Summary
このプロトコルでは、W eは心房性不整脈に貢献したマウスとヒトの心の中に（また、心臓メラノサイトとも呼ばれます）メラニン細胞様細胞の新規な集団を同定したマウスでトリガします。
Abstract
私たちは、マウスでの心房性不整脈のトリガーに貢献し、マウスおよびヒトの心の中に（また、心臓メラノサイトとも呼ばれます）メラニン細胞様細胞の新規集団を同定した。心臓のメラノサイトの電気的および生物学的特性を調査するために私たちは、新生児マウスの心筋細胞を単離するために設計されたものに由来するマウスの心臓からそれらを分離するための手順を開発しました。より広範なパッチクランプまたは生化学的研究に適して健康的な心臓メラノサイトを得るために、私たちは、もともと皮膚のメラニン細胞を単離するために設計されたものに基づいて心臓のメラノサイトを分離し、メッキする洗練された手順を開発しました。洗練された手順は、このレビューで実証し、純粋な集団として、または心筋細胞でメッキすることができる健康的なメラニン細胞様細胞のより大きな数字を生成する。
Introduction
私たちは最近、メラニン合成酵素を発現するマウスとヒトの中心部に新たな細胞集団を同定し、形態学的に皮膚のメラノサイトに似ている。当社は、これらの細胞の心臓メラノサイト」と呼ばれ、彼らは心房性不整脈が頻繁に人間に由来トリガするの解剖学的位置に存在しているが見つかりました。また、心臓のメラノサイトは、DCTの生殖細胞欠失を有するマウスでは心房性不整脈に貢献した。心臓のメラノサイトは、まばらにそれらが全ての心房細胞の0.1％未満を含み、マウスの心房全体に分散されている。心臓のメラノサイトの電気的および生物学的特性を調査するために、私たちは、Cre誘導性メラノサイト特異的マーカーを用いて、マウスの心臓からそれらを分離するための手順を開発しました。当初の手順は、新生児マウスの心筋細胞を単離するために使用されるものから開発され、パッチクランプ記録またはPCR分析に適した少数細胞を得た。しかし、癒すを改善する目と心臓のメラノサイトの生存率は、より詳細な電気生理学的解析や生化学的研究のために、私たちは皮膚のメラニン細胞を単離するために設計されたものから洗練された手順を開発しました。このレビューに記載され、実証された手順は、純粋な集団として、または心筋細胞でメッキすることができる健康な心臓のメラノサイトを生成するという利点を有している。
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Protocol
必要なソリューションと機器の準備1。
- まず、15分のためにそれらをオートクレーブで手術器具（ストレート形状鉗子、湾曲した形状の鉗子、ストレート形状のはさみ、湾曲形状はさみ）を殺菌する。 121℃。組織をミンチに使用される1組の心と他のセットを解剖するために使用されている楽器、2セットを準備します。
- 滅菌濾過し、水900mlでMCDB153培養培地の1パケットを溶解し、粉末が溶解するまでゆっくり撹拌する。溶解するまで調製し、撹拌している培地の最終容量1リットルのために、[w / vの7.5％] 1.2グラムの重炭酸ナトリウム、または重炭酸ナトリウム溶液15.7 mlを加え。その後、組織培養フード（バイオセーフティキャビネット）において無菌条件下で0.2μmのボトルトップフィルターを介してメディアを注ぐ、1N HClまたは1N NaOHのいずれかを追加することによって、7.2にpHを調整する。その後、メディアを収集し、4℃で保管してください。
- サプリメントへの準備を培養培地（材料リスト）に追加する。サプリメントは、メディアが細胞をプレーティングするために必要とされる直前に培地に添加されるべきである。
- 10％FBSを加えた抗生物質（ペニシリンおよびストレプトマイシン）とのDPBSを準備します。
- DPBSを加えた抗生物質（ペニシリンおよびストレプトマイシン）100mlに、次に、トリプシン、0.25gの（USBウシ膵臓、活性> 2,500 USP単位/ mg、超高純度）を添加することによって0.25％トリプシン溶液を調製。
- この手順を完了するために必要なその他の必要な機器は、実体顕微鏡、ペトリ皿（10センチ）、50 mlのコニカルチューブ、40μmのセルストレーナー、DPBSを加えた抗生物質、60 mmの培養皿および35mmの培養皿が含まれています。
新生児マウスの仔から2分離ハーツ
- まず、P2新生仔マウスにP0を取得した（n = 6〜8）。 EYFP対立遺伝子またはZ / EGアレルラベルを付ける：R26Rどちらが探しこれは、ヘテロ接合性である雄とDCT-Creをホモ接合の雌の繁殖によって生成された子犬の使用をお勧めしますメラノサイト様細胞。両R26R：EYFPおよびZ / EGマウスは、ジャクソン·ラボラトリーズ（それぞれ株式数006148と003920）から入手可能である。
- 次に、新生児仔マウスを安楽死させるアルコール綿で胸を拭く、次にDPBSで10センチのペトリ皿に子犬を置く。
- 滅菌ピンセットとはさみで胸と胸骨の上に皮膚をカットした後、実体顕微鏡下で慎重に胸を開きます。新生児仔マウスの心は非常に小さいので、添付の心房と心臓全体を削除してくださいするように注意してください。
- DPBSで心を洗い、新しい10cmのペトリ皿に移す。
3酵素消化
- 組織培養フード（バイオセーフティキャビネット）に切除した心でペトリ皿を持参してからフード内で無菌技術を使用して以下の手順に従ってください。
- まず、無菌DPBSプラス抗生物質に心を3回洗浄する。
- でた（n = 6-8）の心を置きます60 mmの培養皿と皿に0.5％トリプシン溶液6-8 mLを加え。
- 次に、（サイズが1ミリメートル未満の）小片に心を切断し、5％CO 2雰囲気中で30分間37℃でそれらをインキュベートする。
- インキュベーション期間が完了した後、滅菌50 mlコニカルチューブに心臓組織と皿からトリプシンの得られた溶液を注ぐ。
- その後、すぐにかつ慎重に、10 mlの滅菌ピペットを用いて、50mlのコニカルチューブ内で30〜50回のソリューションを粉砕する。
- ろ液を収集するために、新しい、清潔な50mlのコニカルチューブの上に40μmのセルストレーナーを通して得られた溶液をろ過する。
- 次に、室温で5分間卓上遠心機で240×gで50 mlチューブを遠心する。その後、静かに上清を吸引し、滅菌DPBS 6-8中で残ったペレットを懸濁します。このステップをさらに2回繰り返します。このステップは、心房筋細胞や心臓のメラノサイトをペレットが、第がダウンすることはありません線維芽細胞からの芽細胞は小さく、上清中に残ります。
4。メッキ心臓メラノサイト様細胞
- 遠心分離後の第3のすすぎに続いて、慎重にドレインまたは吸引洗浄溶液（DPBS）オフやサプリメントが追加された先のMCDB培地6mlにペレットを再懸濁します。
- さて、無菌トランスファーピペットに再懸濁させた溶液を描き、35 mmディッシュ中で、あるいは6ウェルプレートのウェル中の細胞を置き、1 35-mmディッシュに3新生児マウスから単離された心臓細胞をプールかよく。
- 、5％CO 2雰囲気下で37℃で一晩皿をインキュベートあらゆる付着していない細胞と一緒に培養培地をオフに吸引した後、DPBSで一度プレートをすすぐ。その後、プレートに新鮮な培地を追加し、2日ごとにメディアを交換。細胞は成体聞くから単離され、一方、新生児または胚の心臓から単離された細胞は、最大で3週間培養物中に維持することができるtsが最大10日間培養物中に維持することができる。
5。成体マウス心臓から心臓メラノサイト様細胞を単離する
- まず、マウスにヘパリン100 Uの腹腔内に投与し、それらを安楽死させた後（3-4週齢、n = 3）の成熟したマウスから心を取り除くミッドライン胸骨切開を通して。それは、この手順のためにマウスを安楽死させるために、ペントバルビタールの使用をお勧めしますが、この薬は、すべての場所では使用できません。
- 次に、組織培養フード（バイオセーフティキャビネット）中の抗生物質を含む滅菌DPBS中に切除心を洗う。そこから残りの血液を除去した後、DPBSでもう一度心をすすぐために湾曲した解剖用鉗子で少し心を絞る。
- 心臓から心房と房室弁輪を取り外します（これらの構造はメラニン細胞様細胞が含まれている）、および35-mmディッシュで切除した組織標本を置く。
- 湾曲したハサミと力を用いて小片に心をカットpsの、その後皿に0.5％トリプシン溶液6-8 mLを加え。その後、45〜60分間37℃で料理をインキュベートする。
- さて、以降のステップ3.6から始まる上記の手順から手順に従ってください。
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Representative Results
この資料に記載されたプロトコルは、私たちが以前にマウスの心臓から心臓メラノサイトを分離するために公開1と比較して改善された手法である。この手順では、心臓のメラニン細胞様細胞を標識するためにメラニン合成酵素特異的にCre-リコンビナーゼにより駆動される蛍光マーカーの使用を採用する。新たに単離された胚性または新生児の細胞を扱うとき心房筋細胞から心臓のメラノサイトを区別する形態学的な違いは、まだ発症していないので、それは、（ 図1A）、心臓メラノサイトにラベルを付けるために、マーカーを使用することが重要です。 図1Aに示すように、単離工程がうまくいった場合には、心房筋細胞および心臓メラノサイトのかなり大きな数はわずか非接着細胞とラミニンコートディッシュに付着する。この場合、接着細胞をシャーレ（黄色矢頭図1A、矢印）の底に平らに表示されます。一方、時procedureがうまく動作しない細胞のほとんどは、非付着性となり、多くの場合、球状のを見て、（水色矢印、 図1A）切り上げ。
単離された細胞は、緑色蛍光イメージングを用いて可視化されると、それは心臓のメラニン細胞であり、細胞は、心房筋細胞（ 図1）がどの細胞が明らかである。プロトコル（ステップ3.9）で上記のように、線維芽細胞は、より大きな心房筋細胞や心臓のメラノサイトをペレットが、より小さい心臓線維芽細胞がダウンすることはありません低力遠心分離を用いて分離された心房細胞のプールから削除されます。新たに単離した細胞は、今や単一細胞電気生理学的記録（ 図2）、単一細胞RNA分析または生化学的ア ッセイのために使用することができる。
また、培養があり、最大21日間、このプロトコルを使用して、孤立した新生児または胚性心房細胞を維持した。これに記載された培養条件を用いて心房筋細胞を皿から切り離し、これらが分離された後、2〜3日以内に死亡する傾向があるプロトコルは、心臓のメラニン細胞様細胞はさらに、分化して増殖する。 図3Aに示さそれらは新生児マウスの心臓から単離した5日後に、健康な心臓のメラノサイトである。 （ 図1に示す単離されたばかりの細胞とは対照的に）、これらの細胞の周りのいずれかの心房筋細胞の欠如に注意してください。加えて、これらの心臓のメラノサイトは、広範な樹状突起を開発し、密接にも同じ日数（ 図3B）培養されてきた皮膚のメラニン細胞に似ている。
図1に代表的な（A）およびDIC（B）を新たにiのGFPの画像胚（E19.5）DCT-Z / EGマウス子犬から心房細胞をゾル化。白い矢印は、両方のパネルにおける心臓メラノサイトを識別します。蛍光マーカーの助けを借りずに、心臓のメラニン細胞を識別し、ディッシュに結合心房筋細胞（黄色矢印）と区別することが困難であることに注意してください。水色の矢印はウェルディッシュに接続されていない、心房細胞を指す。
図2。DCTは- / -心臓メラノサイト、長期活動電位持続時間を示しています。 （A）心臓Dctを+/-と、（B）は、心臓Dctをからの電流クランプ記録- / -細胞は、DCTの非存在下では増加した活動電位持続時間を示しています。 - / - 細胞の静止電位を持ってDCTをしながらDctを+/-細胞の静止電位は、-62 mVです-60 mVの。レビンらから、許可を得て、再生される。 J. CLIN。投資。119、2920年から2936年（2009）。
図3に 、単離された（A）の代表的な画像心臓メラニン細胞様細胞および（B）皮膚メラノサイト。メラニン細胞は、それぞれ、心および新生児マウス（P1）の皮膚から単離し、5日間培養した。
図4 DCT-発現細胞は心臓を移植。 E13.5マウスの心臓のin situハイブリダイゼーション （A）は Dctを発現を示す肺静脈OS（オープン矢印）の周り（塗りつぶし矢印）。肺静脈内のDCT-陽性細胞（矢印）の（B）免疫蛍光染色。 E16.5マウスDCT-LacZのハート（矢印）の後部心房のDCT-陽性細胞の（C）は、X-gal染色。卵円孔、冠状静脈洞OSと下大静脈の地域では、RA中隔に沿ってE17.5 DCT-LacZのマウスの心臓における（D）X-gal染色;差し込みスケール= 500程度である。 DctCre +/-とR26Rマウスを交配から生じる（E）成体マウス（P60）は、肺静脈と左心房内のLacZ陽性細胞（矢印）を示しています。免疫蛍光染色によって検出された（F）DCT-陽性細胞（矢印）外科的に除去人間の肺静脈の内皮上。パネル（F;スケール=50μm）を、パネル（スケール=100μmのBとD）以外のスケールすべてのパネルにある= 500程度である。略語：PV、肺静脈; LA、左心房;青、大動脈; PA、パルモNARY動脈; RA、右心房; IVC、下大静脈; FO、卵円孔; CS、冠状静脈洞。レビンらから、許可を得て、再生される。 J. CLIN。投資 。119、2920年から2936年（2009）。
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Discussion
心臓メラノサイトは、一般的に心房性不整脈のトリガーを引き起こす心臓内の解剖学的位置に存在している。これらの領域は、肺静脈、房室弁輪、後部左心房と卵円孔（ 図4）が挙げられる。これらの細胞は不整脈原性に果たす役割を理解するために、私たちはそれらを分離し、その生理機能を研究するための技術を開発する。しかし、心臓のメラノサイトの健康でより大量に生成するこの技術の改善は、外因性の刺激に対する心臓のメラニン細胞の応答を調べるためにさらなる研究を可能にするであろうことを認識した。さらに、改良された単離技術はまた、正常な生理機能および疾患の間の心房筋細胞と心筋メラニン細胞の相互作用を調査するための研究を可能にすることができる。
本稿では、ISOLように設計されたプロトコルから開発されたマウスの心臓から実行可能なメラニン細胞様細胞を単離するための手順を説明します皮膚からメラノサイトを食べた。このプロトコルにおける重要なステップは、心臓からメラニン細胞様細胞を抽出している。新生児心臓から心臓メラノサイトを分離することは比較的簡単ですが、成熟した心臓から心臓メラノサイトを抽出することははるかに困難に起因間質性線維症の増加量にある。このプロトコルでは、成熟した心臓からメラニン細胞様細胞を抽出するために、トリプシン消化を使用した。このプロトコルを開発するために、私たちは、トリプシン、コラゲナーゼ、ディスパーゼさまざまな濃度のから成って、いくつかの異なる酵素の組み合わせをテストした。
私たちは、トリプシンによる（今後15分間）、その後（最初の30分間）コラゲナーゼの組み合わせで新生児心房の治療は、最初はメラノサイト様細胞のより高い収率を生じたことを見つけましたが、単離された細胞は生存能力が低下したあまり健康であった。一方、トリプシンでの消化は、単独で、Mから健康的なメラニン細胞様細胞の適度な数を生産atureのマウス心臓。そのため、私たちは成熟したマウスの心臓からのメラニン細胞様細胞を単離するために、トリプシンの使用をお勧めします。さらに、当社は積極的に成熟したマウス心臓のトリプシン消化後に生成スラリーを粉砕することは実行可能なメラニン細胞様細胞の収率を改善することを発見した。私たちは、トリプシンが部分的に膜チャネルまたは電荷キャリアを消化する可能性があることを言及する必要があり、パッチクランプ試験を行うとき、これはチャネル密度に影響を与え得る。私たちは、トリプシン消化は、単離された、成熟したメラノサイト様細胞の電流密度に影響を与えるかどうかを判断するために厳密な分析を実施していないが、私たちはこのプロトコルを使用して行った研究での電流や活動電位に重大な影響を気づいていない。
心臓メラニン細胞様細胞は、形態学的に、皮膚のメラノサイト（ 図1および図3を<似ている心臓（全ての心房細胞の0.1％未満）で非常にまばらな細胞集団である/強い>）。事実のための心に存在する比較的少数の心臓メラノサイトがあります。最近まで、私たちは、単一細胞アッセイ（ すなわちパッチクランプ記録または単一細胞PCR）のためにそれらを使用することができた。しかし、20-30、新生児、または5-8成熟心をプールすることにより、心臓メラノサイトより多量を取得し、この方法は、免疫ブロットまたは生化学的アッセイを実施するための組織の十分な量を生産発見した。さらに、彼らは私たちはしばしば円形の15〜20ミリメートルを配置します隔離された後、これらの細胞の収率を改善するために、マウスの心臓におけるメラニン細胞様細胞の数が少ないことを考えると、テフロン滅菌真空グリースを使用した35-mmディッシュに挿入されます。次いで、細胞をプレーティング面積を小さくするインサート内に配置され、それらの密度を増加させることができる。テフロン（登録商標）を使用すると、それらの単離以下のメラニン細胞様細胞の生存率を改善し、並びにめっき期間中にも挿入する。
いくつかの心臓メラノCYTE様細胞は、私たちがこれらの細胞の分化度の低い状態を表すと信じて隔離、次の双極形態を有する。さらには、単離後3日間心臓メラノサイトを培養する細胞は樹状突起を形成し始めるメラノサイト様表現型のさらなる分化を誘導すると思われることを見出した。また、このプロトコルは、培養中の最大10日間維持することができる成熟した心臓からメラニン細胞様細胞を生じる発見した。しかし、成熟した心臓から単離された培養メラノサイト様細胞では10日を超えて増殖して停止し、老化になることがあります。単離およびメッキ心臓メラノサイトは、外因性の要因に彼らの生理学的応答を評価するために、そのようなRNAプロファイリングまたは研究として、セルラ電気生理学的解析または他の分子/細胞の生物学的分析のために使用することができる。
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Disclosures
私たちは、開示することは何もない。
Acknowledgments
VVPMDLに健康賞R01 HL105734の国立研究所によってサポートされていましたこの作品は、部分的には、ヘルスリサーチのキャリア賞K08 HL094748の国立研究所によって、サポートされています。 VVPは、付与11IRG900384でサポートされている米国心臓協会の革新的な研究である。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MCDB 153 | Sigma-Aldrich | M7403 | Dissolve in water |
| DPBS, no calcium no magnesium | Invitrogen | 14190136 | Stock conc.: 1x Working conc.: 1x |
| Penicillin-streptomycin | Invitrogen | 15140163 | Stock conc.: 100x Working conc.: 1x |
| Fetal Bovine Serum | Life Technology | Certified | Working conc.: 4% |
| TPA | Sigma-Aldrich | P1585 | Dissolve in DMSO Stock conc.: 3.2 μM Working conc.: 32 nM |
| Transferrin | Sigma-Aldrich | T8158 | Dissolve in DPBS Stock conc.: 0.1 mg/ml Working conc.: 1 μg/ml |
| Dibutyryl cyclic AMP | Sigma-Aldrich | D0627 | Dissolve in DPBS Stock conc.: 0.5 mM Working conc.: 5 μM |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I6634 | Dissolve in 10 mM acetic acid Stock conc.: 1 mg/ml Working conc.: 5 μg/ml |
| Basic FGF | BD Biosciences | 354060 | Dissolve in water Stock conc.: 4 ng/μl Working conc.: 4 ng/ml |
References
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