Summary
Verimli bir genom tek gen mutasyonu yöntemi kullanılarak oluşturulmuştur
Abstract
Transposon mutagenez ve tek gen delesyonu bakteriler 1,2 genom gen nakavt uygulanan iki yöntem vardır. Transposon mutagenesis, daha az zaman alan daha az maliyetli ve tamamlanmış genom bilgi gerekli değildir olmasına rağmen, bu yöntem iki zayıf vardır: azalma ile rekabet mutantlar karşı seçer ve bu karışık mutant kütüphanesi içinde bir farklı mutantların (1) olasılığı; ve (2) kısmi gen inaktivasyonu olasılığını sayede genlerin tamamen transposonun yerleştirilmesinin ardından kendi işlevini kaybetmek yok. Tek gen silme analizi transpozon mutasyon ile ilgili dezavantajları telafi edebilir. Genom tek gen delesyonu verimini artırmak için, bir model organizma olarak Streptococcus sanguinis kullanarak genom tek gen delesyonu için yüksek-throughput tekniği kurmaya çalışacaktır. Her gen delesyonu S. inşa sanguinis genom 1 ihtiva şekilde tasarlanmıştırHedefli gen, APHA-3 geni kodlayan, kanamisin e dirençli protein ve hedeflenen gen 1-kb akış aşağı-yukarı kb. Primerler F1/R1, F2/R2, ve F3/R3 üç set, sırasıyla tasarlanmış ve her bir silme, bu üç parçalarını inşa PCR büyütmesi için-96-kuyucuklu bir plaka biçiminde sentezlenir. Primerler, R1 ve F3 kendi 5 'ucunda APHA-3 gen bölgeleri için tamamlayıcı olan 25-bp sekanslar içerir. APHA-3 geninin büyük ölçekli bir PCR amplifikasyon tüm tek gen silme yapıları oluşturmak için bir kez gerçekleştirilir. APHA-3 geninin promotörü başlangıçta kanamisin kaseti potansiyel kutup etkisini en aza indirmek için dahil edilir. Gen silme yapıları oluşturmak için yüksek verimli, PCR saflaştırma 96 çukurlu bir levha formatında gerçekleştirilir. Her gen delesyonu için doğrusal bir rekombinant PCR amplikon yüksek sadakat DNA polimeraz kullanılarak dört PCR reaksiyonları aracılığıyla yapılacaktır. Ilk exponS. ential büyüme fazı % 2.5 inaktive at serumu PCR-rekombinant yapıların dönüşümü için yeteneklerini artırmak için kullanılan Todd Hewitt broth kültürü sanguinis desteklenmiştir. S. Bu koşul altında,% 20'ye kadar sanguinis hücrelerin DNA ~ 50 ng kullanılarak dönüştürülebilir. Bu yaklaşıma göre, tek gen silinmesi ile 2.048 nihai mutant S. 2.270 genler elde edildi dört gen ORF hariç sanguinis S. başka ORF tamamen kaplayabilir sanguinis SK36 ve 218 potansiyel elzem genler. Gen delesyonu yapıları oluşturma konusunda teknik, yüksek verim ve herhangi bir dönüştürülebilir bakteri genomu tek gen delesyonlar kullanımı kolay olabilir.
Protocol
1. Primer Tasarım
- Astarlar S. dayalı ev komut kullanılarak tasarlanmıştır sanguinis SK36 genom dizisi. Primerler, F1/R1, F2/R2, ve F3/R3 üç set hedef gen, APHA-3 kodlaması, kanamisin e dirençli gen (Km r) protein 3 ve 1 1-kb yukarısında sekans amplifikasyonu için tasarlanmış sırasıyla, hedef gen, bir-kb aşağı sekansı (Şekil 1). Bu primerler arasında, F1 ve R3 programları EMBOSS paketi (içinde ePrimer3 kullanılarak tasarlanmıştır http://emboss.sourceforge.net/apps/cvs/emboss/apps/index.html hedefin yukarı veya aşağı komşu bölgeleri yükseltmek için) Gen. Gene özgü primerler, R1 ve F3, 5 've 3' dizileri hedef genin bağlı olarak tasarlanmıştır. R1 ve F3 primerler APHA-3 tamamlayıcı olan kendi 5 'ucunda 25 bp'lik adaptör dizisi içerenGen. Her bir primerin erime sıcaklığına yakın olan bir ila 60 ° C 96-gözlü formata bütün PCR reaksiyonları için tavlama sıcaklık üniform bir kullanımını sağlamaktır. Olacak şekilde tasarlanmıştır
- F1, R1, F3 ve R3, primerler bir gen sırasına göre 96 oyuklu levhalar içinde sentezlendi. Her bir plaka, aynı gen için primerlerin bir türünü içerir. Çok kanallı bir pipet kullanılarak PCR amplifikasyonu için 10 uM'lik bir son konsantrasyon 96-kuyu çalışma astar levha içinde primerler seyreltilir.
2. Yüksek throughput PCR Amplifikasyon ve Saflaştırılması
- High-throughput yükseltmek için 1-kb yukarısında veya hedef S. mansap sanguinis genler, 1640 ul GKD 2 O, 250 ul 10xHigh Fidelity PCR Tamponu, 10 mM dNTP karışımı 200 ul, 50 mM 100 ul MgSO4, 100 ul ihtiva eden bir 15-ml konik bir tüp içinde buz üzerinde bir PCR kokteyl karışım birleştirmek 10 ul / ng S. sanguinis SK36 genomik DNA ve 10 ul Platin Taq DNA polymerase yüksek sadakat ve transferi çok kanallı pipet kullanarak 96-PCR plaka üzerinde her kuyuya karışımı 23 ul. Kanallı bir pipet kullanılarak PCR plaka için astar plakalar çalışan 10 uM her F1 ve R1, (ya da F3 ve R3 taban düzenekleri) 1 ul aktarın. PCR plate Mühür ve 1.5 dk 30 sn ve 68 ° C 30 sn 1 dk ve 94 ° C 30 döngü, 54 ° C için 94 ° C'de amplifikasyon gerçekleştirin.
- % 1 agaroz jel 48 kuyu montaj kanallı pipet yükleme ile etidyum bromür içeren hazırlayın. 96-plaka üzerine 5xDNA yükleme tamponu 1 ul 4 ul PCR ürünü karıştırın ve 10-ul kanallı pipet kullanarak agaroz jel üzerinde örnekleri yükleyebilirsiniz. 30 dakika için 135 V elektroforez çalıştırın. UVP dokümantasyon ve analiz sistemi altında jel üzerinde bant inceleyin.
- Üreticinin talimatlarına göre santrifüj kullanılarak PureLink 96 PCR saflaştırma kiti ile PCR ürünleri arındırın. DNA salınımlı için, b kuyuya 40 ul steril GKD 2 O ekleyinplaka inding.
- Rasgele Nanodrop spektrofotometre kullanılarak DNA konsantrasyonları incelemek için plaka üzerinde birçok saflaştırılmış amplikonlarının almak. Plaka üzerinde amplikonlarının konsantrasyon ayarlama için ~ ul / 10 ng.
- Bir plazmid içeren Km r kaset PCR şablon olarak EcoR ben kullanılarak sindirilir. Sindirilen plazmid QIAquick PCR saflaştırma kiti ile arındırıldı ve doğrusal plazmid DNA son DNA konsantrasyonu 10 ng / ml 'den ayarlanır. SO 16.4 ul GKD 2 O, 2.5 ul 10xHigh Fidelity PCR Tamponu, 10 mM dNTP karışımı 2 ul 50 mM Mg 1 ul içeren Km r kaset amplikon için 25 ul karışım birleştirin 4, 10 uM, F2, 1 ul 1 ul 10 uM R2, 1 ul doğrusal plazmid DNA ve 0.1 ul Platin Taq DNA polimeraz yüksek aslına uygunluk. ° C 1 dakika, 30 saniye ve 68 saniye için 30 için 1 dakika, ve 94 ° C'de 30 döngü, 55 ° C de 94 ° C 'de PCR amplifikasyon gerçekleştirin. % 1 agaroz jel elektroforezi ile PCR ürünü inceleyin. PooQIAquick PCR saflaştırma kiti ile 10 ayrı PCR saflaştırılmış gelen Km r kaset Amplikon la toplu. 10 ng / ul Amplikon konsantrasyonunu ayarlayın.
- Son lineer rekombinant PCR amplikon elde etmek için, üç PCR amplikonlarının de PCR şablon olarak bir PCR plate her 1 ul (yaklaşık eşit molar miktarlarda) ile birleştirilir. Diğer bileşenler PCR SO 14.4 ul GKD 2 O, 2.5 ul 10xHigh Fidelity PCR Tamponu, 10 mM dNTP karışımı 2 ul 50 mM Mg 1 ul da dahil olmak üzere eklenir 4, 10 uM F1 1 ul, 10 uM, R3 1 ul, 0.1 ul Platinum Taq DNA polimeraz yüksek sadakat. PCR amplifikasyon 4 dk için 3.5 dakika ve son olarak da 68 ° C 30 sn için ve 68 ° C, 30 saniye 55 ° C, 2 dakika, 94 ° C'de 30 döngü için 94 ° C sıcaklıkta gerçekleştirilir.
- Agaroz jel üzerinde PCR amplikonlar inceleyin. Arındırmak ve yukarıda tarif edildiği gibi PCR amplikonlar ölçülmesine imkan verirler. -20 ° C'de rekombine PCR amplikonlarının dondurun
3. Competent Hücreler Hazırlık
- Todd Hewitt et suyu hazır hale getirilir, oda sıcaklığına kadar soğutuldu ve 0.22 um filtre polistiren 4 kullanarak sterilize sonra kaynamaya kadar ısıtıldı ve 10 N NaOH kullanılarak 7.6 pH değeri ayarlanmış. TH + HS orta telafi etmek için 15 ml konik tüp içinde 11.7 ml Todd Hewitt suyuna 300 ul ısı inaktive at serumu (% 2.5 final konsantrasyon) ekleyin. Tablet TH + HS orta 2 ml ve tüpler 10 ml içine.
- Stokta S. 5 ul inoküle sanguinis SK36 2 ml TH + HS ortama -80 ° C'de dondurulmuş ve 37 sıkıca kapatma ile gecede kültür inkübe 10 ml-TH + HS tüp pre-kuluçkaya eşliğinde ° C,.
- Gece boyunca sonra, 10 ml TH + HS içine 50 ul kültür aktarmak ve 3 saat (0,07-0,08 OD 660 tekabül eder), 37 ° C de inkübe tüp, hemen dönüşüm için kullanarak.
4. Hücre Dönüşüm ve Antibiyotik Seçimi
- 70 ng S. 2 ul ekleyin sanguinis SK36 yetsistans uyarıcı peptid (CSP) ve 37 blok 96-iyi ve onları ön ısıtma üzerine Eppendorf tüplerine 2 ul doğrusal rekombinant PCR amplikon (~ 50 ng) ° C Her tüpe 3 sa-inkübatöre SK36 kültürün 330 ul aktarın. 1 saat boyunca 37 ° C'de inkübe edin. Kontrol olarak steril GKD 2 O ile DNA değiştirin.
- Buz bloğu yerleştirin ve 500 mg / ml kanamisin beyin kalp infüzyon (BHI) agar plaka üzerinde her dönüşümün 100 ul yayıldı. Mikroaerobik koşullar altında 2 d, 37 ° C de inkübe plakaları.
5. Mutant Onay ve Depolama
- Her yedek mutant için, rastgele, 2 ayrı koloniler pick up 5 ml BHI 500 mg / ml kanamisin içeren haline koloni aşılamak ve 37 microaerobically gecede inokulum inkübe ° C -80% 30 gliserol, her kültür Cryopreserve ° C
- Beklenen gen replasman içeren mutant, koloni her mutant kullanarak F1 için PCR ve R3 gerçekleştirmek olmadığını incelemek için96-kuyulu plakalı olarak PCR primerleri. Tek koloni ila yaklaşık 1 ul gece boyunca kültür 25 ul PCR amplifikasyon reaksiyonu içinde şablon DNA olarak kullanılmıştır. PCR ° C'de 3.5 dakika ve son olarak da 68 ° C'de 4 dakika için 30 saniye ve 68 için 30 saniye, 55 ° C'de 5 dakika, 94 ° C'de 35 döngü için 94 ° C sıcaklıkta gerçekleştirilir.
- Tam çift bant mutantlar veya kirletici PCR amplikon tanımlamak için, etidyum bromid boyama ile> 12 cm uzunluğunda% 2'lik agaroz jel üzerinde 4 saat elektroforez ile PCR amplikon inceleyin. Bu agaroz jel elektroforez koşulu altında, ≥ 100 bp farkı ile herhangi amplikonlarının açıkça belirlenmiştir. Km r kaset amplifikasyon ve vahşi türdeki kaynaklanan bantları bir iç T1 astar vahşi tip geni PCR ile tespit edilebilir olup olmadığını belirlemek için kullanılır <100 bp, göre farklı beklenen zaman.
- İlave Silme işlemini onaylamak için, amplikonlarının PureLink 96 PCR saflaştırma kiti ile saflaştırılmış ve hangi P1 astar kullanılarak dizilerekKm r kaseti bağlanır. Sekanslama tarafından onaylandıktan sadece doğru mutantlar tutun.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Sonra PCR primerleri, F1 ve R1 kullanılarak amplifikasyon, ve F3 ve R3'ün her biri S. yaklaşık 1 kb yukan ve aşağı sanguinis gen 96-gözlü formata, sırasıyla (Şekil 2A) halinde elde edildi. Bizim PCR koşulları ve kullanılarak tasarlanmış primerler altında, belirli bir ürün S. amplifiye edildi Her bir PCR reaksiyonu içinde sanguinis genomik DNA. Bu sonuç primerlerin S. hedeflerine çok özel olduğunu göstermiştir sanguinis. PCR ile F1 ve R3 primerleri ve DNA şablonları, lineer rekombinant PCR yapıları (~ 3 kb) gibi üç amplikonlarının kullanarak yeniden amplifikasyon high-throughput her hedef gen, bir kanamisin upstream bir bölgede oluşan 96-plaka üzerinde oluşturulan kaset, ve bu düzen (Şekil 2B) olarak her bir hedef genin bir aşağı bölge. Rekombinant PCR yapıları ardından S. dönüştürüldü sanguinis SK36 ve BHI agar plaka üzerinde kanamisin tarafından seçilir. Transfo çoğunluğu içinrmations, 1000 koloniler üzerine bir mikroaerobik 2 d-inkübasyonu takiben her plaka üzerinde elde edilmiştir. Bu koloniler yaşındayken F1 ve R3, beklenen mutant boyutu (~ 3 kb) jel elektroforezi (Şekil 2C) tarafından gözlenmiştir karşılık tek bir DNA bandı kullanılarak PCR-amplifiye. Potansiyel elzem genler silmeye çalışırken, hiçbir koloniler dönüşümlerin çoğunluk elde edilebilir. Bazı elzem genlerine silinmesi için, ancak, yine de koloni aşağıdaki dönüşüm elde edilmiştir. F1/R3 kullanarak bu koloni PCR amplifikasyon sonra, beklenen mutant boyutuna karşı gelen ve vahşi tip boyutu, iki DNA bantları gibi jel elektroforezi (Şekil 2C) ortaya çıktı. Bazı mutantlar için beklenen mutant boyutu ve PCR amplikon ve wild tip boyutu çok uzun agaroz jel ayrılmalıdır yakın vardı. Bu durumda, bir iç astar T1, yabani-tip gen sekansı dayalı olarak tasarlanmıştır. PCR primeri, bir iç T1 kullanılarak gerçekleştirildind F1 astar (Şekil 2B). Yabani tip SK36 Bu PCR için pozitif bir kontrol suşu olarak kullanılmıştır. Beklenen boyutu olan bir bant iç astar kullanarak mutasyona uğramış amplifiye edilmiş ise, gen P1 primer kullanılarak DNA sekanslama yöntemiyle teyit edildi önceden mutant kanamisin kaseti varlığında beri elzem geni (çift bant mutant) olarak tespit edilmiştir. Bu protokole istinaden, biz sonunda 2048 non-esansiyel S. toplanan Diğer ORF (Tablo 1) tamamen içinde bulunan bu dört ORF hariç sanguinis geni mutantlar. Biz S. için gerekli olan 218 gen deneysel koşullar altında sanguinis hayatta.
| Sınıf | Open-okuma çerçeveleri (ORF) |
| Toplam genler * | 2270 |
| Hedeflenen gen | 2266 |
| Gereksiz (APHA-3 promotorsuz) | 1973 |
| Gereksiz (promotor APHA-3) | 75 |
| Esansiyel (hiçbir transformant) | 60 |
| Esansiyel (çift-bant) | 158 |
Diğer ORF tamamen kaplayabilir * Dört ORF.
Tablo 1. S. sanguinis geni mutant özeti.
Şekil 1. Primerlerin rekombinant PCR. Üç set (F1/R1, F2/R2 ve F3/R3) sırasıyla yukarı akış dizisi, bir ilaç dirençli gen (Km r) ve akış aşağı sıra, yükseltmek için tasarlanmıştır. R1 ve F3 primerler 5 'her iki ucu dizilerinin eş ihtivabir antibiyotik dirençli gen kaseti ile mplementary. Antibiyotik seçim işaretleyici ihtiva eden bir nihai ürün PCR rekombinant DNA S. ile çevrili sanguinis genomik DNA F1/R3 kullanılarak üretilir. Rekombinant DNA S. entegre edilecek double cross-over rekombinasyon yoluyla sanguinis genom.
Şekil 2. Agaroz jel PCR amplikonlarının Temsilcisi jel elektroforezi. Yukan ya da hedef alt-S. A, 1-kb PCR amplikonlar sanguinis genler. B, akış yukarı ve akış aşağı hedef genlerin ve Promotörsüz APHA-3 oluşan PCR rekombinant DNA. S. dönüşümü C, koloni-PCR amplikonlar PCR rekombinant DNA ile sanguinis; şeritli 4, 10, 14, 15, 20 ve 24 de çift bant. D, primerler F1/T1 kullanarak yabani tip ve mutant kolonilerin PCR; M,mutant; W, vahşi tip.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
İlk astar tasarımı sırasında komşu genler üzerinde dışsal antibiyotik gen ile bir hedef genin değiştirilmesi mümkün polar etkilerini en aza indirmek için, iki adım alınır. Silinen genlerin çoğu için, primerler R1 ve F3 önce stop kodonu ile 30 bp için başlangıç kodonu takip eden 6 bp gelen kodlama bölgesindeki silmek için tasarlanmıştır. Son 30 baz çifti bitişik aşağı gen tarafından kullanılan potansiyel ribozomal bağlanma yeri korumak için korunur. Iki komşu genler arasındaki muhafaza bölge onlar zıt yönlerde bulunan edildiğinde 100 bp uzatıldı hem proteinlerin N-termini potansiyel promotor bölgeyi silmeden engellemek için birbirine yakındır. APHA-3 geninin promotor gen delesyonu 5 için rekombinant yapı hariç tutulmuştur. Bir ribozom bağlanma yeri çeviri için APHA-3 gen içine verilir. Bizim strateji test etmek için, biz rastgele ardından 96 allelik döviz mutantlar 10 inşa. Biz opromotör-az APHA-3 gen çoğu durumda iyi ifade olduğunu düşündüren, kanamisin seçimi plakaları üzerinde sırasıyla 10 ve 93 mutantlar, btained. Biz sonra tasarlanmış ve S. tüm gen delesyonlar için yükseltici-az APHA-3 gen için astar sentezlenmiş sanguinis genom. Ancak, S. bazı genler bulundu sanguinis düşük ifade ya da muhtemelen Promotörsüz APHA-3 gen ve dolayısıyla kanamisin seçimi ifade önemli ölçüde etkileyen ifade edilmemiştir. Bu sorunu, plazmid gelen APHA-3 geninin promotor çözmek için Km r kaset girmiştir. Promotörü Km r kaset amplikon bir yığın F2p/R2 primerler kullanılarak 10 ayrı PCR elde edilmiştir. Yeni R1 organizatörü primerler R1P organizatörü Km r kaset Amplikon komplemanter için tasarlanmış hariç, diğer tüm inşaat adımları promotör-az inşaat için aynı idi.
Efficienc geliştirmek içinhomolog rekombinasyon y, biz S. upstream ve downstream uzun (1 kb) sınırdaş dizileri seçin gen delesyon yapıları yapımında sanguinis hedef gen. Komşu dizi büyüklüğü iki nokta bazında 1 kb ile sınırlandırılmıştır: (1) DNA fragmanı uzunluk (~ 3 kb) hazır PCR APHA-3 gen (~ 1 kb) arasında amplifikasyon artı kullanarak kanat dizileri 2 kb kabulü yüksek sadakat DNA polimeraz ve (2) her iki uçta (~ 1 kb) den ABI dizileme yöntemi ile komşu bölgeleri sıralanması fizibilite. S. çoğu içinde transformantlar yüksek sayılar sanguinis gen silme hedef gen nakavt için yeterli olan, sırasıyla, 1 kb yukan ve aşağı sekansları belirlenmiştir.
Başarılı yukan ve rekombinan PCR amplifikasyon primerler, R1, F2, F3 ve R2 de APHA-3 geninin iki ucu ile hedef genin kendi alt-5 'de eklenir bağlamak için bağl ile tamamlayıcı olan bir ilave sekans biterBirçok bakteri geni delesyon durumlarda 6,7 diğer tarafı sonuna ecting. Ön çalışmalar ekstra dizisi bu rekombinant PCR protokol için 25 bp indirgenmiş olabileceğini gösterdi. Bu protokol, APHA-3 geninin primerleri F2 ve R2 ilave dizileri ortadan kaldırılacak ve içinde R1 ve F3 5'-ucu ile 25-bp ilave sekans ilave yukan ve aşağı S. sanguinis hedef geni. Bu tasarım primerlerin uzunluğuna ve miktarını azaltmak ve dolayısıyla tek gen delesyon verimliliğini artırmak için maliyet ve PCR kez azaltacaktır. Laboratuvarımızda, bu tasarım da başarılı gibi Streptococcus mutans ve Streptococcus pneumoniae ve Porphyromonas gingivalis gibi diğer mikroplar gen delesyonlar olduğu ortaya konmuştur.
Bu protokol, PCR primerleri özgüllüğünü önemlidir. Astar erime sıcaklığı (> 58 ° C) yüksek, astar boyutu (> 21 bp) uzundu ve astar binding sitesi S. genomunun benzersiz oldu sanguinis. Bu tasarım bizim PCR büyütmesi yaklaşık her tek gen-spesifik ürünler üretilmektedir. PCR amplifikasyon tek bir gen özel ürün son PCR amplifikasyonu için kritik önem taşır. Aksi takdirde, nihai PCR amplifikasyon her bir genin üst ve alt bölgelere ve antibiyotik gen kasetinin nihai rekombinant oluşan oluşumu ile sonuçlanır, sırasıyla, zor olur.
Dönüşümün Hücre yoğunluğu bağımlılık örneğin S. olarak çok streptokok ortaya konmuştur sanguinis 8, S. mutans 9 ve S. pneumoniae 10. S. zaman hücre yoğunluğu sanguinis TH içinde (~ 5x10 6 CFU / ml 'ye tekabül eden) 0,07-0,08 bir OD 660 ulaşan + HS, orta, S.' nin en yüksek transformasyon verimi doğrusal bir rekombinant PCR amplikon ile sanguinis elde ve S.% 20'ye varan edildi sanguinis hücrelerintransforme edilebilir. S. genom gen delesyonlar tamamlanmasından sonra sanguinis, bazı gerekli olmayan gen silinmesi için transformantlar sayısı (~ 10) düşük olduğu bulunmuştur. Bakterilerin yüksek dönüşüm verimliliği genom gen Knockouts gerekli olmayan gen delesyonlar yerine getirmeyi önemli olduğunu hiç şüphe yoktur.
PCR ile rekombinant yapı oluşturma dışında, tek gen inaktivasyonu için diğer teknikler de vardır. Örneğin, intihar plazmid oluşturulması olmuştur yaygın küçük ölçekte bakteriyel genlerin inaktive için geçerlidir. Büyük ölçekli plazmid oluşturulması çok zaman alıcı ve zahmetli bir iştir, ve bazı bakterilerin belirli bir intihar plazmid oluşturulması gerekir, çünkü Ancak, bu teknik genom tek gen inaktivasyonu için kullanılan olmamıştır. Işaretleyici-az gen delesyonu antibiyotik direnç geni olası polar etkisini önlemek olsa da, geleneksel marker az gen delesyonu yöntem zaman-con dahaİntihar plazmid yönteminden daha geni inaktive tüketen ve zor. Escherichia coli olarak, genom-mark-az gen delesyonlar antibiyotik direnç geni ve daha sonra direnç kaset 6 giderilmesi ile değiştirme yoluyla elde edilmiştir. Bununla birlikte, bu E. coli suşu faj λ Kırmızı Rekombinaz gerektirir. Gen-silme dönüşümü önce, Kızıl yardımcı plazmid pKD46 E. girmiş olmalıdır coli 11. Bu teknik olarak, ORF,-silinen gen bölgesi ifade yapısını takip etmek kutup önlemek için gen silinmiş mutantlarının büyük bir çoğunluğunda APHA-3 direnç geninin promoteri ortadan kalkar ve APHA-3-iki ucu tasarlanmış direnç kasedi etkisi sorunu. Şimdiye kadar, biz bu teknolojinin yarattığı birçok mutantlar fonksiyonu inceledikten sonra kutup etkisi sorunu bulamadı. S. edinilen elzem genlerine bir genom ve net seti inci kullanarak sanguinisteknik 12 aynı zamanda sistem içinde antibiyotik kasetinin kutup etkisi düşük olasılık ima edilmektedir. Biz eritromisin ve kloramfenikol direnç genleri gibi diğer destekleyici-az antibiyotik direnç genleri, bu tekniğin (veriler gösterilmemiştir) uygulanabileceğini göstermiştir. Buna ek olarak, bu tekniğin intihar plazmid ve yeniden taşıyıcıya ihtiyaç duymuyor. Genel olarak, bu tekniğin genom gen delesyonu yapılar oluşturmak için ve bir bakterinin genomu tek gen mutasyonu gerçekleştirmek için kolay olabilir yüksek akış olduğunu.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
Bu çalışma, Virginia Commonwealth Üniversitesi Başkanlık Araştırma Teşvik Programı (PRIP) 144602-3 (PX) tarafından, Sağlık (PX) Ulusal Enstitüleri ile hibe R01DE018138 tarafından kısmen desteklenmiştir. Biz Dr teşekkür ederim. Lei Chen, genom çapında mutantların inşaatı ile yardım için Yuetan Dou ve Wang Xiaojing. Biz de DNA dizi için Virginia Commonwealth Üniversitesi'nde DNA Çekirdek Tesis ederim.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Primer F2 | Integrated DNA Technologies | TGACTAACTAGGAGGAATAAATG GCTAAAATGAGAATAT |
|
| Primer R2 | ibid | CATTATTCCCTCCAGGTACTAAAA CAATTCATCCAGT |
|
| Primer F2p | ibid | GATAAACCCAGCGAACCATTTGA | |
| Primer P1 | ibid | GCTTATATACCTTAGCAGGAGACA | |
| Primer P2 | ibid | GTATGACATTGCCTTCTGCGTCC | |
| Primer 5' end_R1_seq | ibid | GCCATTTATTCCTCCTAGTTAGTCA | |
| Primer 5' end_F3_seq | ibid | GTTTTAGTACCTGGAGGGAATAATG | |
| Primer 5' end_R1p_seq | ibid | CCTCAAATGGTTCGCTGGGTTTATC | |
| CSP | Synprep | Sequence:NH2-DLRGVPNPWGWIFGR-COOH | |
| DNA Polymerase | Invitrogen | 11304-102 | Platinum Taq DNA Polymerase High Fidelity |
| EcoRI | New England Biolabs Inc | R0101S | Restriction enzyme |
| Agar | American Bioanalytical | AB01185 | |
| Agarose | Promega | V3125 | |
| BHI | BD Biosciences | 237500 | Brain Heart Infusion |
| Horse serum | Fisher Scientific | SH3007403 | Horse serum |
| Km | Fisher Scientific | BP906-5 | Kanamycin |
| TH broth | BD Biosciences | 249240 | Todd Hewitt broth |
| PureLink 96 | Invitrogen | K310096 | PureLink 96 PCR purification kit |
| QIAquick | Qiagen | 28106 | QIAquick PCR purification kit |
| Filter | Corning | 431117 | 0.22 μm polystyrene filter |
| Anoxomat System | Mart Microbiology b.v. | Anoxomat Mark II | |
| Benchtop centrifuge | Thermo Scientific | 75004377 | Sorvall Legend RT Plus microplate rotor |
| Gel Documentation | UVP LLC | BioDoc-It 210 | |
| Incubator | Fisher Scientific | 11-690-625D | Isotemp |
| Labnet's Gel XL | Labnet | E0160 | Labnet's Gel XL |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 22621408 | Microcentrifuge 5415 R |
| Multichannel pipettes | Thermo Scientfic | 4661040, 4661020 | Finnpipette F1 |
| Thermal Cycler | Applied Biosystems Inc. | N805-0200 | GeneAmp PCR system 9700 |
References
- Sassetti, C. M., Boyd, D. H., Rubin, E. J. Genes required for mycobacterial growth defined by high density mutagenesis. Mol. Microbiol. 48, 77-84 (2003).
- Kobayashi, K., et al. Essential Bacillus subtilis genes. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 4678-4683 (2003).
- Trieu-Cuot, P., Courvalin, P. Nucleotide sequence of the Streptococcus faecalis plasmid gene encoding the 3'5"-aminoglycoside phosphotransferase type III. Gene. 23, 331-341 (1983).
- Paik, S., et al. Identification of virulence determinants for endocarditis in Streptococcus sanguinis by signature-tagged mutagenesis. Infect. Immun. 73, 6064-6074 (2005).
- Lukomski, S., et al. Nonpolar inactivation of the hypervariable streptococcal inhibitor of complement gene (sic) in serotype M1 Streptococcus pyogenes significantly decreases mouse mucosal colonization. Infect. Immun. 68, 535-542 (2000).
- Baba, T., et al. Construction of Escherichia coli K-12 in-frame, single-gene knockout mutants: the Keio collection. Mol. Syst. Biol. 2, (2006).
- de Berardinis, V. A complete collection of single-gene deletion mutants of Acinetobacter baylyi ADP1. Mol. Syst. Biol. 4, 174 (2008).
- Rodriguez, A. M., et al. Physiological and molecular characterization of genetic competence in Streptococcus sanguinis. Mol. Oral. Microbiol. 26, 99-116 (2011).
- Perry, D., Kuramitsu, H. K. Genetic transformation of Streptococcus mutans Infect. Immun. 32, 1295-1297 (1981).
- Pakula, R., Walczak, W. On the nature of competence of transformable streptococci. J. Gen. Microbiol. 31, 125-133 (1963).
- Datsenko, K. A., Wanner, B. L. One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 6640-6645 (2000).
- Xu, P., et al. Genome-wide essential gene identification in Streptococcus sanguinis. Sci. Rep. 1, (2011).
