibiotico selezione fiancheggiato da S. DNA genomico sanguinis è prodotto utilizzando F1/R3. Il DNA ricombinante sarà integrato in S. genoma sanguinis via doppio cross-over ricombinazione.
Figura 2. Gel elettroforesi Rappresentante della PCR ampliconi su agarosio. A, 1-kb ampliconi di PCR a monte oa valle del target S. sanguinis geni. B, i DNA ricombinanti PCR composti a monte ed a valle dei geni bersaglio e promoterless APHA-3. Ampliconi C, colonia-PCR dalla trasformazione di S. sanguinis con PCR DNA ricombinante; bande doppie in corsia 4, 10, 14, 15, 20 e 24. D, amplificazione mediante PCR di colonie wild-type e mutanti usando i primer F1/T1, M,mutante; W, wild-type.
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Discussion
Per ridurre al minimo i possibili effetti polari della sostituzione di un gene esogeno gene mirata con antibiotici sui geni vicini, due passi vengono presi mentre innesco iniziale di progettazione. Per la maggior parte dei geni eliminati, il primer R1 e F3 sono progettati per eliminare la regione codificante da 6 bp dopo il codone di inizio di 30 bp prima del codone di stop. Gli ultimi 30 paia di basi sono conservati per proteggere potenziale sito di legame ribosomiale utilizzato dal gene adiacente valle. La regione trattenuto tra due geni vicini è esteso a 100 bp quando sono stati situati in orientamento opposto e gli N-terminali delle due proteine è vicino all'altro per evitare l'eliminazione di una regione promotore potenziale. Il promotore di APHA-3 gene è esclusa nel costrutto ricombinante per l'eliminazione del gene 5. Un sito di legame ribosomiale è introdotta nel gene-3 APHA per la traduzione. Per testare la nostra strategia, abbiamo costruito in modo casuale 10 e poi 96 mutanti di cambio alleliche. Noi obtained 10 e 93 mutanti, rispettivamente, su piastre di selezione kanamicina, suggerendo che il promotore-meno APHA-3 gene era espresso bene nella maggior parte dei casi. Abbiamo poi progettato e sintetizzato il primer per promotore-meno APHA-3 gene per tutti i gene delezioni del S. sanguinis genoma. Tuttavia, abbiamo trovato alcuni geni in S. sanguinis furono partire espresso o non espresso che probabilmente influenzare l'espressione del promoterless APHA-3 gene e quindi la selezione kanamicina. Per risolvere questo problema, il promotore del gene APHA-3 dal plasmide è stato introdotto nel cassetto r chilometri. Un grosso dell'amplicone promotore cassetta chilometri r è stata ottenuta da 10 individuali PCR utilizzando primer F2p/R2. Tranne che nuova R1 promotore R1P primers sono stati progettati per complemento con l'amplicon promotore cassetta chilometri r, tutti i passi da costruzione erano gli stessi di promotore-meno costruzione.
Per migliorare la efficiency di ricombinazione omologa, si seleziona lunghe (1 kb) sequenze fiancheggianti monte ea valle del S. sanguinis gene bersaglio nel rendere gene-costrutti di delezione. La dimensione sequenza fiancheggiante era limitata a 1 kb sulla base di due punti: (1) la lunghezza del frammento di DNA (~ 3 kb) permesso pronta amplificazione PCR del gene APHA-3 (~ 1 kb) più 2 kb di sequenze fiancheggianti usando alta fedeltà DNA polimerasi, e (2) la fattibilità di sequenziamento regioni fiancheggianti dal metodo ABI sequenziamento da entrambe le estremità (~ 1 kb). Elevato numero di trasformanti in più di S. gene delezioni sanguinis indicato 1 sequenze di kb a monte ea valle, rispettivamente, sono stati sufficienti a eliminazione diretta i geni bersaglio.
Per collegare il successo a monte ea valle del gene bersaglio con le due estremità di APHA-3 gene in amplificazione PCR ricombinante, primers R1, F2, F3 e R2 viene aggiunta alla loro estremità 5 'una sequenza extra che è complementare con il connette fine del lato in molti casi geni batterici delezione 6,7. Studi preliminari hanno mostrato che la sequenza più potrebbe essere ridotto a 25 bp per questo protocollo PCR ricombinante. In questo protocollo, abbiamo eliminato le sequenze dei primers supplementari F2 e R2 in APHA-3 gene e aggiunti 25-bp sequenza extra per l'estremità 5 R1 e F3 in monte ea valle del S. sanguinis gene target. Questo disegno diminuisce la lunghezza e la quantità di primer e quindi di ridurre i costi ed i tempi di PCR per migliorare l'efficienza del singolo gene delezione. Nel nostro laboratorio, questo disegno è stato dimostrato con successo per il gene delezioni in altri microbi, quali Streptococcus mutans e Streptococcus pneumoniae, e Porphyromonas gingivalis.
In questo protocollo, la specificità della PCR primer è critica. La temperatura di fusione innesco era elevata (> 58 ° C), la dimensione del fondo era lunga (> 21 bp), e l'innesco binding sito unico nel genoma di S. sanguinis. Questo design unico prodotto gene-specifici prodotti in quasi tutte le nostre amplificazioni PCR. Un singolo gene-specifico prodotto di amplificazione di PCR è critica per l'amplificazione PCR ultima. Altrimenti, l'amplificazione PCR finale che porta alla formazione del composto finale ricombinante di regioni a monte ea valle di ciascun gene e cassetta genica antibiotico, rispettivamente, sarebbe difficile.
Densità cellulare dipendenza di trasformazione è stata dimostrata in molti streptococchi come S. sanguinis 8, S. 9 e S. mutans pneumoniae 10. Quando densità cellulare di S. sanguinis raggiunto un OD 660 di 0,07-0,08 (corrispondente a ~ 5x10 6 CFU / ml) in mezzo TH + HS, la massima efficienza di trasformazione di S. sanguinis lineare con un amplicone PCR ricombinante è stata ottenuta e fino al 20% di S. sanguinis cellulepotrebbe essere trasformato. Dopo il completamento del genoma gene delezioni in S. sanguinis, abbiamo trovato che il numero dei trasformanti per l'eliminazione di alcuni geni non essenziali era bassa (~ 10). Non vi è dubbio che l'efficienza di trasformazione di batteri è importante per soddisfare tutte le delezioni del gene non essenziali nel genoma del gene ko.
Fatta eccezione per la creazione costrutto ricombinante mediante PCR, ci sono anche altre tecniche per inattivazione singolo gene. Per esempio, la creazione di suicidio plasmide è stato ampiamente applicabile per inattivare geni batterici su piccola scala. Tuttavia, questa tecnica non è stata utilizzata per genoma inattivazione gene perché grande creazione plasmide è molto lunga e laboriosa, e alcuni batteri devono essere create suicidio specifico plasmide. Sebbene marker-meno delezione del gene può evitare il possibile effetto polare del gene di resistenza agli antibiotici, tradizionale marker meno metodo di eliminazione gene è più tempo-consuming e difficili da inattivare un gene rispetto al metodo suicidio plasmide. In Escherichia coli, il genoma mark-meno gene delezioni sono stati ottenuti mediante sostituzione con gene di resistenza agli antibiotici e quindi l'eliminazione della cassetta resistenza 6. Tuttavia, questa E. coli ceppo richiede la ricombinasi fago λ Red. Prima di delezione del gene-trasformazione, la pKD46 helper Red plasmide deve essere introdotto in E. coli 11. Nella nostra tecnica, abbiamo eliminato il promotore di APHA-3 gene di resistenza nella stragrande maggioranza dei genici eliminati mutanti e progettato le due estremità del APHA-3 ORF a seguire la struttura espressione del gene-eliminato regione, per evitare la polare rilascio effetto della cassetta resistenza. Fino ad ora, non abbiamo trovato il problema polare effetto dopo aver esaminato la funzione di molti mutanti creati da questa tecnologia. Un insieme genoma e chiara di geni essenziali acquisite in S. sanguinis con th12 è tecnica implica anche la possibilità partire dell'effetto polare di cassette antibiotico nel sistema. Abbiamo dimostrato altre promotore-meno geni di resistenza agli antibiotici, come eritromicina e geni di resistenza al cloramfenicolo, potrebbero essere applicati in questa tecnica (dati non mostrati). Inoltre, questa tecnica non necessita ospitante suicidio plasmide e ricostruito. Nel complesso, questa tecnica è un throughput elevato per creare il genoma costrutti di delezione del gene e potrebbe essere facile da eseguire in tutto il genoma mutazione singolo gene di un batterio.
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Disclosures
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto dalle concessioni R01DE018138 dal National Institutes of Health (PX) e, in parte, dal Programma Virginia Commonwealth Research presidenziale Incentive University (PRIP) 144602-3 (PX). Ringraziamo Drs. Lei Chen, Yuetan Dou e Xiaojing Wang per l'assistenza con la costruzione di mutanti genoma di larghezza. Ringraziamo anche il Core Facility DNA della Virginia Commonwealth University per il sequenziamento del DNA.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Primer F2 | Integrated DNA Technologies | TGACTAACTAGGAGGAATAAATG GCTAAAATGAGAATAT |
|
| Primer R2 | ibid | CATTATTCCCTCCAGGTACTAAAA CAATTCATCCAGT |
|
| Primer F2p | ibid | GATAAACCCAGCGAACCATTTGA | |
| Primer P1 | ibid | GCTTATATACCTTAGCAGGAGACA | |
| Primer P2 | ibid | GTATGACATTGCCTTCTGCGTCC | |
| Primer 5' end_R1_seq | ibid | GCCATTTATTCCTCCTAGTTAGTCA | |
| Primer 5' end_F3_seq | ibid | GTTTTAGTACCTGGAGGGAATAATG | |
| Primer 5' end_R1p_seq | ibid | CCTCAAATGGTTCGCTGGGTTTATC | |
| CSP | Synprep | Sequence:NH2-DLRGVPNPWGWIFGR-COOH | |
| DNA Polymerase | Invitrogen | 11304-102 | Platinum Taq DNA Polymerase High Fidelity |
| EcoRI | New England Biolabs Inc | R0101S | Restriction enzyme |
| Agar | American Bioanalytical | AB01185 | |
| Agarose | Promega | V3125 | |
| BHI | BD Biosciences | 237500 | Brain Heart Infusion |
| Horse serum | Fisher Scientific | SH3007403 | Horse serum |
| Km | Fisher Scientific | BP906-5 | Kanamycin |
| TH broth | BD Biosciences | 249240 | Todd Hewitt broth |
| PureLink 96 | Invitrogen | K310096 | PureLink 96 PCR purification kit |
| QIAquick | Qiagen | 28106 | QIAquick PCR purification kit |
| Filter | Corning | 431117 | 0.22 μm polystyrene filter |
| Anoxomat System | Mart Microbiology b.v. | Anoxomat Mark II | |
| Benchtop centrifuge | Thermo Scientific | 75004377 | Sorvall Legend RT Plus microplate rotor |
| Gel Documentation | UVP LLC | BioDoc-It 210 | |
| Incubator | Fisher Scientific | 11-690-625D | Isotemp |
| Labnet's Gel XL | Labnet | E0160 | Labnet's Gel XL |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 22621408 | Microcentrifuge 5415 R |
| Multichannel pipettes | Thermo Scientfic | 4661040, 4661020 | Finnpipette F1 |
| Thermal Cycler | Applied Biosystems Inc. | N805-0200 | GeneAmp PCR system 9700 |
References
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